免疫反应规程

免疫反应规程一、免疫反应规程概述

免疫反应规程是指在生物体识别并应对外来抗原（如病原体、异物）时，通过免疫系统一系列精确、有序的机制进行防御和调节的过程。本规程旨在提供一套标准化的操作步骤和注意事项，以确保免疫反应的准确性和有效性。以下是免疫反应规程的主要内容和实施要点。

二、免疫反应的基本流程

（一）抗原识别与处理

1.抗原摄入：免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）通过吞噬、吞饮或受体介导的方式摄取抗原。

2.抗原呈递：抗原被处理成小肽，并与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，呈递给T细胞。

（二）T细胞活化

1.初始T细胞识别：CD4+辅助T细胞识别由MHC-II类分子呈递的抗原肽，CD8+细胞毒性T细胞识别由MHC-I类分子呈递的抗原肽。

2.共刺激信号：B7家族分子（如CD80/CD86）与T细胞CD28分子的结合提供必要的共刺激信号。

3.细胞因子诱导：IL-1、IL-6等细胞因子促进T细胞增殖和分化。

（三）B细胞活化与抗体产生

1.抗原结合：B细胞表面抗体（BCR）与特异性抗原结合。

2.T细胞辅助：CD4+辅助T细胞通过细胞接触和细胞因子（如IL-4、IL-5）支持B细胞增殖和分化。

3.抗体分泌：浆细胞产生并分泌大量特异性抗体，中和或清除抗原。

（四）免疫记忆形成

1.记忆细胞分化：部分活化的T细胞和B细胞分化为长期存活的记忆细胞。

2.快速响应：再次接触相同抗原时，记忆细胞能迅速启动更强的免疫应答。

三、免疫反应规程的实施要点

（一）实验室操作步骤

1.样本采集：无菌条件下采集血液、组织等样本，避免污染。

2.抗原处理：采用酶解、裂解等方法提取和纯化抗原，确保活性。

3.细胞培养：在含10%FBS的RPMI-1640培养基中培养免疫细胞，37℃、5%CO₂条件下孵育。

4.免疫检测：通过流式细胞术、ELISA等方法定量分析细胞因子、抗体水平。

（二）质量控制与安全措施

1.试剂验证：使用高纯度抗体和细胞因子，定期检测效价。

2.无菌控制：所有操作需在超净工作台进行，避免微生物污染。

3.废物处理：实验废弃物按生物安全规定分类处理。

（三）注意事项

1.样本保存：低温保存（如-80℃）以维持抗原活性。

2.细胞毒性评估：定期检测细胞活力，防止过度激活导致细胞凋亡。

3.结果解读：结合临床背景分析免疫应答强度，避免误判。

四、免疫反应规程的应用场景

（一）疾病诊断

（二）疫苗研发

评估候选疫苗的免疫原性，优化抗原设计。

（三）免疫治疗

监测治疗过程中的免疫应答变化，调整用药方案。

本规程为免疫反应的基本操作指南，具体实验设计需根据实际需求调整参数和方法。

**一、免疫反应规程概述**

免疫反应规程是指在生物体识别并应对外来抗原（如病原体、异物）时，通过免疫系统一系列精确、有序的机制进行防御和调节的过程。本规程旨在提供一套标准化的操作步骤和注意事项，以确保免疫反应的准确性和有效性。以下是免疫反应规程的主要内容和实施要点。本规程适用于基础免疫学研究、生物制品（如疫苗、抗体）研发及质量控制等场景，重点关注体外实验中的免疫细胞活化、增殖、分化和效应功能检测等环节。

