【《糖尿病小鼠的伤口愈合实验探究报告》7100字】

糖尿病小鼠的伤口愈合实验探究报告TOC\o"1-3"\h\u1.前言 [11]。鼠类具有质量小、成本低、繁殖速度快的优点，而且生理结构、疾病特征、生物代谢及组织功能与人体相似，所以我们选择C57BL/6小鼠作为该研究的实验对象。1.2研究思路Ⅱ型糖尿病（T2DM）是一个日益受到国际关注的健康问题，其发病率不断升高。T2DM的并发症包括许多并发症，包括严重的并发症伤口愈合不良，慢性溃疡，慢性皮肤溃疡常见于下肢，尤其是足部，称为糖尿病足，糖尿病足溃疡影响15%的糖尿病患者患者。在糖尿病组织患者中，14-24%的患者随后经历了下肢截肢，截肢后5年死亡率接近50-59%[13]。研究发现，糖尿病在皮肤伤口愈合中具有明确的、有序的阶段性，导致各个阶段的功能失调。而糖尿病慢性、不愈合伤口的病因是多方面的，进展为不愈合表型与较差的血管网络密切相关[3]，伤口长期不愈合对疾病的治疗和病人的生活都造成了极大的影响。对此，我们建立糖尿病小鼠模型对糖尿病小鼠和正常小鼠的伤口愈合情况进行对比，研究糖尿病造成伤口难以愈合的具体原因。2.糖尿病小鼠皮肤结构改变引起伤口难愈合2.1实验材料2.1.1实验动物及其条件6～8周龄C57BL/6小鼠，随机分为实验组和对照组2.1.2实验试剂实验所用到的主要试剂见表2-1。表2-1实验试剂表2.1.3实验主要试剂的配置（1）0.5~1%的伊红酒精溶液：配置方法打开电子天平的开关，把电子天平的读数归零，再放一张称量纸在电子天平上。用药匙取少量的伊红试剂置于称量纸上，称取伊红0.5~1g。把称好的伊红倒入一个洁净的空烧杯中，往空烧杯中加入少量蒸馏水（以刚好能溶解伊红试剂为佳），再用玻璃棒不断搅拌溶有伊红的蒸馏水，使其充分溶解。在溶解后的伊红溶液中缓慢滴加冰醋酸，一边加一边搅拌，直至溶液呈浆糊状。再把混合溶液用滤纸过滤，留滤渣备用。把滤渣置于烘箱中烘干。把烘干后的滤渣放入烧杯中，加入100毫升95%的酒精，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，即得到伊红酒精溶液。（2）苏木素染液：配置方法用药匙取少量苏木精置于电子天平上，精确称取苏木精3g。把称好的苏木精倒进一个洁净的空烧杯中。用量筒量精确取50mLAbsoluteethylalcohol（无水乙醇），把称好的无水乙醇倒入盛有苏木精的烧杯中，用玻璃棒搅拌溶液使其溶解。再用电子天平称取75g硫酸铝钾，倒入一个洁净的烧杯，量取1000mL的蒸馏水倒入硫酸铝钾的烧杯中，用玻璃棒搅拌使其溶解。把苏木精溶液和硫酸铝钾溶液混合。量取450mL甘油，把甘油倒入混合液中，搅拌使其混合均匀。最后用电子天平精确称取碘酸钠0.6g，用量筒量取冰醋酸60mL，加入混合溶液中，即得到苏木素染液。表2-2苏木素染液配方苏木素染液配方：(配制1500ml)苏木精3g无水乙醇50ml硫酸铝钾75g蒸馏水1000ml碘酸钠0.6g冰醋酸60ml甘油450ml（3）1%盐酸酒精分化液配置方法用量筒精确量取浓盐酸1毫升和99毫升70%的酒精，把浓盐酸缓缓倒入酒精中，边倒边搅拌。（4）柠檬酸缓冲液配置方法A液：打开电子天平的开关，把电子天平的读数归零，再放一张称量纸在电子天平上。用电子天平精确称取柠檬酸（citricacid）2.1g，再用量筒量取DDW（双蒸水）100mL倒入烧杯中，将称好的柠檬酸倒入DDW中，用玻璃棒不断搅拌直至完全溶解。B液：用电子天平精确称取Sodiumcitrate(柠檬酸钠)2.94g，用量筒量取DDW100ml倒入烧杯，将称好的柠檬酸钠倒入DDW中，用玻璃棒不断搅拌直至完全溶解。将A液与B液以1∶1或1：1.32的比例混合，用滤纸过滤，再用pH进行测定pH值，调节pH=4.2~4.5即可。