DB65 高致病性猪蓝耳病 RT-PCR 检测方法

高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测方法respiratorysyndromev新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定编写。本标准由乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心提出。本标准由新疆维吾尔自治区畜牧厅归口。本标准起草单位：乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、重庆市动物疫病预防控制中心。本标准起草人：杨小亮、李建玲、李爱巧、王璐、吴星星、王涛、杨启元、张婕、陈彪、曾政、何生、施远翔、王爱菊、韩义忠。I本标准规定了高致病性猪蓝耳病病毒核酸RT-PCR检测的试剂、仪器设备、操作程序及结果判定的要求。本标准适用于猪只感染高致病性和美洲型经典猪蓝耳病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法农业部《高致病性猪蓝耳病防治技术规范》3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。高致病性猪蓝耳病highlypathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromeHP-PRRS逆转录-聚合酶链式反应reversitranscriptasepolymerasechainreactionRT-PCR合成cDNA,再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。下列缩略语适用于本文件：bp:basepair,碱基对；DNA:Deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸；dNTPs:DeoxyribonucleosideTriphosphates,脱氧核糖核苷酸；PCR:Polymerasechainreaction,聚合酶链式反应；RT-PCR:ReversetranscriptionPCR,反转录PCR;15.22mol/L醋酸钠溶液(pH4.0):见附录A.2。5.3水饱和酚(pH4.0)。5.4氯仿-异戊醇(49:1)混合溶液。5.5反转录酶(200U/μL)。5.71.5%琼脂糖凝胶：见附录A.3。5.9EB溶液(10μg/μL):见附A.5。5.11DEPC处理的灭菌双蒸水：见附录A.7。5.13DEPC处理的灭菌双蒸水配置的75%乙醇：见附录A.8。5.18引物：见附录A.9。5.19实验用水均为蒸馏水，规格符合GB/T6682-2008的相关规定。高速冷冻离心机(最高转速应大于12000rpm),组织研磨器或研钵，PCR扩增仪，核酸电泳仪，水平电泳槽，恒温水浴锅，2℃~8℃冰箱和-20℃冰箱，微量移液器(0.5HL～10HL;2HL～20HL;20HL~200HL;100HL～1000HL),凝胶成像系统(或紫外透射仪),超净工作台或通风橱，生物安全柜。选择临床症状明显的病死猪3头～5头，无菌采集肺、脾、淋巴结和扁桃体等组织，2℃~8℃环境下冷藏并在24h内送至实验室检测，或在-20℃的环境中保存备用。若需长期保存，应将样品置于-70℃冰箱中。7.2.1取组织样品进行研磨匀浆后冻融2次，5000rpm/min离心5min。2续加入30μl2mol/L乙酸钠(pH值4.0)。反复颠倒离心管5次，在室温下放置5min。12000rpm/min、4℃离心15min并取上清。7.2.3再依次加入150μL饱和酚、150μL氯仿-异戊醇，然后盖上管盖，反复颠倒混匀5次，冰浴7.2.412000rpm/min、4℃离心15min,将上层含RNA的水相移7.2.5加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰浴静置10min沉淀RNA。7.2.612000rpm/min、47.2.8将含有RNA沉淀的离心管静置干燥沉淀5min～10min,然后用20μLDEPC水(或无核酸酶水)将沉淀充分溶解，冰上保存并在2h内进行RT-PCR扩增或在-20℃条件下保存备用。7.3一步法RT-PCR操作步骤94℃2min,然后进入35个扩增循环：94℃30s,56℃45s,68℃45s,最后68℃延伸8min,产物4℃保7.4.1制备1.5%琼脂糖凝胶板，见附录A.3。7.4.4盖好电泳仪，插好电极，电压5V/cm,电泳20min～30min。8结果判定在阳性对照同时出现230bp(HP-PRRSV)和320bp(美洲型)的扩增带、阴性对照无相应目标条带，洲型PRRSV阳性；同时出现230bp、320bp的目标条带，则判定为HP-PRRS和美洲型PRRSV双阳性。没有出现230bp和320bp条带则判定为高致病性蓝耳病和经典美3(规范性附录)将250g异硫氰酸胍、17.6mL0.75mol/L(pH7.0)柠檬酸钠和26.4mL10%(m/V)十二烷基磺酸钠溶293mL水中。65℃条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下保存，每次使用前按每50A.31.5%琼脂糖凝胶的配制用琼脂糖1.0g,1×TAE电泳缓冲液100mL,混匀后在微波炉中完全融化，待冷至50℃~60℃时，A.450×TAE电泳缓冲液在100mL容量瓶中，先加入EDTA-Na218.61g,加入适量灭菌双蒸水，再用氢氧化钠调pH至8.0时定三羟甲基氨基甲烷(Tris)242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)100mL,加灭4DEPC100μL,加超纯水至100mL,室温过夜，121℃高压15min,分装到1.5mLDEPC处理过的微量管中，冻存备用。A.875%乙醇(用DEPC水配置)用75mL无水乙醇，加DEPC水至100mL,混匀，4℃保存备用。A.9.1HP-PRRSV和美洲型PRRSV检测引物序列如表A.1。表A.1HP-PRRSV和美洲型PRRSV检测引物序列序列上游引物PRRST1下游引物PRRST2A.9.2引物合成后短期内可4℃存放，需长期保存应冻存于-20℃。待用时应稀释至20pmol浓度。扩增时2条引物在同一体系中，扩增结束后出现大小为230bp的目的片段为HP-PRR