**二、免疫反应的基本流程**

（一）抗原识别与处理

1.抗原摄入：免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）通过多种机制摄取外源抗原。

(1)**吞噬作用**：大颗粒抗原（如细菌、细胞碎片）被巨噬细胞表面的吞噬小体包裹并内部化。

(2)**吞饮作用**：小分子抗原或溶液通过细胞膜内陷形成吞饮小泡被摄入。

(3)**受体介导的内吞**：特定抗原通过与细胞表面特异性受体（如补体受体CR3、清道夫受体）结合后被内吞。

2.抗原处理：摄入的抗原在细胞内被降解为小分子肽段。

(1)**溶酶体降解**：吞噬体与溶酶体融合，利用其中的酸性环境和多种水解酶（如蛋白酶、核酸酶）分解抗原。

(2)**蛋白酶体加工**：MHC-I类分子途径中，抗原肽在蛋白酶体中生成；MHC-II类分子途径中，内体中的抗原被蛋白酶体处理。

3.抗原呈递：处理后的抗原肽被装载到MHC分子上，表达于细胞表面供T细胞识别。

(1)**MHC-I类分子呈递**：内源性抗原肽（如病毒蛋白）被蛋白酶体加工后，与TAP转运体进入内质网，与MHC-I类分子结合并表达于几乎所有有核细胞表面，供CD8+T细胞识别。

(2)**MHC-II类分子呈递**：外源性抗原肽在细胞内体/溶酶体中加工后，与MHC-II类分子在细胞内质网组装，主要表达于抗原呈递细胞（APC，如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞）表面，供CD4+T细胞识别。

（二）T细胞活化

1.初始T细胞识别：T细胞受体（TCR）特异性识别MHC分子呈递的抗原肽。

(1)**亲和力要求**：TCR与MHC-抗原肽复合物的结合需达到一定的亲和力阈值才能启动信号。

(2)**MHC限制性**：TCR只能识别由自身MHC分子呈递的抗原肽。

2.共刺激信号：除了TCR识别，T细胞活化的第二信号（共刺激信号）至关重要。

(1)**B7-CD28通路**：APC表面的CD80/CD86与T细胞表面的CD28结合，提供关键的共刺激信号，激活MAPK和NF-κB等信号通路，促进T细胞增殖和分化的起始。

(2)**其他共刺激分子**：如CD40-CD40L、ICOS-ICOSL等也参与T细胞活化过程。

3.细胞因子诱导：APC或其他细胞分泌的细胞因子提供第三信号，决定T细胞的分化方向。

(1)**丝裂原刺激**：在缺乏特定抗原和共刺激时，可通过植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）等丝裂原刺激T细胞增殖，但通常不产生功能性细胞因子或记忆细胞。

(2)**抗原特异性刺激**：在抗原和共刺激存在时：

(a)**辅助T细胞（Th）分化**：根据细胞因子微环境（如IL-12促进Th1，IL-4促进Th2）和APC类型，分化为Th1、Th2、Th17、Tfh等亚型。

(b)**细胞毒性T细胞（Tc）分化**：CD8+T细胞在IL-2等细胞因子支持下增殖并分化为效应Tc细胞。

（三）B细胞活化与抗体产生

1.抗原结合：B细胞表面的B细胞受体（BCR，即膜结合型IgM/IgD）特异性识别和结合游离抗原或结合在靶细胞表面的抗原。

(1)**补体依赖性**：某些抗原通过激活补体系统（如C3b）被B细胞捕获。

(2)**交叉链接**：多个BCR同时结合相邻的抗原分子，形成交叉链接，提高信号效率。

2.T细胞辅助：大多数体液免疫需要CD4+辅助T细胞（Th）的帮助。

(1)**直接接触**：活化的Th细胞与B细胞通过共刺激分子（如CD40-CD40L）和细胞因子受体/配体（如CTLA-4/CD80）发生直接接触。

(2)**细胞因子作用**：活化的Th细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-21等细胞因子，促进B细胞增殖、分类分化（如Ig类别转换）和抗体分泌。

