YCT《烟草及烟草制品 主要大分子物质的测定》技术报告

烟草及烟草制品主要大分子物质的测定第1部分纤维素、半纤维素1概述1.1项目背景大分子是指分子量在5000以上的生物学物质，烟草大分子物质主要有纤维素、半纤维素、木质素、果胶、淀粉、蛋白质，占烟叶重量30%左右。纤维素是由1000～10000个D-吡喃型葡萄糖基经β-1,4糖苷键联结而成的直链多糖，其基本单位是纤维二糖基，链沿长轴组合在一起形成微纤维束，具有高度的稳定性和抗化学降解能力。半纤维素成分较为复杂，包括多缩戊糖、多缩己糖等很多高分子糖，半纤维素也不溶于水，但是与纤维素不同，半纤维素具有溶于稀碱和易被酸水解的性质[1-4]。纤维素、半纤维素是烟草细胞壁的主要成分，约占烟叶、梗丝质量的10%~20%，同时也是再造烟叶的基片骨架，影响烟叶品质、加工性能和燃烧吸味[5.6]。它们对于烟叶的燃烧性能和烟丝的填充值以及卷烟的香吃味都有很直接的影响。蒲俊[7]等人的研究结果表明，纤维素含量与烟叶杂气呈正相关，与香气质、香气量、余味、刺激性、燃烧性、灰色等其它指标呈负相关；半纤维素含量与烟叶的杂气、余味呈正相关，与其余感官指标都呈负相关。纤维素和半纤维素含量高的烟叶具有强烈的刺激性，余味、燃烧性和香气质均较差。刘晓冰[8]等考察了武陵山区烤烟上部叶片纤维素含量与质量指标间相关性。结果显示，纤维素对烟叶外观质量油分的影响显著，纤维素含量高，则烟叶油分少，易破碎。随着纤维素含量升高，烟叶香气质、余味变差，香气量降低，杂气加重，刺激性增强，灰色变黑，烟叶整体感官质量降低。因此，无论是从烟叶质量评价、加工制造，还是从卷烟的烟气改善、降焦减害，甚至加热卷烟设计、制备等角度出发，准确测定烟草中的纤维素、半纤维素含量都具有十分重要的意义。国家局于2023年发布国烟科〔2023〕35号文件《国家烟草专卖局关于印发2023年度烟草行业标准项目计划的通知》，由福建中烟作为牵头单位，负责《烟草及烟草制品纤维素、半纤维素、木质素的测定》项目。2023年3月，国家烟草专卖局（甲方）与福建中烟工业有限责任公司（乙方）和标准项目协助管理单位-中国烟草标准化研究中心（丙方）为顺利完成“烟草及烟草制品纤维素、半纤维素、木质素的测定”标准项目的研制任务，经协商一致，订立了合同，合同的起止日期为2023年3月至2023年12月。1.2国内外研究简介烟草中的纤维主要包含纤维素、半纤维素，两者的结构组成存在较大差异。纤维素（Cellulose）：植物细胞壁的主要结构成分，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，其结合方式和程度对植物源食品的质地影响很大。图1.纤维素结构半纤维素(Hemicellulose)：植物细胞壁中与纤维素共生，可溶于碱溶液，由D-木糖基、D-甘露糖基、D-半乳糖基、L-阿拉伯糖基等组成。目前，纤维组成的分析方法大致有三类：粗纤维法、纤维洗涤剂法和两步酸解法[9~21]。其中，粗纤维法只能粗略地检测出生物质中的纤维，无法分离出纤维素、半纤维素。纤维洗涤剂法于1963年由美国人VanSoest提出，方法基于酸性和中性洗涤剂的方法来分析纤维的组成，采用酸、碱与样品依次共煮后用有机溶剂处理，再采用烘干称重的方式进行测定，将不能酸化的残渣为定义为中性洗涤纤维（NDF，主要包括几乎全部的纤维素、半纤维素、木质素和少量的蛋白质），在酸性洗涤剂的作用下半纤维素亦被除去得到酸性洗涤纤维（ADF），后经过72％硫酸酸化得到的不溶物即为酸洗木质素（ADL）。2010年行业基于VanSoest方法的测定原理制定了《烟草及烟草制品中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸洗木质素的测定洗涤剂法》标准方法（YC/T347–2010）[22]，该方法所得检测结果为中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维，与纤维素、半纤维素的实际组成存在一定的差异。两步酸解法：采用浓硫酸在常温下将纤维解离为低聚糖，稀释并在高温加压条件下将低聚糖进一步酸解为单糖，单糖经离子色谱分离检测后计算纤维素、半纤维素的含量，操作简单、环保安全，被农业部《农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定》（NY/T3494-2019）[23]，国家能源局《木质纤维素类生物质原料化学成分的测定第5部分：纤维素、半纤维素、果胶和木质素的测定》NB/T34057.5-2017等标准引用借鉴。但由于烟草中的淀粉含量较高（5%左右），在酸解过程中也水解出与纤维素酸解一样的单糖，干扰纤维素的准确测定，因此该标准不能直接用于烟草基质的检测，需进行优化改进。本项目基于两步酸解法建立适用于烟草的纤维素、半纤维素含量的方法，弥补YC/T347、NY/T3494等标准的不足，为烟草中该类物质的检测提供技术依据。1.3项目主要研究内容和技术路线1.3.1主要研究内容1、通过相关文献调研和前期预研，拟定以两步酸解法为前处理方法，将烟草中纤维素、半纤维素酸解为单糖，经分离检测换算得到纤维素、半纤维素含量。2、对烟草和烟草制品同时进行分析和验证，开展参数优化与评价，具体包含：（1）在样品处理环节，摸索烟草中的糖、淀粉等干扰去除手段；（2）在两步酸解环节，优化加热方式、温度和时间等酸解条件；（3）在仪器检测环节，比较不同检测方式并优化检测参数；（4）开展方法评价、行业实验室间比对，拟定标准征求意见稿。1.3.2技术路线图1技术路线图2烟草及烟草制品中纤维素、半纤维素的测定2.1本标准适用范围本标准方法规定了烟草及烟草制品中的纤维素、半纤维素含量的离子色谱测定方法。本标准方法适用于烟草及烟草制品中纤维素、半纤维素含量的测定。2.2实验原理试样依次采用80%乙醇-饱和氯化钠溶液去除糖、90%二甲亚砜-水溶液去除淀粉等干扰后，加入72%硫酸溶液解聚，加水稀释，高温酸解，抽滤分离，得酸解滤液。采用离子色谱法测定酸解滤液中的单糖，以葡萄糖浓度计算纤维素含量，以阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露糖的浓度计算半纤维素含量。2.3实验部分2.3.1主要试剂除非另有说明，在分析中使用分析纯及以上的试剂。水应为蒸馏水或至少应达到GB/T6682三级水的水平。L‒(+)‒阿拉伯糖、D-半乳糖、D-(+)-木糖、D-甘露糖、葡萄糖，纯度均≥99％。无水乙醇。二甲基亚砜。浓硫酸，98％（质量分数）。氢氧化钠溶液，50％（质量分数）。醋酸钠，99％。氯化钠80％乙醇-饱和氯化钠溶液：称取64g氯化钠于1000mL烧杯中，加入200mL水溶解，再加入800mL无水乙醇，混匀，加盖静置，待溶液澄清后过滤。090％二甲基亚砜-水溶液：移取900mL二甲基亚砜于1000mL容量瓶，用水定容。172％硫酸溶液：移取174mL水于1000mL烧杯中，缓慢加入326mL98％浓硫酸，搅拌，冷却。2硫酸稀释液：移取80μL72％硫酸溶液于1000mL容量瓶，用水定容。3200mmol/L氢氧化钠溶液：移取10.4mL氢氧化钠溶液于1000mL容量瓶，用水定容。410mmol/L氢氧化钠溶液：移取50mL200mmol/L氢氧化钠溶液于1000mL容量瓶，用水定容。5100mmol/L氢氧化溶液-1.0mol/L醋酸钠溶液：称取醋酸钠20.5g于100mL烧杯中，用适量水超声溶解，加入1.3mL氢氧化钠溶液，转移至250mL容量瓶，用水定容。