DB12T 465-2012 预防性健康检查 粪便中沙门氏菌、志贺氏菌的检测方法

ICS13.100DB12DetectionmethodsofS天津市质量技术监督局IDB12/T465—2012本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的标准文本的格式和文字进行编写。本标准由天津市南开区疾病预防控制中心提出。本标准起草单位：天津市南开区疾病预防控制中心、天津正大乾坤生物科技有限公司。本标准主要起草人：柳光斌、陈金枝、庞作章、马均彪、王楠、于磊、沈宗林。DB12/T465—2012本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到6.1.2条采便管与微生物采样增菌培养管内容的采便套管和采便棒相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人姓名：马均彪地址：天津市南开区东马路新安花园A-1-604请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。DB12/T465—20121志贺氏菌的检测方法志贺氏菌的检测方法本标准规定了预防性健康检查粪便中沙门氏菌、志贺氏菌的检测方法的术语和定义、设备和实验器具、培养基和试剂、检验程序、操作步骤以及结果报告。本标准适用于疾病预防控制机构和医疗机构对食品、公共场所等行业从业人员，进行沙门氏菌和志贺氏菌健康带菌者的检测和确认。下列术语和定义适用于本文件。2.1采便管Collectingpipe由采便套管和采便棒构成的采便装置，采便套管内装有经钴60辐射灭菌的SN液体增菌液培养基。2.2带菌者Carriers无任何临床表现，从粪便中分离到沙门氏菌（伤寒和副伤寒菌）或志贺氏菌的人群。3.1冰箱：4℃~8℃。3.2恒温培养箱：36℃±1℃。3.3电子天平：感量0.1g。3.4锥形瓶:容量500mL，250mL。3.5无菌培养皿：直径90mm。4.1沙门氏菌和志贺氏菌增菌液（SN见附录A中A.1。4.2沙门氏菌、志贺氏菌（SS）琼脂培养基：见附录A中A.2。4.3HE琼脂：见附录A中A.3。4.4木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录A中A.4。DB12/T465—201224.5克氏双糖铁琼脂（KIA）见附录A中粪便A.5。4.6三糖铁（TSI）琼脂：见附录A中粪便A.6。4.7动力-吲哚-尿素（MIU）培养基：见附录A中A.7。4.8蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A中A.8。4.9氰化钾（KCN）培养基：见附录A中A.9。4.10赖氨酸铁琼脂（LIA见附录A中A.10。4.11糖发酵管：见附录A中A.11。4.12邻硝基酚阝-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录A中A.12。4.13半固体琼脂：见附录A中A.13。4.14丙二酸钠培养基：见附录A中A.14。4.15沙门氏菌属O、H和Vi诊断血清。4.16志贺氏菌属诊断血清沙门氏菌、志贺氏菌的检验程序见图1：DB12/T465—2012336℃±1℃18h～24h36℃±1℃18h～24h36℃±1℃18h～24h6.1.1肛拭子采便手持灭菌直肠棉拭子先用无菌生理盐水中浸湿，由肛门插入直肠3cm～5cm处，旋转360o采集后，将棉拭子手持端折断弃去，棉拭子端放入灭菌的SN增菌液培养管中。6.1.2采便管采便手持采便管中的采便棒由肛门插入直肠3cm～5cm处，旋转360o采集后，将采便棒放入灭菌的SN增菌液培养管中。6.1.3现场留便体检者在现场自行留取约1g粪便并及时接种灭菌的SN增菌液培养基中。DB12/T465—20124将肛拭子采便或采便管采便或自行留便的SN增菌液培养管，置36℃±1℃,培养18h～24h。分别用接种环取增菌液一环，划线接种一个HE琼脂平板或XLD琼脂平板或SS琼脂平板和麦康凯琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，观察各个平板上生长的菌落。各个平板上菌落特征见表1。琼脂和动力-吲哚-尿素培养基（MIU）及赖氨酸铁琼脂（LIA于36℃±1℃,培养18h～24h。沙门氏菌初步生化鉴定见表2。-++--+++-/++----+++--+++++--++++++-+++++---++++-+-++-+/-+-+/--/+DB12/T465—20125自选择性分离平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种克氏双糖铁琼脂（KIA）或三糖铁（TSI）琼脂及动力-吲哚-尿素培养基（MIU）及赖氨酸铁琼脂（LIA）。每份标本应多挑几个菌落，于36℃±1℃,培养18h～24h。志贺氏菌初步生化鉴定见表3。A/K----/+---挑取符合沙门氏菌生化反应的KIA或TSI斜面上菌苔先与A～FO多价血清进行玻片凝集，凝集阳性者（生理盐水不凝集再选用O-2、O-4、O-7、O-8、O-9等因子血清凝集，沙门氏菌（伤寒和丙型副伤寒菌）的Vi抗原能阻碍O抗原凝集，必要时制成浓菌悬液经100℃水浴30min破坏Vi抗原后，再进行抗O血清的凝集。O抗原确定后再用H因子诊断血清凝集以确定菌型见表4。检出沙门氏菌（伤寒和丙型副伤寒菌）以外的沙门氏菌时其抗原的鉴定可参见附录B（常见沙门氏菌抗原表）进行鉴定。沙门氏菌（伤寒和丙型副伤寒菌）具有Vi抗原应与Vi诊断血清进行血清凝集试验。2a--4b-7c9d-a)挑取KIA(TSI)疑似志贺氏菌的培养物，先用志贺氏菌四种多价血清做玻片凝集试验。如呈现凝集，则用B群（福氏）多价、D群（宋内）血清及志贺2型、志贺1型分别进行凝集试验。b)与B群（福氏）多价血清凝集的培养物，则用群3，4、6、7，8因子血清进行凝集试验，根据群因子血清的凝集的结果再选用1型～6型分型血清进行凝集试验，鉴定出型和亚型（见表6、表7）。DB12/T465—20126c)与志贺四种多价血清不凝集的培养物，应用C群鲍氏多价血清及1型～19型因子血清进行检查。若鲍氏血清不凝集，再用A群3型～15型多价及分型血清进行检查。d)若与上述血清均不凝集应进行生化鉴定，若生化反应符合志贺氏菌定义应注意该菌是否带有K抗原，将该菌制成浓菌液100℃水浴30min（破坏K抗原）,待菌液凉至室温再进行血清学鉴定。