3.抗体分泌：活化的B细胞分化为浆细胞，大量产生并分泌特异性抗体。

(1)**终末分化**：B细胞在细胞因子和BCR信号驱动下，经历增殖、终末分化，失去增殖能力，成为合成和分泌抗体的工厂。

(2)**抗体类别转换**：在Th细胞因子作用下，B细胞可合成不同类型的抗体（如IgG、IgA、IgE），分别执行中和、黏膜免疫、过敏反应等功能。

(3)**高亲和力成熟**：B细胞在骨髓中经历亲和力成熟过程，通过V(D)J重排和体细胞超突变，产生亲和力更高的抗体。

（四）免疫记忆形成

1.记忆细胞分化：部分活化的T细胞和B细胞在特定信号（如IL-7、IL-15）和转录因子（如Bcl-6、Tox）作用下，分化为长期存活的记忆细胞。

(1)**记忆T细胞（Tmem,Tcm）**：通常在初次免疫后较早出现，具有快速增殖和效应功能，但稳定性稍差。

(2)**效应记忆T细胞（Tem）**：在感染局部发挥快速效应功能。

(3)**记忆B细胞（Bmem）**：具有长寿和快速分化为浆细胞的能力，是再次应答的主要贡献者。

2.快速响应：记忆细胞具有更高的激活阈值，但一旦被再次激活，能迅速增殖、分化并产生大量效应分子，提供比初次应答更强、更快的保护。

**三、免疫反应规程的实施要点**

（一）实验室操作步骤

1.**样本采集与处理**：

(1)**细胞分离**：使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法或磁珠分选技术从血液或组织匀浆中分离外周血单个核细胞（PBMC）、巨噬细胞、树突状细胞等。

(2)**细胞计数与活力检测**：使用血细胞计数板或流式细胞术计数细胞数量，通过台盼蓝染色法或活死染色法评估细胞活力，通常要求活力>95%。

2.**抗原制备与处理**：

(1)**抗原来源**：可使用纯化蛋白、重组蛋白、多肽、病毒样颗粒、灭活/减毒病原体等。

(2)**抗原纯化**：通过SDS、层析等方法纯化抗原，测定浓度（如使用BCA试剂盒）和纯度（如使用SDS）。

(3)**抗原处理**：根据所需免疫通路，选择合适的方法处理抗原：

-**未处理抗原**：用于检测TCR/BCR直接识别。

-**热灭活**：适用于病毒抗原，需确保灭活完全。

-**蛋白酶消化**：模拟抗原在APC内的处理过程，制备多肽。

3.**细胞活化与培养**：

(1)**初始T细胞活化**：将CD4+或CD8+T细胞与等量（如1×10^5cells/mL）的APC（如树突状细胞）在含10%FBS的RPMI-1640培养基中，加入特定浓度（如0.1-1.0µg/mL）的蛋白抗原或肽段，共培养5-7天。

(2)**B细胞活化**：将B细胞与活化的CD4+Th细胞（细胞比例通常为1:5-1:10）或直接用抗CD40抗体（如10-50µg/mL）和IL-4（如10ng/mL）在培养皿中共培养3-5天。

(3)**细胞因子刺激**：为研究特定细胞因子反应，可在培养体系中加入预致敏的丝裂原（如PHA1-10µg/mL）或特定细胞因子（如IL-210-100U/mL）。

4.**免疫检测**：

(1)**增殖检测**：使用3H-TdR掺入法（需闪烁计数器）或CFSE分群流式细胞术检测细胞增殖。

(2)**细胞因子检测**：

-**ELISA**：检测培养上清或细胞裂解物中的细胞因子浓度（如IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10等），需制备标准曲线。

-**流式细胞术（Cytometry)**：通过PE/Cy7标记的抗细胞因子抗体，直接检测细胞表面表达或细胞内胞吞的细胞因子。

(3)**细胞分型与功能检测**：

-**流式细胞术**：使用PE,APC,PerCP-Cy5.5,FITC等荧光标记抗体检测细胞表面标志物（如CD4,CD8,CD25,CD69,CD27,CD45RA,CD45RO,CD40,CD80），区分不同T/B细胞亚群。

-**胞内染色**：使用FixablePermeabilizingSolution（如eBiosciencePerFix-PermKit）使细胞通透，再用抗体检测胞内转录因子（如FoxP3,TBET,GATA3）或细胞因子。