6系列标准工作溶液：准确称取8mg阿拉伯糖、12mg半乳糖、70mg葡萄糖、7mg木糖、10mg甘露糖于50mL烧杯中，精确至0.1mg，用硫酸稀释液溶解，并定容于250mL容量瓶，分别移取100、200、400、800、1600μL于100mL容量瓶中，用硫酸稀释液定容，配制成糖标系列标准工作溶液，即配即用。6微晶纤维素。7木聚糖。2.3.2仪器设备离心管，50mL。具塞锥形瓶，150mL。容量瓶，100mL、250mL、500mL、1000mL。定量加液器或移液管。玻璃棒。耐压玻璃管，110mL，耐压强度不小于0.6MPa。抽滤装置。布氏漏斗。滤布，尼龙网，500目。0G4玻璃坩埚，30mL。1分析天平，感量0.1mg。2超声波发生器，可加热控温，频率37或40KHz。3离心机，适用50mL离心管，转速不低于4000r/min。4恒温水浴锅。5防爆烘箱。6离子色谱仪，配电化学检测器，工作电极：Au电极；参比电极：AgCl/Ag。7色谱柱：糖分析柱2.0mm×250mm，柱填料为疏水性高聚物薄壳型阴离子交换剂或其他等效柱；保护柱2mm×50mm。2.3.3样品处理按YC/T31《烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法》制备试样，并测定其水分含量。醇洗准确称取试样0.5g（质量记为m0）于50mL离心管中，加入40mL80%乙醇-饱和氯化钠水溶液，超声30min后4000r/min离心5min，弃上清液，得醇洗试样。二甲基亚砜洗经醇洗后的试样用70mL90%二甲亚砜-水溶液将冲洗至150mL锥形瓶，60℃超声3h后，采用布氏漏斗和滤布抽滤，滤渣依次用水、无水乙醇各洗涤三次（每次约10mL），弃滤液，滤渣晾干后转移至110mL耐压玻璃管。两步酸解在装有滤渣的耐压玻璃管中加入2.0mL72%硫酸溶液，玻棒搅匀，置于30℃恒温水浴锅酸解2h。水浴酸解后，在耐压玻璃管中缓慢加入56mL水，旋紧盖子，置于120℃烘箱中酸解2h，取出冷却。抽滤定容冷却后的酸解液经G4玻璃砂芯坩埚抽滤，用90℃～100℃热水清洗耐压玻璃管和滤渣至少3次，所得滤液转移至250mL容量瓶，冷却至室温后用水定容。准确移取1.0mL于100mL容量瓶，用水定容，待测。2.3.4测试仪器条件以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性。——流动相A：水；——流动相B：200mmol/L氢氧化钠溶液；——流动相C：100mmol/L氢氧化溶液-1.0mol/L醋酸钠溶液；——流动相D：10mmol/L氢氧化钠溶液；——流速：0.25mL/min；——进样量：25μL；——温度：20℃。电化学检测器扫描电位采用脉冲点位波形如见表1所示。表SEQ表\*ARABIC1检测波形时间/s电位/V(Ag/AgCl参比）积分0.000.1-0.200.1开始0.400.1结束0.41-2.0-0.42-2.0-0.430.6-0.44-0.1-0.50-0.1-流动相梯度洗脱程序如表2所示。表SEQ表\*ARABIC2高效阴离子色谱梯度洗脱程序时间/minA(%)B(%)C(%)D(%)-20.0010000-17.080002030.080002030.149501040.0305020046.03050200（溶液A:水;B:200mmol/LNaOH;C:1mol/LNaOAc-100mmol/LNaOH;D:10mmol/LNaOH）工作曲线绘制及样品测定对系列标准工作溶液进行离子色谱测定，使用保留时间定性，外标法定量。根据所配标准溶液的浓度及其响应峰面积，建立各单糖的标准工作曲线，相关系数不低于0.99。如样品浓度超出标准工作溶液浓度范围，则应稀释后再测定。按照离子色谱分析条件测定样品溶液，每个样品平行测试两次。待测样品应在72h内完成分析。数据处理试样中以干基计纤维素Wce，半纤维素Whe含量，数值以质量分数（％）表示，按式（1）、（2）计算：Wce=Cglu×Whe=C式中：Cglu——葡萄糖检测质量浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；Cgal——半乳糖检测质量浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；Cman——甘露糖检测质量浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；Cxyl——木糖检测质量浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；Cara——阿拉伯糖检测质量浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；0.9——葡聚糖、半乳聚糖和甘露聚糖脱水校正因子；0.88——木聚糖和阿拉伯聚糖脱水校正因子；V——定容体积，单位为毫升（mL）；F——定容后溶液稀释倍数；m0——称取试样质量，单位为克（g）；w——水分含量，单位为质量分数（%）；Wce——纤维素含量，单位为质量分数（%）；Whe——半纤维素含量，单位为质量分数（%）。3结果与讨论项目借鉴并对NY/T3494进行优化改进，以满足烟草基质要求，并提高标准可操作性。3.1仪器设备选择3.1.1检测仪器的选择及优化通过调研与实验发现NY/T3494两步酸解法推荐采用液相色谱-蒸发光散射或示差检测[23]，这两类检测器除稳定性、重现性差外[29]，检测灵敏度低，样品酸解液不能进行稀释，酸浓度较大，待测过程纤维素、半纤维素的酸解产物糖会进一步转化为糠醛等，影响检测结果的准确性。除上述两类设备外离子色谱利用其阴离子交换色谱柱对可溶性糖组分进行分离，脉冲安培检测器进行检测，无需衍生化，且方法灵敏度高，可实现对较低含量糖组分的定量检测[30]，是当前行业内外糖检测较常用手段。因此，项目组考察采用离子色谱法对酸解后的单糖进行分离检测。阴离子交换色谱柱CarbopacPA10，既有快速分离单糖的特点，又具有较好的色谱分离度保障。PA10色谱柱在pH0~14时均能稳定使用，实验选用该色谱柱进行方法开发。表SEQ表\*ARABIC3单糖25oC下的解离系数(pKa)单糖pKa（25oC)甘露糖12.08木糖12.15葡萄糖12.28半乳糖12.39阿拉伯糖12.43由于中性单糖的pKa值在12左右如表3所示，实际上是弱酸，在高pH条件下，它们能部分电离为阴离子并在阴离子交换柱上保留并分离。由于甘露糖和木糖、半乳糖和阿拉伯糖的pKa值很接近，因此考察了不同NaOH淋洗液浓度对这几个单糖的分离度以及峰形的影响，如图2所示。结果表明：当NaOH淋洗液浓度为20mmol/L时，除了阿拉伯糖，其他几个单糖几乎重叠在一起，分离度很差；当NaOH浓度为10mmol/L时，阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖可以完全分离，但是峰形较差，而木糖和甘露糖重叠成一个峰；当NaOH淋洗液浓度从5mmol/L降低至3mmol/L，各单糖的保留时间逐渐增加，并且木糖和甘露糖的分离度逐渐提高，当NaOH浓度为2mmol/L时，5种单糖峰形对称，并且达到了完全分离，且保留时间随着pKa值的增大而减小。因此，在后面的实验中，最终采用浓度为2mmol/L的NaOH洗脱液来分离单糖。图2洗脱液中NaOH浓度对单糖分离的影响（注：1为阿拉伯糖、2为半乳糖、3为葡萄糖、4为木糖、5为甘露糖）3.1.2酸解设备的选择NY/T3494两步酸解法[23]推荐采用灭菌锅加热方式进行纤维的酸解反应，考虑到灭菌锅在行业中普及率不高，项目组考查了烘箱加热的可行性。