（5）STZ溶液配置方法将STZ试剂溶于刚刚配置好的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液中，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，再用0.22μm的滤菌器进行过滤除菌。配置过程中保持冰浴，在干燥且避光的环境中配制，必须现用现配，并在三十分钟内注射完毕。2.2主要仪器主要实验仪器见表2-3表2-3实验仪器和设备2.3实验方法2.3.1糖尿病小鼠模型的制备选取6～8周的C57BL/6小鼠进行高脂喂养四周，通过药膳模型使小鼠的血糖升高，对照组喂养普通饲料。四周之后，给小鼠每天一次、连续三天腹腔注射STZ试剂。在注射链脲佐菌素之前，先让小鼠空腹12小时，再给予实验组小鼠40mg/kg体重的剂量注射链脲佐菌素（STZ），给予对照组小鼠同样剂量的柠檬酸钠缓冲液进行腹腔注射。注射完成后用棉签按压伤口，直至伤口止血。把小鼠放回笼子中，术后禁食2～3h。连续三天注射STZ之后，用剪尾尖法测定小鼠空腹时的血糖值，若空腹血糖值>11.1mmol/L，则判定Ⅱ型糖尿病鼠模型造模成功。连续测量血糖5周，待小鼠血糖稳定后，进入正式实验。观察并记录两组小鼠的大体情况。2.3.2小鼠测血糖方法采用断尾取血法检测血糖，采用罗氏血糖仪进行测量，步骤：先让小鼠空腹6h，用医用酒精对小鼠的尾部进行消毒，再用医用剪刀剪断小鼠尾巴末端的一小段尾尖，挤出一滴小鼠尾尖的血液，把它滴到罗氏血糖试纸上，待血糖仪显示读数做好记录。测完血糖后将小鼠放回笼子中按原条件饲养。2.3.3正常小鼠及糖尿病小鼠伤口模型的制备测得小鼠血糖趋于稳定值之后继续正常喂养小鼠一周，一周后进行糖尿病小鼠伤口模型的制备。对小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠，每只给予30mg/kg体重的剂量，用打耳钉法为两组小鼠做好区别。用打孔器给每只小鼠的背部取一个直径为3mm的伤口。具体步骤：用电动剃须刀将小鼠背部的毛发剔除干净，再用纸巾擦去残留的毛发，此操作要小心进行避免造成小鼠的皮肤损伤。用温水将小鼠毛发浸湿，用棉签沾取脱毛膏均匀地涂抹在小鼠的背部皮肤上，等待5-10min后擦掉脱毛膏和毛发，再用温水清洗一遍，用纸巾将小鼠皮肤擦干。采用腹腔注射法注射戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉，将麻醉后的小鼠放在试验台上，固定好小鼠的四肢，用医用酒精对小鼠的背部皮肤进行消毒，选用直径为3mm的真皮穿孔机按压小鼠背部取一个直径为3mm的小孔，最后用医用手术剪刀和平口镊沿圆孔痕剪切掉包括表皮和真皮层在内的全层皮肤组织，将皮下筋膜统一进行剪除。最后拍照记录伤口直径，再将每只小鼠进行单笼喂养。2.3.3冰冻切片（1）取材小鼠伤口愈合后，用棉签将脱毛膏轻轻均匀涂抹在小鼠的背部，待10-15min后擦掉脱毛膏和毛发，进行脱毛处理，然后用清水清洗干净皮肤，为了避免脱毛膏的残留给实验带来影响，所以应该在脱毛处理后第二天再进行取材工作。在脱毛后第二日将糖尿病组小鼠和正常组对应小鼠采用脊椎脱臼法进行处死，再进行取材，取材的大小和厚度要适中，太大或者太厚都会影响切片和染色的操作，最好的大小是24×24×2mm。（2）取出组织支承器，首先把取得的组织摆好放平，在组织周边滴上包埋剂，快速放于液氮中1min，在-80℃冰箱中冰冻保存。（3）取出冷冻好的组织块，把组织块夹紧于置切片机的持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织的表面修平，以便于下一步操作。（4）根据自己需要的组织切片厚度，调节切片机，本次实验切片厚度为8微米，调好防卷板，准确地将防卷板调校至适当的位置。进行切片时，要确保切出的切片在切出来的瞬间顺利地通过刀防卷板间的通道，并且能够平整地躺在持刀器的那块铁板上。然后缓慢掀起防卷板，取出一块洁净的载玻片，把切下来的切片附贴到洁净的载玻片上面即可。