e)若四种多价血清凝集，而不与相应的分型血清凝集，且菌落粗糙，可用宋内Ⅱ相（粗造型）血清做凝集反应,见表6、表7。6Ⅰ+--Ⅰ++-Ⅰ--+Ⅱ+--Ⅱ--+Ⅱ+-+Ⅲ-++Ⅲ++-Ⅲ-+-Ⅳ+--Ⅳ++-Ⅳ--+Ⅴ+--Ⅴ--+6Ⅵ(+)--/--+/+--注表示凝集表示不凝集表示个别菌株系阴性反应。6+--++-+-+-++-+---+---注表示凝集表示不凝集。DB12/T465—201276.6.1.1生化管鉴定法自6.4.1初步判断结果营养琼脂平板上挑取可疑菌落，进行生化试验。采用传统生化管鉴定沙门氏菌(伤寒及副伤寒菌)的鉴定见表8。红++--+/---+--+++-+⊕---/+--+--+--++⊕--+--+-+/-+++++⊕--+--+-+++++根据6.4.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行沙门氏菌(伤寒及副伤寒菌)鉴定。6.6.2.1生化管鉴定法6.6.2.1.1自6.4.2初步判断结果营养琼脂平板上挑取可疑菌落，进行生化试验。即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶，氰化钾（KCN）生长，以及水杨苷和七叶苷的分解。除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。6.6.2.1.2已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵，甘露醇、棉子糖和甘油的发酵和靛基质试验。志贺氏菌属四个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似，见表9。----++--+-++d-注：+：阳性；-：阴性；-/+：多数阴DB12/T465—20128可根据6.4.2的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行志贺氏菌鉴定。综合上述生化试验和血清学鉴定的结果判定菌型，并报告粪便标本中检出或未检出沙门氏菌(伤寒及副伤寒菌)或志贺氏菌。DB12/T465—20129A.1.1成分蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氢二钠10.0g亚硒酸氢钠4.0gL-胱氨酸0.01g增菌改良剂10.05g增菌改良剂20.1g蒸馏水1000mLpH7.0±0.2A.1.2制法除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，冷却至55℃以下，以无菌操作加入亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10mL（称取0.1gL-胱氨酸，加1mol/L氢氧化钠溶液15mL，使溶解，再加无菌蒸馏水至100mL即成，如为DL-胱氨酸，用量应加倍）。摇匀，调节pH。蛋白胨5.0g牛肉浸出粉5.0g三号胆盐3.5g蒸馏水1000mL将蛋白胨、牛肉粉和胆盐溶解于400mL蒸馏水中，将琼脂加入于600mL蒸馏水中，煮沸溶解，再将两夜混合121℃高压灭菌15min，保存备用。基础培养基1000mL乳糖柠檬酸钠硫代硫酸钠10%柠檬酸铁溶液1%中性红溶液2.5mLDB12/T465—20120.1%煌绿溶液0.33mLpH7.0±0.1加热溶化基础培养基，按比例加入上述除染料以外之成分，充分混合均匀，调节pH，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。注3：可以购用SS琼脂的干燥培养基。A.3.1成分蛋白胨12.0g牛肉膏3.0g乳糖12.0g蔗糖12.0g水杨素2.0g胆盐20.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g～20.0g蒸馏水1000mL0.4％溴麝香草酚蓝溶液16.0mLAndrade指示剂20.0mL甲液20.0mL乙液20.0mLpH7.5±0.1A.3.2制法将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别搅拌均匀，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH。再加入指示剂,并与琼脂液合并,待冷至50℃~55℃倾注平皿。注5：甲液的配制：硫代硫酸钠34.0g、柠檬酸铁铵4A.4.1成分酵母膏3.0gL-赖氨酸5.0gDB12/T465—2012木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g去氧胆酸钠2.5g柠檬酸铁铵0.8g硫代硫酸钠6.8g氯化钠5.0g琼脂15.0g酚红0.08g蒸馏水1000mLpH7.2±0.2A.4.2制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50℃~55℃倾注平皿。A.5.1成分蛋白胨20.0g牛肉膏酵母膏3.0g乳糖葡萄糖氯化钠5.0g柠檬酸铁铵0.5g硫代硫酸钠0.5g琼脂酚红0.025g蒸馏水pH7.4±0.2A.5.2制法将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到比较高的底层。121℃高压灭菌15min。放置高层斜面备用。A.6.1成分DB12/T465—2012蛋白胨20.0g牛肉膏5.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵（含6个结晶水）0.2g酚红0.025g或5.0g/L溶液5.0mL氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.2g蒸馏水1000mLpH7.4±0.2A.6.2制法除酚红和琼脂外，将其他成分加入400mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。另将琼脂加入600mL蒸馏水中，煮沸溶解。将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，混匀，分装试管，每管约2mL～4mL，高压灭菌121℃10min或115℃15min，灭菌后置成高层斜面，呈桔红色。