两步酸解采用灭菌锅加热方式进行纤维酸处理反应，由于反应结束后的降温过程（降至80℃）需要至少1.5h，实际的酸解反应时间很难确定，因此采用烘箱加热替代灭菌锅加热方式，考察加热时间对酸解反应的影响。烘箱加热方式下加热时间对纤维酸解单糖、纤维二糖得率的影响如图3所示：（注：图中显示的葡萄糖的量为其实际质量分数的1/10）图3加热时间对纤维酸解产物单糖和纤维二糖得率的影响结果表明：加热（酸解反应）时间对纤维单糖、纤维二糖得率的影响非常大：①当加热时间为15min时，葡萄糖平均得率为8.2%，木糖和甘露糖的平均得率分别为2.5%和1.0%，纤维二糖得率只有2.0%，说明普通加热15min过程中，纤维只有一部分酸解成纤维二糖和单糖。②随加热时间延长，纤维二糖和单糖的得率增加，当加热时间为60min时，纤维二糖的得率最大，而葡萄糖、木糖和甘露糖的得率分别为26.3%、6.5%和2.7%。③当加热时间进一步延长时，纤维二糖的得率快速下降，加热120min时，纤维二糖平均得率降至0.2%，同时，葡萄糖、木糖和甘露糖的得率分别上升至86.8%、7.5%和5.3%；说明在烘箱加热条件下，纤维需反应120min左右才能水解彻底。④与其他单糖相比，葡萄糖得率受加热时间影响更明显，当加热时间从60min增加到90min和120min时，其平均得率从26.3%分别增加至77.8%和86.8%，比其他单糖所需时间更长，这是由于纤维素结晶度高、抗水解性强，而其他单糖来源于具有无定形结构的半纤维素，与纤维素相比更容易水解。采用相对平均偏差分析了灭菌锅、烘箱加热方式下纤维酸解后单糖质量分数的差异，结果如表4所示：表4不同加热方式对纤维酸解后单糖结果的影响糖烘箱（%）灭菌锅（%）相对平均偏差%阿拉伯糖0.530.551.85半乳糖0.330.313.13葡萄糖77.0978.210.72木糖7.627.881.68甘露糖6.166.573.22结果表明：相对平均偏差结果＜5%，表明两种酸解方式的实验结果无显著性差异，采用烘箱替代灭菌锅加热可行。3.2前处理条件优化由于两步酸解法是将纤维素酸解成葡萄糖，半纤维素酸解成半乳糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖，再用离子色谱-电化学检测分析上述单糖来确定纤维素和半纤维素的含量，这就需要去除烟叶中原有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖等可溶性糖的干扰。同时，淀粉在酸作用下也会水解成葡萄糖，且烟草中淀粉的含量与纤维含量相当，对纤维素的测定产生了干扰，需在不影响纤维素、半纤维素的情况下去除淀粉。因此，项目组参考借鉴相关标准和文献，考察并优化不同溶剂及方式对可溶性糖、淀粉的去除效果。3.2.1可溶性糖干扰的去除通过文献调研发现，YC/T216-2013《烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》中采用25mL80%乙醇-饱和氯化钠溶液可洗去0.25g烟草样品中色素、糖类和醌类等化合物的干扰[25]。但通过前期实验发现样品经除色素、蛋白质干扰的两步萃取，剩余的骨架仅为原质量的40%～60%，为了提高检测的准确性，需加大样品称样量。因此，项目组借鉴YC/T216-2013对加大样品称样量后的萃取剂用量进行考察。称取A（烤烟）、B（白肋烟）、C（香料烟）、D（梗丝）样品各0.5g分别加入30mL、30mL、40mL、50mL80%乙醇-饱和氯化钠溶液超声30min，借鉴标准YC/T251-2008[33]检测萃取液中的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等可溶性糖总量，结果如表5所示：表5醇洗不同体积中可溶性糖含量样品不同萃取体积中可溶性糖含量（mg）20mL30mL40mL50mLA（烤烟）85.9123.6123.5123.6B（白肋烟）4.2C（香料烟）81.491.291.391.3D（梗丝）83.599.899.799.8由表5可知，不同类型烟叶中可溶性糖的量不一样，随着80%乙醇-饱和氯化钠溶液萃取体积的增加，可溶性糖溶解的量也增加，在体积为30mL以上时，四种不同类型烟叶的可溶性糖基本被萃出。因此，为保证不同样品可溶性糖完全去除干净，项目组选择40mL80%乙醇-饱和氯化钠溶液超声30min来去除可溶性糖的干扰。3.2.2淀粉干扰去除标准YC/T216-2013《烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》中采用高氯酸萃取淀粉，但是样品经过高氯酸处理后，样品呈糊状不利于后续抽滤等步骤，且在高浓度高氯酸环境下，纤维素、半纤维素有酸解可能，影响检测结果。通过文献调研发现[34-35]，能同时溶解直链、支链淀粉的溶剂，除高氯酸外，还有碱液、二甲基亚砜（DMSO）等。但淀粉在低浓度碱液中溶解性不佳，在高浓度碱液中又易发生降解。二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为C2H6OS，常温下为无色无臭的透明液体，具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，淀粉可溶于二甲基亚砜。但DMSO溶解淀粉时，淀粉易发生快速溶胀会阻止DMSO穿透整个淀粉颗粒，为提高淀粉在DMSO中的溶解性，使用DMSO溶解淀粉时需加入少量的水抑制淀粉颗粒凝胶层的形成，但是过量的水亦会阻止淀粉溶解，王瑞等[24]采用90%二甲基亚砜/水溶液50℃振荡萃取12h淀粉萃取率可达97.15%以上。项目组借鉴该方法，并验证、改进其在烟草中的应用效果。不同萃取方式对淀粉的萃取效果项目组根据文献，采用90%二甲基亚砜/水溶液50℃温度下振荡萃取12h条件下萃取烟叶中的淀粉，考察是否萃取完全，同时采用超声萃取的方式作为比较，考察两种萃取方式对于烟叶中淀粉的萃取效果。称取不同类型烟叶A（烤烟）、B（白肋烟）、C（香料烟）、D（梗丝）样品各0.5g于150mL具塞三角瓶中，先用80%乙醇-饱和氯化钠溶液除色素、糖等干扰物质，再加入90%二甲亚砜水溶液100mL，在50℃温度下振荡萃取4、8、12、16h，检测萃取液中淀粉含量，结果如表6所示。同时只改变上述实验条件萃取方式，采用超声萃取，萃取时间分别为2、4、6、8、10h，检测萃取液中淀粉含量，结果如表7所示：表6不同振荡萃取时间的淀粉测定值样品YC/T216测定值淀粉（%）4h8h12h16hA（烤烟）4.363.643.824.374.35B（白肋烟）0.900.770.880.890.87C（香料烟）6.254.855.436.246.30D（梗丝）1.050.861.091.051.07表7不同超声萃取时间的淀粉测定值样品YC/T216测定值淀粉（%）2h4h6h8h10hA（烤烟）4.363.454.164.334.404.37B（白肋烟）0.900.730.870.880.910.88C（香料烟）6.254.735.686.286.246.29D（梗丝）1.050.821.071.011.061.10结果表明：在50℃条件下，振荡萃取12h，能完全萃取不同类型烟叶样品中的淀粉，但是时间过长。同温度条件下A烤烟、C香料烟烟叶超声萃取6h，B白肋烟、D梗丝超声4h就完全萃取出烟叶中的淀粉，因此，项目组将改进采用超声萃取的方式来去除烟叶中的淀粉。