根据实验切片的组织不同，调节适合该组织的的冷冻度。2.3.4HE染色待刚刚切下来的切片附贴在洁净的载玻片上面后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1min，1min之后即可进行染色操作。方法：将切片固定30s－1min将切片进行水洗用苏木素对切片进行染色3min再次水洗用盐酸酒精分化液（75%：盐酸=99：1）洗涤15s充分水洗用伊红染色40－60s水洗用梯度乙醇和二甲苯洗一遍稍微甩干水分，滴加中性树胶（少量滴于组织上），进行封片。2.4实验结果2.4.1小鼠血糖测定测得正常小鼠血糖值为5.6mmol/L。表2-4打孔前糖尿病小鼠的血糖表注：第一周是未注射STZ时小鼠的血糖，注射后一周小鼠血糖升高，第四周时观察小鼠血糖达到稳定值。与正常小鼠相比，糖尿病小鼠的血糖值（）更高。图2-1打孔前糖尿病小鼠血糖变化由测得的数据可知：注射STZ之后糖尿病小鼠的血糖逐渐升高，直到第五周小鼠血糖趋于稳定。2.4.2小鼠伤口愈合情况对比连续十天测得的糖尿病小鼠和正常小鼠伤口愈合情况对比见图2-2。图2-2糖尿病小鼠和正常小鼠伤口愈合情况根据图2-2可知：糖尿病小鼠伤口愈合速度与正常小鼠相比明显较慢，出现伤口难愈合的症状。2.4.3正常小鼠和糖尿病小鼠的正常皮肤对比两组小鼠的正常皮肤切片见下图。图a图b图2-3糖尿病小鼠和正常小鼠的毛囊对比图注：图a为糖尿病小鼠的HE染色切片，图b为正常小鼠的切片，可以观察到，正常小鼠毛囊呈现扁圆形，糖尿病小鼠的毛囊呈不规则圆形。图a图b图2-4糖尿病小鼠和正常小鼠的表皮层图注：图a为糖尿病小鼠的皮肤切片，图b为正常小鼠的皮肤切片，可以观察到糖尿病小鼠的表皮层比正常小鼠的表皮层更厚。图a图b图2-5糖尿病小鼠和正常小鼠的伤口切片图注：图a为糖尿病小鼠的伤口切片，图b为正常小鼠的伤口切片，可以看出糖尿病小鼠伤口部位的毛囊明显减少，瘢痕组织明显变厚，炎症细胞增多；正常小鼠伤口的毛囊较多，基本未见瘢痕组织。2.5小结本次实验对糖尿病小鼠和正常小鼠伤口愈合的情况进行了对比，并对糖尿病小鼠和正常小鼠的创口皮肤切片进行了对比，发现了糖尿病小鼠的皮肤结构发生的变化主要是表皮层变厚、伤口处毛囊变少，瘢痕组织明显变厚，这为临床针对糖尿病伤口的治疗提供了一个方向，可以对糖尿病伤口的护理进行针对性的治疗以达到预期的治疗效果。

参考文献黄静娟.姜黄素同源物C66对糖尿病小鼠伤口愈合的影响及机制研究[D].广东药科大学,2020.GuoS.&L.A.Dipietro.Factorsaffectingwoundhealing.[J].JDentRes.2010.89(3):219-29.LynnW.&R.Hopkinson&C.Gutteridge,etal.Clinicalmanagement.Wheremedicinemeetsmanagement.Themakingofamedicaldirector.InterviewbyNickEdwards,Mary-LouiseHardingandEmmaForrest.[J].HealthServJ.2004.张茜.五谷麒麟膏促进SD大鼠创面愈合实验研究[D].陕西中医药大学,2018[4]卢芳,冯毕龙.伤口的分类及处理原则[J].中国临床护理,2010,2(04):365-367.何航远.异种生物敷料联合负压封闭引流促进创面愈合的临床研究[D].苏州大学,2019.蔡雪芹.基于巨噬细胞免疫应答机制构建新型多糖复合水凝胶治疗糖尿病溃疡的基础研究[D].天津医科大学,2017.王诺琦,杨秀颖,杜冠华.影响糖尿病伤口愈合机制研究进展[J].药学学报,2020,55(12):2811-2817.ArdaO.&N.Goksugur&Y.Tuzun.Basichistologicalstructureandfunctionso