-**ELISPOT**：检测单个细胞分泌的少量细胞因子。

（二）质量控制与安全措施

1.**试剂验证**：

(1)**抗体质量**：选择具有高特异性（低非特异性结合）和亲和力的商业抗体，查阅文献或进行WesternBlot验证。

(2)**细胞因子标准品**：使用经过认证的标准品校准ELISA等检测方法。

(3)**培养基与血清**：使用无菌、无热原的细胞培养基和经过辐照或过滤除菌的血清。

2.**无菌控制**：

(1)**操作环境**：所有细胞培养操作应在生物安全柜中进行。

(2)**耗材灭菌**：所有接触细胞和培养液的耗材（培养皿、移液管、吸头等）必须高压蒸汽灭菌或使用无菌过滤器除菌。

(3)**无菌监测**：定期对培养箱、生物安全柜进行菌落计数，培养液和细胞悬液可进行培养或直接涂布平板检测。

3.**实验对照**：

(1)**阴性对照**：无抗原/丝裂原刺激的细胞培养基对照，用于检测背景信号。

(2)**阳性对照**：已知能产生特定效应的细胞（如活化Th细胞）或标准品刺激的细胞，用于确认检测方法有效。

(3)**空白对照**：不加细胞或加细胞培养基，用于检测非特异性结合。

4.**废物处理**：所有含有细胞、培养基或潜在生物污染的废弃物，均需按生物安全规定进行高压灭菌或化学处理后方可丢弃。

（三）注意事项

1.**抗原剂量优化**：不同抗原的最适刺激浓度范围可能不同，需预先进行预实验确定。

2.**细胞密度**：T细胞与APC、Th细胞与B细胞的共培养比例对结果有显著影响，需根据具体细胞类型和实验目的优化。

3.**培养时间**：不同细胞事件（如分裂、分化、因子分泌）的发生时间不同，需根据研究目标设定合适的培养时间。

4.**温度与CO₂**：细胞培养需在37℃、5%CO₂的湿润环境中进行。

5.**重复性与统计**：每个实验条件至少设置生物学重复（通常3-5次）和технический重复，确保结果的可靠性和统计学意义。

6.**结果解读**：综合分析多种指标（如增殖、细胞因子谱、细胞亚群比例），结合实验设计目的，谨慎解读免疫反应结果。

**四、免疫反应规程的应用场景**

（一）疾病诊断

(1)**过敏原检测**：通过体外检测患者血清特异性IgE水平或淋巴细胞对过敏原的增殖/细胞因子反应，辅助诊断过敏性疾病。

(2)**自身免疫性疾病研究**：检测患者体内是否存在针对自身抗原的异常T/B细胞应答或自身抗体。

(3)**感染性疾病监测**：评估感染后机体免疫记忆的形成情况，或检测潜伏感染中的免疫状态。

（二）疫苗研发

(1)**免疫原筛选**：评估候选疫苗成分（如蛋白质、多肽、病毒载体）能否有效刺激目标免疫细胞（T细胞、B细胞），产生预期的免疫应答类型（如Th1、抗体）。

(2)**免疫效果评价**：在动物模型或人体临床试验中，通过体外检测接种后血液样本中的抗体水平、细胞因子反应、增殖能力等，评价疫苗的保护效果和安全性。

(3)**佐剂研究**：测试不同佐剂对免疫原递呈和免疫应答增强的效果。

（三）免疫治疗

(1)**治疗性疫苗开发**：体外验证肿瘤相关抗原能否激发T细胞产生抗肿瘤活性。

(2)**免疫细胞治疗监测**：在细胞治疗（如CAR-T细胞疗法）过程中，通过体外培养和检测，监控细胞活化、增殖、分化和功能状态。

(3)**药物研发**：筛选和优化能够调节免疫反应（如抑制或增强特定细胞功能）的药物。

本规程为免疫反应体外实验的基本操作框架，具体实验设计需根据研究目的、细胞类型、抗原性质等实际情况进行优化和调整。

一、免疫反应规程概述

免疫反应规程是指在生物体识别并应对外来抗原（如病原体、异物）时，通过免疫系统一系列精确、有序的机制进行防御和调节的过程。本规程旨在提供一套标准化的操作步骤和注意事项，以确保免疫反应的准确性和有效性。以下是免疫反应规程的主要内容和实施要点。