不同萃取温度和萃取时间对淀粉的萃取效果在确定萃取烟叶中淀粉的萃取方式后，考察不同萃取温度55、60、65℃对淀粉的去除效果和对萃取时间的影响。称取A（烤烟）、B（白肋烟）、C（香料烟）、D（梗丝）样品各0.5g，不同温度下各5平行，加入100mL90%二甲亚砜水溶液，分三组，分别在55、60、65℃水浴温度条件下超声萃取1、2、3、4、5h，取萃取液，检测淀粉含量。结果见表8和图4。表8.不同温度和不同萃取时间下的淀粉测定值萃取剂温度(℃）超声萃取时间（h）淀粉（%）A（烤烟）B（白肋烟）C（香料烟）D（梗丝）5513.860.864.830.965524.040.875.761.035534.150.896.231.045544.370.886.241.035554.390.886.241.056014.070.884.861.036024.220.875.941.046034.370.886.231.056044.390.896.241.066054.380.886.241.066514.020.884.881.046524.240.886.021.046534.370.876.231.056544.360.886.241.066554.380.896.241.06图4.不同萃取温度萃取淀粉效果图结果表明：随着萃取温度的升高，不同类型的烟叶样品中淀粉的萃取时间缩短，且不同类型烟叶的完全萃取时间有所不同。白肋烟、梗丝中的淀粉由于其含量比较低，在较短的时间2h内就能被萃取完全。烤烟、香料烟在温度55℃时，需萃取4h完全萃取烟叶中的淀粉；在温度60、65℃时，需3h完全萃取烟叶中的淀粉。因此，项目组选择60℃、3.0h作为超声萃取参数。不同萃取体积对淀粉的萃取效果项目组进一步考察不同体积90%二甲基亚砜水溶液对淀粉的去除效果，在同一称样量（0.50g）条件下，称取A（烤烟）、B（白肋烟）、C（香料烟）、D（梗丝）样品，分别加入50、60、70、80mL90%二甲亚砜水溶液进行3.0h超声萃取，每种体积每个样品进行三平行实验，检测滤液和滤渣的淀粉含量，结果如表9、表10所示：表9.不同体积90%二甲亚砜滤液淀粉测定值萃取剂体积（mL）超声萃取时间（h）滤液淀粉（%）A（烤烟）B（白肋烟）C（香料烟）D（梗丝）5034.060.874.911.046034.120.895.971.057034.370.886.241.058034.390.886.231.04表10.不同体积90%二甲亚砜萃取后滤渣淀粉测定值萃取剂体积（mL）超声萃取时间（h）滤渣淀粉（%）A（烤烟）B（白肋烟）C（香料烟）D（梗丝）5030.32N.D1.32N.D6030.27N.D0.28N.D703N.DN.DN.DN.D803N.DN.DN.DN.D结果表明：随着萃取试剂体积的增大，干扰物质淀粉逐渐被去除；当用90%二甲亚砜溶液70mL，萃取3.0h以上时，不同类型烟叶中的淀粉已被完全萃取。样品滤渣已无淀粉检出，说明样品中的淀粉已被去除干净。因此，按所用试剂尽可能少及高效率的原则，本方法采用70mL90%二甲亚砜水溶液60℃温度下超声3.0h的方式来去除样品基体中淀粉的干扰。3.2.3酸解条件的优化在烟叶细胞壁中，纤维素、半纤维素通过化学键形成结构牢固的化合物，采用酸水解是解离纤维素和半纤维素的常用方法。本方法参考NY/T3494两步酸解法[23]，对浓酸、稀酸两步酸解过程中的酸浓度、酸解时间和酸解温度等关键影响因素进行优化。由于不同类型烟叶、烟梗、薄片样品经去除色素、糖、淀粉后，样品的基质差别基本被消除，剩余的骨架进入酸解过程，而薄片样品的纤维素、半纤维素含量较烟叶高，因此选择薄片样品来开展酸解条件部分的优化。浓酸酸解酸度考察第一步浓酸酸解过程的酸浓度对于细胞壁的打开，纤维素、半纤维素的解离起着关键性的作用，因此分别采用2mL65%、70%、72%、75%、80%硫酸溶液进行酸解，其他不变（浓酸常温阶段：30℃水浴条件下酸解2小时；稀酸高温阶段：烘箱120℃条件下酸解2小时）结果如表11和图5所示：表11不同酸度对纤维素、半纤维素测定结果的影响硫酸浓度（%）纤维素（%）半纤维素（%）6518.696.627019.026.777219.956.877518.936.108017.325.05图5不同酸度对纤维素、半纤维素测定结果的影响由图表可知：当酸度从65%升到72%时，纤维素、半纤维素的值缓慢升高，且在72%浓度时，纤维素、半纤维素的值达到最大值；在当酸度由75%升到80%时，二者都呈现下降趋势，这是由于酸度过高易造成纤维素的炭化，造成纤维素、半纤维素结果偏低。通过本实验确定72%硫酸溶液为合适的酸解浓度。浓酸酸解温度考察为考察浓酸常温过程温度对纤维素、半纤维素结果的影响，样品加入2mL72%硫酸溶液后分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃水浴条件下进行酸解，结果如表12和图6所示：表12浓酸酸解温度对纤维素、半纤维素测定结果的影响72%硫酸酸解温度（℃）纤维素（%）半纤维素（%）2518.876.153019.956.513518.646.064017.375.334517.305.15图6浓酸酸解温度对纤维素、半纤维素测定结果的影响由图表可知：随着酸解温度从25℃升到30℃，纤维素、半纤维素呈微量增长趋势；酸解温度30℃条件下，纤维素、半纤维素的结果最大；当酸解温度升到35℃，40℃，45℃时，则出现明显下降趋势；实验过程中也发现，当酸解温度升到40℃后，样品体系颜色明显变深，出现结团不均匀现象，过高温度可能导致烟叶样品炭化，从而引起纤维素、半纤维素结果的偏低。因此选择30℃作为浓酸酸解温度条件。浓酸酸解时间考察为选择浓酸常温过程合适的酸解时间，样品加入2mL72%硫酸溶液后分在30℃水浴条件下分别进行1.0、1.5、2.0、2.5、3.0小时酸解，结果如表13和图7。表13浓酸酸解时间对纤维素、半纤维素测定结果的影响72%硫酸酸解时间（h）纤维素（%）半纤维素（%）1.014.974.801.516.456.202.019.346.752.517.676.173.016.195.68图7浓酸酸解时间对纤维素、半纤维素测定结果的影响由图表可知：酸解时间从1.0h增加到2.0h，纤维素、半纤维素呈逐渐增加趋势，2.0h数值最大，超过2.0h则呈现明显下降趋势。说明，在酸解时间2.0h为合适时间，酸解时间过短，则纤维素、半纤维素未完全酸解，酸解时间过长，超过2.0h则酸解的单糖进一步的损失，导致了测量结果偏低。由此选择2.0h作为浓酸酸解时间。稀酸酸解温度考察为考察稀酸高温过程温度对纤维素、半纤维素结果的影响，将浓酸常温酸解后样品稀释后分别在110℃、115℃、120℃、125℃、130℃烘箱条件下进行酸解，结果如表14和图8所示：表14稀酸酸解温度对纤维素、半纤维素测定结果的影响烘箱酸解温度（℃）纤维素（%）半纤维素（%）11016.405.6911519.545.9912019.846.2612519.546.0913018.085.55图8稀酸条件下酸解温度对纤维素、半纤维素测定结果的影响由图表可知：烘箱温度从110℃升到120℃，纤维素、半纤维素的数值逐渐升高，且120℃时纤维素、半纤维素数值达到最大；110℃则酸解时间不够，酸解不完全；而125℃时，酸解温度过高，酸解的单糖进一步的损失，导致了测量结果偏低。因此选择120℃作为稀酸酸高温温度条件。