A.7.1成分蛋白胨28g氯化钠5g胰蛋白胨2g酚红0.005g磷酸二氢钾1g琼脂4gpH6.8±0.2A.7.2制法加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，冷至55℃无菌加入40%尿素溶液5mL，混匀，分装无菌试管，毎管4mL直立放置待凝固后备用。A.8.1蛋白胨水蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0g氯化钠5.0g蒸馏水1000mLpH7.4±0.2将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装小试管,121℃高压灭菌15min。DB12/T465—2012A.8.2靛基质试剂A.8.2.1柯凡克试剂：将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。A.8.2.2欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95％乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。挑取培养物接种,在36℃±1℃培养1d～2d，必要时可培养4d～5d。加入柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。A.9.1成分蛋白胨10.0g氯化钠5.0g磷酸二氢钾0.225g磷酸氢二钠5.64g蒸馏水1000mL0.5％氰化钾20.0mLA.9.2制法将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后121℃高压灭菌15min。放在冰箱内使其充分冷却。每100mL培养基加入0.5％氰化钾溶液2.0mL（最后浓度为1:10000分装于无菌试管内,每管约4mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾（KCN）培养基。并另挑取1环接种于对照培养基。在36℃±1℃培养1d～2d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制经2d细菌不生长为阴性（抑制）。因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成A.10.1成分蛋白胨酵母浸膏葡萄糖L-赖氨酸DB12/T465—2012枸橼酸铁铵0.5g硫代酸硫酸钠0.04g溴甲酚紫0.02g琼脂蒸馏水pH67±01A.10.2制法分装4mL于100mm×12mm试管中，121℃灭菌12min，斜置试管使成深高层和短斜面。A.10.3试验方法用接种针穿刺高层二次和斜面划线接种。于36℃±1℃培养18h～24h(必要时培育48h)，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，高层和斜面呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基底层变为黄色。A.11糖发酵管A.11.1成分牛肉膏蛋白胨氯化钠磷酸氢二钠（含12个结晶水）0.2％溴麝香草酚蓝溶液12.0mL蒸馏水pH7.4±0.2A.11.2制法A.11.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，调节pH。按0.5％加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。A.11.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min。另将各种糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。A.11.3试验方法从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36℃±1℃培养,一般2d～3d，迟缓反应需观察14d～30d。A.12ONPG培养基A.12.1成分邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）DB12/T465—2012（O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）60.0mg0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）10.0mL1％蛋白胨水（pH7.5）30.0mLA.12.2制法将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于无菌的小试管内，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。A.12.3试验方法自琼脂斜面上挑取培养物1满环，接种于36℃±1℃培养1h～3h和24h观察结果。如果β-半乳糖苷酶产生，则于1h～3h变黄色，如无此酶则24h不变色。A.13.1成分牛肉膏0.3g蛋白胨氯化钠0.5g琼脂0.35g～0.4g蒸馏水100mLpH7.4±0.2A.13.2制法按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH，分装小试管，121℃高压灭菌15min，直立凝固备用。A.14.1成分酵母浸膏gg硫酸铵g2.0g磷酸氢二钾g0.6g磷酸二氢钾g0.4g氯化钠g2.0g丙二酸钠g3.0g0.2％溴麝香草酚蓝溶液mLmL蒸馏水pH6.8±0.2A.14.2制法除指示剂以外的成分溶解于水，调节pH，再加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌15min。DB12/T465—2012A.14.3试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于36℃±1℃培养48h，观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。DB12/T465—2012（规范性附录）常见沙门氏菌抗原常见沙门氏菌抗原见表B.1常见沙门氏菌抗原见表B.1表B.1A群S.paratyphiAaB群S.kisanganiaa-S.paratyphiBbbbS.wienbS.burycd-DBDB12/T465—2012表B.1（续）-ii基尔瓦沙门氏菌ⅡS.kilwaⅡrS.indianazS.stanleyv