二、免疫反应的基本流程

（一）抗原识别与处理

1.抗原摄入：免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）通过吞噬、吞饮或受体介导的方式摄取抗原。

2.抗原呈递：抗原被处理成小肽，并与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，呈递给T细胞。

（二）T细胞活化

1.初始T细胞识别：CD4+辅助T细胞识别由MHC-II类分子呈递的抗原肽，CD8+细胞毒性T细胞识别由MHC-I类分子呈递的抗原肽。

2.共刺激信号：B7家族分子（如CD80/CD86）与T细胞CD28分子的结合提供必要的共刺激信号。

3.细胞因子诱导：IL-1、IL-6等细胞因子促进T细胞增殖和分化。

（三）B细胞活化与抗体产生

1.抗原结合：B细胞表面抗体（BCR）与特异性抗原结合。

2.T细胞辅助：CD4+辅助T细胞通过细胞接触和细胞因子（如IL-4、IL-5）支持B细胞增殖和分化。

3.抗体分泌：浆细胞产生并分泌大量特异性抗体，中和或清除抗原。

（四）免疫记忆形成

1.记忆细胞分化：部分活化的T细胞和B细胞分化为长期存活的记忆细胞。

2.快速响应：再次接触相同抗原时，记忆细胞能迅速启动更强的免疫应答。

三、免疫反应规程的实施要点

（一）实验室操作步骤

1.样本采集：无菌条件下采集血液、组织等样本，避免污染。

2.抗原处理：采用酶解、裂解等方法提取和纯化抗原，确保活性。

3.细胞培养：在含10%FBS的RPMI-1640培养基中培养免疫细胞，37℃、5%CO₂条件下孵育。

4.免疫检测：通过流式细胞术、ELISA等方法定量分析细胞因子、抗体水平。

（二）质量控制与安全措施

1.试剂验证：使用高纯度抗体和细胞因子，定期检测效价。

2.无菌控制：所有操作需在超净工作台进行，避免微生物污染。

3.废物处理：实验废弃物按生物安全规定分类处理。

（三）注意事项

1.样本保存：低温保存（如-80℃）以维持抗原活性。

2.细胞毒性评估：定期检测细胞活力，防止过度激活导致细胞凋亡。

3.结果解读：结合临床背景分析免疫应答强度，避免误判。

四、免疫反应规程的应用场景

（一）疾病诊断

（二）疫苗研发

评估候选疫苗的免疫原性，优化抗原设计。

（三）免疫治疗

监测治疗过程中的免疫应答变化，调整用药方案。

本规程为免疫反应的基本操作指南，具体实验设计需根据实际需求调整参数和方法。

**一、免疫反应规程概述**

免疫反应规程是指在生物体识别并应对外来抗原（如病原体、异物）时，通过免疫系统一系列精确、有序的机制进行防御和调节的过程。本规程旨在提供一套标准化的操作步骤和注意事项，以确保免疫反应的准确性和有效性。以下是免疫反应规程的主要内容和实施要点。本规程适用于基础免疫学研究、生物制品（如疫苗、抗体）研发及质量控制等场景，重点关注体外实验中的免疫细胞活化、增殖、分化和效应功能检测等环节。

**二、免疫反应的基本流程**

（一）抗原识别与处理

1.抗原摄入：免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）通过多种机制摄取外源抗原。

(1)**吞噬作用**：大颗粒抗原（如细菌、细胞碎片）被巨噬细胞表面的吞噬小体包裹并内部化。

(2)**吞饮作用**：小分子抗原或溶液通过细胞膜内陷形成吞饮小泡被摄入。

(3)**受体介导的内吞**：特定抗原通过与细胞表面特异性受体（如补体受体CR3、清道夫受体）结合后被内吞。

2.抗原处理：摄入的抗原在细胞内被降解为小分子肽段。

(1)**溶酶体降解**：吞噬体与溶酶体融合，利用其中的酸性环境和多种水解酶（如蛋白酶、核酸酶）分解抗原。

(2)**蛋白酶体加工**：MHC-I类分子途径中，抗原肽在蛋白酶体中生成；MHC-II类分子途径中，内体中的抗原被蛋白酶体处理。

3.抗原呈递：处理后的抗原肽被装载到MHC分子上，表达于细胞表面供T细胞识别。

(1)**MHC-I类分子呈递**：内源性抗原肽（如病毒蛋白）被蛋白酶体加工后，与TAP转运体进入内质网，与MHC-I类分子结合并表达于几乎所有有核细胞表面，供CD8+T细胞识别。