稀酸酸解时间考察为考察稀酸高温过程酸解时间的影响，样品浓酸常温酸解稀释后，分在120℃烘箱条件下分别进行1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h酸解，结果如表15和图9所示：表15稀酸酸解时间对纤维素、半纤维素测定结果的影响烘箱酸解时间(h)纤维素（%）半纤维素（%）1.012.324.531.519.185.942.020.056.872.519.526.583.019.616.54图9稀酸条件下酸解时间对纤维素、半纤维素测定结果的影响由图表可以得出：酸解时间在1.0-2.0h时纤维素、半纤维素的数值逐渐升高，在2.0h时纤维素、半纤维素达到最大值；1.0-1.5h则酸解时间不够，酸解不完全；而2.5h时，酸解时间过长，酸解的单糖进一步的损失，导致了测量结果偏低。因此选择2.0h作为稀酸酸高温时间条件。综上所述两步酸解的最优条件为：72%硫酸在30℃水浴条件下酸解2小时；加水稀释酸度降低后，在烘箱120℃条件下酸解2小时。3.3待测液稳定性本部分采用JJF1343-2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》[28]中有关稳定性研究方法对检验数据进行评估。取95%的置信区间，若|b1|<t0.95,5×s(b1)，说明样品的浓度对时间变量无明显差异，样品稳定性良好。为考察样品前处理后待测溶液的稳定性，将待测液在室温放置在0、3、6、9、18、36、72h后进样。不同时间进样后的测定结果如表16所示：结果表明，72h内样品待测液中纤维素、半纤维素稳定性良好。表16样品待测溶液稳定性考察放置时间（h）样品待测液（%）纤维素半纤维素测定结果018.846.59318.616.53619.246.74918.976.791818.526.663619.416.727218.706.54统计结果RSD（%）1.751.54斜率，b1-0.001-0.003b018.906.67斜率不确定度，s（b1）0.020.69统计临界值，t0.95,52.572.57t0.95,5×s（b1）0.041.77|b1|<t0.95,5×S（b1）通过通过3.4方法验证3.4.1线性关系考察准确称取糖标准样品（阿拉伯糖8mg、半乳糖12mg、葡萄糖70mg、木糖7mg、甘露糖10mg，精确至0.1mg），用配制好的硫酸稀释液溶解，然后转移至250mL容量瓶内定容，配制成糖混合标准一级母液。用移液管分别移取100μL、200μL、400μL、800μL、1600μL至100mL容量瓶，用配置好的硫酸稀释液定容于100mL容量瓶中，配制成标准工作溶液，即配即用。将系列标准溶液在相同条件下分别进样后，所得的谱图以及各单糖的定性见图10，按时间顺序分别为：阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，木糖，甘露糖。以糖的浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，得到相应的线性方程以及相关系数，并且根据三倍信噪比(S/N=3)计算仪器检出限。其线性关系和检出限如表17、18所示。结果表明：各种糖具有非常好的线性关系，相关系数R2≥0.999，检出限0.0022mg/L-0.0046mg/L。图10单糖混标溶液的离子色谱图（注：1.阿拉伯糖；2.半乳糖；3.葡萄糖；4.木糖；5.甘露糖；）图11葡萄糖线性关系图表17线性关系、相关系数、检出限、定量限标准品线性回归方程相关系数（R2）检出限（μg/mL）定量限（μg/mL）阿拉伯糖y=3.273x-0.011070.99980.00220.0073半乳糖y=3.6158x-0.03140.99980.00360.0120葡萄糖y=4.4229x+0.06240.99980.00460.0153木糖y=4.0952x+0.00480.99970.00420.0140甘露糖y=2.3196x-0.02660.99900.00220.0073表18纤维素、半纤维素检出限、定量限指标检出限（%）定量限（%）纤维素（以葡萄糖计）0.020.07半纤维素（以木糖计）0.020.063.4.2样品重复性用四种不同类型烟叶考察本方法的日内和日间重复性，每天5个平行测定，连续测定5天，结果如表19、表20所示：表19纤维素日内、日间重复性样品时间12345日内平均值（%）日内RSD（%）日间平均值（%）日间RSD（%）A烤烟第一天6.266.056.396.386.226.262.226.292.64第二天6.136.546.316.216.386.312.51第三天6.346.486.252.48第四天6.245.956.046.126.016.071.85第五天6.366.556.496.636.646.531.76B白肋烟第一天6.566.456.396.686.226.462.696.521.98第二天6.436.846.616.716.586.632.30第三天6.376.596.816.546.446.552.58第四天6.546.056.346.526.216.333.29第五天6.636.536.796.836.416.642.65C香料烟第一天6.256.376.676.446.626.472.706.342.83第二天6.146.486.166.276.496.312.68第三天6.396.596.726.636.556.581.85第四天6.476.266.076.116.286.242.54第五天16.086.076.131.06D梗丝第一天11.5311.7311.7611.3811.9411.671.8611.471.24第二天11.1211.3911.2411.5911.6611.402.00第三天11.3711.6411.8011.5311.4611.561.44第四天11.3211.2111.1911.3811.4711.311.04第五天11.2511.4411.3711.4511.5211.410.90表20半纤维素日内、日间重复性样品时间12345日内平均值（%）日内RSD（%）日间平均值（%）日间RSD（%）A烤烟第一天2.642.502.692.712.622.633.132.543.39第二天2.612.702.682.562.562.622.51第三天2.442.392.412.542.482.452.44第四天2.432.552.382.422.512.462.84第五天2.462.552.492.632.622.552.97B白肋烟第一天2.422.242.372.322.342.342.832.354.36第二天2.412.422.412.382.512.432.10第三天2.372.492.432.542.442.452.62第四天2.432.352.444.21第五天2.122.372.193.47C香料烟第一天2.492.592.622.522.612.572.252.602.58第二天2.452.612.482.562.522.522.52第三天2.692.732.662.712.692.700.97第四天2.472.672.622.582.562.582.89第五天2.552.762.582.642.662.643.08D梗丝第一天4.974.975.124.884.904.971.935.173.19第二天5.025.115.011.23第三天5.375.265.2361.29第四天5.124.985.055.135.355.132.71第五天5.255.445.375.455.525.411.89由表可知，测得纤维素日内、日间RSD≤2.83％、半纤维素的日内、日间RSD≤4.36％，说明本方法具有较好的重复性。3.4.3回收率实验取不同类型烟草样品分别加入高、中、低微晶纤维素、木聚糖按上述相关步骤分别进行5个平行加标实验，结果如表21、表22所示，结果表明：微晶纤维素的回收率96.5-103.4%、RSD0.82-2.23%，木聚糖的回收率96.2-104.3%，RSD0.91-2.69%，说明方法的回收率和精密度良好。表21纤维素回收率及精密度（n=5）样品样品纤维素含量（mg）加入微晶纤维素量（mg）回收率（%）RSD（%）A（烤烟）31.915.498.3~101.21.2530.897.7~100.31.1461.698.2~101.61.36B（白肋烟）32.915.497.5~103.42.2330.898.3~99.20.8261.696.5~100.61.60C（香料烟）31.715.497.4~100.41.2830.897.8~102.71.8961.697.1~100.61.38D（梗丝）57.425.696.6~101.51.8751.298.6~102.41.51102.497.5~100.81.31表22半纤维素回收率及精密度（n=5）样品样品半纤维素含量（mg）加入木聚糖量（mg）回收率%RSD%A（烤烟）12.75.296.3~101.52.1610.496.5~100.91.7020.897.8~99.70.91B（白肋烟）11.85.297.1~104.32.6910.497.4~101.81.6420.898.5~102.81.71C（香料烟）13.25.296.2~102.52.3610.497.8~100.81.1520.898.6~101.21.16D（梗丝）25.410.497.5~102.11.7520.898.8~103.61.9541.698.2~101.51.303.5共同实验项目组分别在福建中烟工业有限责任公司、上海烟草集团有限责任公司、郑州烟草研究院、湖南中烟工业有限责任公司、重庆中烟工业有限责任公司、浙江中烟工业有限责任公司、内蒙古昆明卷烟有限责任公司等7个实验室进行了方法的验证比对实验。实验样品共选用了8种不同类型的烟草样品：其中1号为烤烟、2号梗丝、3号薄片、4号香料烟、5号白肋烟、6号雪茄烟、7号烤烟型成品卷烟、8号混合型成品卷烟。每个实验室分别按照本方法进行样品前处理和检测，得到该实验室的结果，结果见表23、表24。由表可见：7家实验室的8个样品的检测结果RSD均在10%以内，表明各实验室间数据比对良好。表23不同实验室纤维素检测结果和统计处理数据表（单位%）样品编号实验室1实验室2实验室3实验室4实验室5实验室6实验室7平均值RSD16.726.746.897.557.156.876.786.964.30211.9011.6312.5012.4912.0111.3911.8511.973.45318.9918.4619.3319.3618.5118.2618.5818.792.3546.446.386.507.266.366.126.736.545.5656.546.156.556.796.146.096.326.374.1567.086.957.277.466.286.066.706.837.5376.936.606.757.466.656.386.776.795.0287.307.307.417.717.046.697.007.214.58表24不同实验室半纤维素检测结果和统计处理数据表（单位%）样品编号实验室1实验室2实验室3实验室4实验室5实验室6实验室7平均值RSD12.812.922.923.012.922.932.842.912.3124.945.245.654.925.135.3036.496.446.786.476.413.0542.602.852.882.882.702.682.682.754.1552.852.392.562.532.242.322.292.468.6662.712.762.692.632.312.292.562.567.4772.682.772.632.782.542.482.512.634.6282.823.052.952.962.832.772.842.893.354结论项目最终确定的检测步骤为：准确称取样品0.5g于50mL离心管中，采用40mL80%乙醇-饱和氯化钠溶液去除可溶性糖等干扰，用70mL90%二甲亚砜溶液去除淀粉等干扰物质，加入2mL72％硫酸溶液30℃水浴解聚2.0h，再加入56mL水稀释后于120℃烘箱中酸解2.0h，稀释定容后，采用离子色谱法测定酸解液中的单糖，以葡萄糖浓度计算纤维素含量，以半乳糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的浓度计算半纤维素含量。本方法各种糖的线性良好，R2＞0.999，检出限0.0022mg/L-0.0046mg/L，满足检测要求；纤维素含量的日内、日间RSD≤3.29％，半纤维素含量的日内、日间≤4.36％，均小于5%，重复性好；微晶纤维素的回收率96.5-103.4%%、木聚糖的回收率96.2-104.3%，准确度高；可作为行业标准在烟草系统内推广使用。参考文献张力田．碳水化合物化学[M]．北京:轻工业出版社，1988,66．王瑞新.烟草化学[M].北京:中国农业出版社,2003.于建军.卷烟工艺学[M].北京:中国农业出版社,2003,13-23.左天觉.烟草的生产、生理和生物化学[M].朱尊权,等.译.上海:上海远东出版社,1993:371-373.李兴波,闫克玉,丁海燕,等.河南烤烟(40级)细胞壁物质含量及其规律性研究[J].郑州轻工业学院学报,1999,14(3):27-30.闫克玉,闫洪洋,李兴波,等.烤烟烟叶细胞壁物质的对比分析[J].烟草科技,2005(10):6-11.蒲俊,刘彦岭.烤烟纤维素含量与烟叶品质的相关性研究[J].中国农业文摘:农业工程,2019,31(2):67-70.刘晓冰,孟霖,梁盟,等.武陵山区烤烟上部叶片纤维素、木质素含量与质量指标间相关性研究[J].中国农学通报,2015,31(7):235-240.张槐苓,葛翠英,穆怀静,等.烟草分析与检验[M].郑州:河南科学技术出版社,1994:103-111.郭小义,戴云辉,郭紫明,等.应用纤维素测定仪测定烟草中的纤维素[J].烟草科技,2009(1):43-46.廖臻,王岚,蒋次清,等.烟草中总细胞壁物质含量的测定方法[P].中国:CN102221512A,2011-10-19.杨蕾,陶自伟,潘纯祥,等.超声和酶解除杂质法测定烟草中总细胞壁物质含量[J].中国烟草学报,2016,22(2):108-114.尚军,吕祥敏,王鹏,等.流动分析法测定烟草中的纤维素[J].烟草科技,2012(7):40-42.张红漫,郑荣平,陈敬文,等.NREL法测定木质纤维素原料组分的含量[J].分析实验室,2010,29(11):15-18.张文博,贺建龙,蒋浩,等.木质纤维物质中纤维素和半纤维素含量的测定[J].江苏农业科学,2017,45(5):281-284.刘永刚,冉宜骏,高铭泽,等.桑叶中纤维素和木质素含量的测定[J].饲料研究,2019，42(7):58-60.王倩,宋晓霞,周帅,等.食用菌栽培基质中木质纤维素组分测定方法的建立[J].