(2)**MHC-II类分子呈递**：外源性抗原肽在细胞内体/溶酶体中加工后，与MHC-II类分子在细胞内质网组装，主要表达于抗原呈递细胞（APC，如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞）表面，供CD4+T细胞识别。

（二）T细胞活化

1.初始T细胞识别：T细胞受体（TCR）特异性识别MHC分子呈递的抗原肽。

(1)**亲和力要求**：TCR与MHC-抗原肽复合物的结合需达到一定的亲和力阈值才能启动信号。

(2)**MHC限制性**：TCR只能识别由自身MHC分子呈递的抗原肽。

2.共刺激信号：除了TCR识别，T细胞活化的第二信号（共刺激信号）至关重要。

(1)**B7-CD28通路**：APC表面的CD80/CD86与T细胞表面的CD28结合，提供关键的共刺激信号，激活MAPK和NF-κB等信号通路，促进T细胞增殖和分化的起始。

(2)**其他共刺激分子**：如CD40-CD40L、ICOS-ICOSL等也参与T细胞活化过程。

3.细胞因子诱导：APC或其他细胞分泌的细胞因子提供第三信号，决定T细胞的分化方向。

(1)**丝裂原刺激**：在缺乏特定抗原和共刺激时，可通过植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）等丝裂原刺激T细胞增殖，但通常不产生功能性细胞因子或记忆细胞。

(2)**抗原特异性刺激**：在抗原和共刺激存在时：

(a)**辅助T细胞（Th）分化**：根据细胞因子微环境（如IL-12促进Th1，IL-4促进Th2）和APC类型，分化为Th1、Th2、Th17、Tfh等亚型。

(b)**细胞毒性T细胞（Tc）分化**：CD8+T细胞在IL-2等细胞因子支持下增殖并分化为效应Tc细胞。

（三）B细胞活化与抗体产生

1.抗原结合：B细胞表面的B细胞受体（BCR，即膜结合型IgM/IgD）特异性识别和结合游离抗原或结合在靶细胞表面的抗原。

(1)**补体依赖性**：某些抗原通过激活补体系统（如C3b）被B细胞捕获。

(2)**交叉链接**：多个BCR同时结合相邻的抗原分子，形成交叉链接，提高信号效率。

2.T细胞辅助：大多数体液免疫需要CD4+辅助T细胞（Th）的帮助。

(1)**直接接触**：活化的Th细胞与B细胞通过共刺激分子（如CD40-CD40L）和细胞因子受体/配体（如CTLA-4/CD80）发生直接接触。

(2)**细胞因子作用**：活化的Th细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-21等细胞因子，促进B细胞增殖、分类分化（如Ig类别转换）和抗体分泌。