食用菌学报,2019,26(4):100-106.SchlotzhauerWS，SchmeltzI，HickeyLC.Pyrolyticformationofphenolsfromsomehighmolecularweighttobaccoleafconstituentsandrelatednon-tobaccomaterials[J].TobaccoScience，1967,11:31-34.SchlotzhauerWS，ChortykOT，HigmanHC，etal.Pyrolyticstudiesonfractionssequentiallyextractedfromtobacco[J].TobaccoNewYork，1969,13:153-155.SchlotzhauerWS，ChortykOT.Pyrolyticstudiesontheoriginofphenoliccompoundsintobaccosmoke[J].TobaccoScience,1981,25(6):6-10.ZaneA，WenderSH.Pyrolysisproductsofrutin,quercetin,andchlorogenicacid[J].TobaccoScience,1963,7:21-23YC/T347-2010烟草及烟草制品中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸洗木质素的测定洗涤剂法[S].NY/T3494-2019农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定[S].王瑞，田耀旗，谢正军.玉米淀粉在DMSO/水体系中溶解性与精细结构变化[J].食品与机械,2017(3):27-30.YC/T216-2013烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法[S]．郭小义,戴云辉,郭紫明,等.应用纤维素测定仪测定烟草中的纤维素[J].烟草化学，2009(1)：43-46.孔兰芬，侯英，潘纯祥,等.重铬酸钾氧化-连续流动法测定烟草中纤维素含量[J].江西农业学报,2018,30(6):71-74.JJF1343-2022标准物质的定值及均匀性、稳定性评估[S].RfelliG，SartiniE．Characterisationofbrewpubbeercarbohydratesusinghighperformanceanionexchangechromatographycoupledwithpulsedamperometricdetection[J].FoodChemistry,2014,142(1)：152-158．石彩玲,田侠,孙一鸣,等．离子色谱一脉冲积分安培法同时测定甘薯中10种可溶性糖组分[J].中国食品学报，2023,23(9)：324-328．SluiterA，HamesB，RuizR，etal.Determinationofstructuralcarbohydratesandlignininbiomass［R］.Golden：NationalRenewableEnergyLaboratory，2008.SluiterJB，RuizRO，ScarlataCJ，etal.Compositionalanalysisoflignocellulosicfeedstocks.1.Reviewanddescriptionofmethods［J］.JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2010，58（16）：9043-9053.YC/T251-2008烟草及烟草制品葡萄糖、果糖、蔗糖的测定离子色谱法[S]赵冰，庞字辰，梁焕秋，等．淀粉结构研究技术进展[c]/“食品工业新技术与新进展”学术研讨会暨2014年广东省食品学会年会论文集．广州：广东省食品学会，2014：4．杨小雨,刘正辉,李刚华,等.高效液相体积排阻色谱法测定稻米支链淀粉链长的相对分子质量分布[J].中国农业科学,2013(16):3488-3495．

《烟草及烟草制品主要大分子物质的测定》第2部分木质素目录TOC\o"1-4"\h\z\u1概述 11.1项目背景 11.2国内外研究情况 11.3项目主要研究内容和技术路线 31.3.1项目主要研究内容 31.3.2技术路线 42烟草及烟草制品中木质素含量的两步酸解测定方法 42.1适用范围 42.2实验部分 42.2.1方法原理 42.2.2试剂与溶液 52.2.3仪器设备 52.2.4样品前处理 6样品制备 6醇洗 6二甲亚砜洗 6两步酸解 7抽滤定容 72.2.5测试 7酸溶木质素测试 7酸不溶木质素测试 72.2.6结果的计算与表述 7结果计算 7结果表述 83结果与讨论 93.1前处理的优化 93.1.1色素干扰的去除 93.1.2蛋白质干扰的去除 10萃取剂的选择 10萃取温度的选择 11萃取剂用量/萃取时间的选择 113.1.3酸解条件的优化 12浓酸酸解酸度考察 12浓酸酸解温度考察 13浓酸酸解时间考察 14稀酸酸解温度考察 15稀酸酸解时间考察 16酸解条件优化结果 173.1.4标准溶液储备液和样品溶液稳定性考察 17标准溶液储备液稳定性考察 17前处理后样品溶液稳定性考察 183.2方法验证 193.2.1酸溶木质素标准曲线 193.2.2木质素检测的重复性考察 193.2.3酸溶木质素回收率考察 203.2.4不同实验室间比对实验 214总结 22参考文献 23烟草及烟草制品主要大分子物质的测定第2部分木质素1概述1.1项目背景大分子是指分子量在5000以上的生物学物质，烟草大分子物质主要有纤维素、半纤维素、木质素、果胶、淀粉、蛋白质，占烟叶重量30%左右。烟草木质素是烟草细胞壁的重要组成成分，在烟叶调制过程不断发生降解，是影响烟叶原料质量的关键指标之一[1-3]。在卷烟抽吸过程中，木质素通过燃烧和热裂解产生的脂肪族小分子醛类、乙酸、苯酚、一氧化碳、稠环芳烃等小分子化合物，是卷烟焦油中稠环芳香类、芳香胺和酚类等有害物质的主要来源，对卷烟的安全性有重要影响[4,5]。同时，木质素对感官质量的影响具有两面性，在烟叶的调制和醇化阶段，烟草中的木质素通过生化降解，产生一系列芳香族小分子致香成分，对烟草的吸食品质具有正面的影响；木质素也是一些香味化合物的前提物，抽吸过程中产生的香兰素、苯甲醇等香味化合物，对卷烟感官评吸效果产生有益影响；同时卷烟抽吸过程中，烟草木质素热裂解生成的酚类和脂肪族小分子醛类等物质，则带来刺激、涩口的吃味，是影响烟草内在品质的不利因素。木质素含量越高，产生的青杂气息、烧纸味越重[6-8]。综上所述，烟草中的木质素是影响烟叶原料质量、感官品质的重要物质，对烟草中木质素进行准确测定并深入研究有利于卷烟产品质量的提升。1.2国内外研究情况（1）烟草木质素简介烟草木质素是烟草细胞壁的重要组成成分，与纤维素、半纤维素共同构建形成了烟草植株的骨架[2]。烟草木质素与半纤维素以共价键结合，具有加固细胞壁机械强度，提高细胞运输能力，增强烟株抗倒伏性以及抵御病原菌微生物侵害等生物学功能。闫克玉[8]等研究发现：同一产区同一品种烟叶，木质素含量随烟叶部位的升高而降低，下部叶最高，中部居中，上部的最低，可能是由于下部烟叶所处的生长环境差，光合积累的营养物质较少，而且在烟叶成熟过程中一部分营养物质被输送至中部叶和上部叶，致使木质素等细胞壁物质含量高。邓宇[5]等研究也表明木质素含量影响卷烟香气质、刺激性、杂气，随着木质素含量降低，香气质明显提升，杂气、刺激降低，但其与劲头不具有明显相关性。因此，无论是从烟叶质量评价，还是从卷烟的烟气改善、降焦减害，甚至加热卷烟设计等方面出发，准确测定烟草中木质素含量具有十分重要的意义。（2）木质素结构木质素结构是复杂的有机聚合物，其在维管植物和一些藻类的支持组织中形成重要的结构材料，在木本植物中，木质素占25%，是世界上第二位最丰富的有机物（纤维素是第一位）[9]。