3.抗体分泌：活化的B细胞分化为浆细胞，大量产生并分泌特异性抗体。

(1)**终末分化**：B细胞在细胞因子和BCR信号驱动下，经历增殖、终末分化，失去增殖能力，成为合成和分泌抗体的工厂。

(2)**抗体类别转换**：在Th细胞因子作用下，B细胞可合成不同类型的抗体（如IgG、IgA、IgE），分别执行中和、黏膜免疫、过敏反应等功能。

(3)**高亲和力成熟**：B细胞在骨髓中经历亲和力成熟过程，通过V(D)J重排和体细胞超突变，产生亲和力更高的抗体。

（四）免疫记忆形成

1.记忆细胞分化：部分活化的T细胞和B细胞在特定信号（如IL-7、IL-15）和转录因子（如Bcl-6、Tox）作用下，分化为长期存活的记忆细胞。

(1)**记忆T细胞（Tmem,Tcm）**：通常在初次免疫后较早出现，具有快速增殖和效应功能，但稳定性稍差。

(2)**效应记忆T细胞（Tem）**：在感染局部发挥快速效应功能。

(3)**记忆B细胞（Bmem）**：具有长寿和快速分化为浆细胞的能力，是再次应答的主要贡献者。

2.快速响应：记忆细胞具有更高的激活阈值，但一旦被再次激活，能迅速增殖、分化并产生大量效应分子，提供比初次应答更强、更快的保护。

**三、免疫反应规程的实施要点**

（一）实验室操作步骤

1.**样本采集与处理**：

(1)**细胞分离**：使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法或磁珠分选技术从血液或组织匀浆中分离外周血单个核细胞（PBMC）、巨噬细胞、树突状细胞等。

(2)**细胞计数与活力检测**：使用血细胞计数板或流式细胞术计数细胞数量，通过台盼蓝染色法或活死染色法评估细胞活力，通常要求活力>95%。

2.**抗原制备与处理**：

(1)**抗原来源**：可使用纯化蛋白、重组蛋白、多肽、病毒样颗粒、灭活/减毒病原体等。

(2)**抗原纯化**：通过SDS、层析等方法纯化抗原，测定浓度（如使用BCA试剂盒）和纯度（如使用SDS）。

(3)**抗原处理**：根据所需免疫通路，选择合适的方法处理抗原：

-**未处理抗原**：用于检测TCR/BCR直接识别。

-**热灭活**：适用于病毒抗原，需确保灭活完全。

-**蛋白酶消化**：模拟抗原在APC内的处理过程，制备多肽。

3.**细胞活化与培养**：

(1)**初始T细胞活化**：将CD4+或CD8+T细胞与等量（如1×10^5cells/mL）的APC（如树突状细胞）在含10%FBS的RPMI-1640培养基中，加入特定浓度（如0.1-1.0µg/mL）的蛋白抗原或肽段，共培养5-7天。

(2)**B细胞活化**：将B细胞与活化的CD4+Th细胞（细胞比例通常为1:5-1:10）或直接用抗CD40抗体（如10-50µg/mL）和IL-4（如10ng/mL）在培养皿中共培养3-5天。

(3)**细胞因子刺激**：为研究特定细胞因子反应，可在培养体系中加入预致敏的丝裂原（如PHA1-10µg/mL）或特定细胞因子（如IL-210-100U/mL）。

4.**免疫检测**：

(1)**增殖检测**：使用3H-TdR掺入法（需闪烁计数器）或CFSE分群流式细胞术检测细胞增殖。

(2)**细胞因子检测**：

-**ELISA**：检测培养上清或细胞裂解物中的细胞因子浓度（如IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10等），需制备标准曲线。

-**流式细胞术（Cytometry)**：通过PE/Cy7标记的抗细胞因子抗体，直接检测细胞表面表达或细胞内胞吞的细胞因子。

(3)**细胞分型与功能检测**：

-**流式细胞术**：使用PE,APC,PerCP-Cy5.5,FITC等荧光标记抗体检测细胞表面标志物（如CD4,CD8,CD25,CD69,CD27,CD45RA,CD45RO,CD40,CD80），区分不同T/B细胞亚群。

-**胞内染色**：使用FixablePermeabilizingSolution（如eBiosciencePerFix-PermKit）使细胞通透，再用抗体检测胞内转录因子（如FoxP3,TBET,GATA3）或细胞因子。

-**ELISPOT**：检测单个细胞分泌的少量细胞因子。

（二）质量控制与安全措施

1.**试剂验证**：

(1)**抗体质量**：选择具有高特异性（低非特异性结合）和亲和力的商业抗体，查阅文献或进行WesternBlot验证。

(2)**细胞因子标准品**：使用经过认证的标准品校准ELISA等检测方法。

(3)**培养基与血清**：使用无菌、无热原的细胞培养基和经过辐照或过滤除菌的血清。

2.**无菌控制**：

(1)**操作环境**：所有细胞培养操作应在生物安全柜中进行。

(2)**耗材灭菌**：所有接触细胞和培养液的耗材（培养皿、