由于自然界中木质素与纤维素、半纤维素等往往相互连接，形成木质素-碳水化合物复合体（Lignin-CarbohydrateComplex），故目前没有办法分离得到结构完全不受破坏的原本木质素。木质素（图1）由一系列碳碳键和碳氧键形成三维网状构成，结构上主要由三种羟基苯丙烷单体（图2），即愈创木基丙烷（G基）、紫丁香基（S基）、对羟苯基丙烷（H基）经酶脱氢聚合形成[9]。在烟草植物体内，木质素与纤维素、半纤维素之间通过氢键、共价键等复杂形式结合在一起，这造成了对木质素的分离和准确测定极具挑战性。图1木质素结构图2木质素的三种主要单体结构（3）木质素检测技术进展木质素的测定方法有Klason法、紫外分光光度法、红外光谱定量分析法和核磁共振法等[10-17]；烟草行业采用的标准方法《烟草及烟草制品中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸洗木质素的测定洗涤剂法》[18]，是改进后的Klason法，该方法先用酸性洗涤剂去除糖类、蛋白质、半纤维素及脂肪等成分后，再以72％的硫酸处理，最后测定未溶于酸的木质素含量，由于未测定酸处理过程溶于酸的木质素含量，导致该法测得结果偏小，无法反映木质素的实际含量[19]。同时该方法应用过程中存在：所用试剂高达13种(含高毒苯、易制毒丙酮和若干非常规试剂)，环保安全性低、使用受限；操作过程繁琐(多次回流、洗涤、称重)、实验周期较长(16小时/批次)、无法批量测定（每批4个样）。《农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定》（NY/T3494-2019）[13]等标准是基于两步酸解法进行前处理，可以准确测定农作物秸秆木质素含量、操作简单、环保安全；但由于烟草中的蛋白质含量较高[19]，干扰酸溶木质素的测定，因此该标准无法直接适用于烟草基质。综上所述，木质素是影响烟叶质量和感官评吸的重要指标之一，在行业中有较大、较迫切的检测需求。因此，项目组拟采用NY/T3494[13]的方法原理，在去除烟草基质中色素、蛋白质等干扰物质的基础上，采用两步酸解法进行前处理，即采用浓硫酸在常温下将木质素解聚，酸度降低后在高温条件下将木质素进一步降解、转化，建立适用于烟草及烟草制品中木质素含量检测的方法标准，为烟叶原料和卷烟产品的品质提升提供技术支撑。1.3项目主要研究内容和技术路线1.3.1项目主要研究内容1、通过相关文献调研和前期预研，拟定以两步酸解法为前处理方法，灰分法测定酸不溶木质素、紫外分光光度法测定酸溶木质素，两者加和得到烟草中木质素的总量。2、对烟草和烟草制品同时进行分析和验证，开展参数优化与评价，具体包含：（1）在样品前处理环节：摸索烟草中的色素、蛋白质等干扰去除手段；（2）在两步酸解环节，优化酸度、温度和时间等酸解条件；（3）开展方法评价、行业实验室间比对，拟定标准征求意见稿。1.3.2技术路线在前期研究工作的基础上，确立的项目技术路线如图3所示：酸溶木质素酸溶木质素方法重复性方法验证方法精密度方法线性关系建立烟草木质素检测方法调研与选择前处理方法优化基质干扰的去除调研与选择检测方法改进酸不溶木质素图3项目的技术路线2烟草及烟草制品中木质素含量的两步酸解测定方法2.1适用范围本方法规定了烟草及烟草制品中主要大分子物质木质素含量的两步酸解测定方法。本方法适用于烟草及烟草制品中主要大分子物质木质素含量的测定。2.2实验部分2.2.1方法原理试样依次采用80%乙醇-饱和氯化钠溶液去除色素、90%二甲亚砜-水溶液去除蛋白质等干扰后，加入72%硫酸溶液解聚，加水稀释，高温酸解，抽滤分离。滤液采用紫外分光法测定酸溶木质素，滤渣经干燥、灰化，采用质量法测定酸不溶木质素。2.2.2试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯及以上的试剂，以及符合GB/T6682规定的一级水。水应为蒸馏水或至少应达到GB/T6682三级水的水平。木质素，纯度≥99%。无水乙醇。浓硫酸，98%（质量分数）。二甲基亚砜。氯化钠。80%乙醇-饱和氯化钠水溶液：称取64g氯化钠于1000mL烧杯中，加入200mL水溶解后，再加入800mL无水乙醇，混匀，加盖静置，待溶液澄清后过滤。90%二甲基亚砜-水溶液：移取900mL二甲基亚砜于1000mL容量瓶，用水定容。72%硫酸溶液：移取174mL水于1000mL烧杯中，缓缓加入326mL98％浓硫酸，搅拌，冷却。0硫酸稀释液：移取1.6mL72%硫酸溶液于1000mL容量瓶，用水定容。1酸溶木质素标准储备液：准确称取木质素标样100mg（精确至0.1mg）于100mL烧杯中，用硫酸稀释液溶解，转移至100mL容量瓶定容，得到浓度为1mg/mL酸溶木质素标准储备液，于4℃避光条件下，有效期为1个月。2酸溶木质素系列工作标准溶液：分别移取200、400、600、800、1000μL酸溶木质素标准储备液于100mL容量瓶，用硫酸稀释液定容，配制成酸溶木质素系列标准工作液，即配即用。2.2.3仪器设备紫外分光光度计。分析天平，感量0.1mg。超声波发生器，可加热控温，频率37/40KHz。离心机，适用50mL离心管，转速不低于4000r/min。防爆烘箱。马弗炉。恒温水浴锅。抽滤装置。布氏漏斗。0滤布，尼龙网，500目。1G4玻璃砂芯坩埚，30mL。2容量瓶，10mL、100mL、250mL、500mL、1000mL。3定量加液器或移液管。4具塞锥形瓶，150mL。5离心管，50mL。6玻璃棒。7耐压玻璃管，110mL，耐压强度不小于0.6MPa。8干燥器。9烧杯，100mL、1000mL。2.2.4样品前处理样品制备按YC/T31《烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法》制备试样，并测定其水分含量。醇洗准确称取试样0.5g（质量记为m0）于50mL离心管中，加入40mL80%乙醇-饱和氯化钠水溶液，超声30min后4000r/min离心5min，弃上清液，得醇洗试样。二甲亚砜洗将经醇洗后的试样用70mL90%二甲亚砜-水溶液冲洗至150mL锥形瓶，60℃超声3h。采用布氏漏斗和滤布抽滤，滤渣依次用水、无水乙醇各洗涤三次（每次约10mL），弃滤液，滤渣晾干后转移至110mL耐压玻璃管。两步酸解在装有滤渣的耐压玻璃管中加入2.0mL72%硫酸溶液，玻棒搅匀，置于30℃恒温水浴锅酸解2h。水浴酸解后，在耐压玻璃管中缓慢加入56mL水，旋紧盖子，置于120℃烘箱中酸解2h，取出冷却。抽滤定容冷却后的酸解液经G4玻璃砂芯坩埚抽滤（抽滤前，坩埚预先在575℃马弗炉中灼烧至恒重），用90～100℃热水清洗耐压玻璃管和滤渣至少3次，坩埚带滤渣待处理。所得滤液转移至250mL容量瓶，冷却至室温后用水定容。准确移取2.0mL于10mL容量瓶，用水定容待测。2.2.5测试酸溶木质素测试采用紫外分光光度计在205nm波长下测定标准工作溶液和试样溶液的吸光值[11]，外标法进行定量。根据所配标准溶液的浓度及其吸光值，建立标准工作曲线，线性相关系数不低于0.99。若样品浓度超出标准工作溶液浓度范围，则稀释后测定。待测液24h内测试完成。酸不溶木质素测试将带滤渣的坩埚置于烘箱，在105℃条件下烘3h～4h至恒重[13]，移至干燥器内冷却至室温后准确称量，坩埚和滤渣总质量记为m1。将烘干后带滤渣的坩埚置于马弗炉中，在575℃条件下灼烧至少3.0h[13]，直至所有有机物被灰化。灰化结束后降温至105℃，取出坩埚放入移至干燥器内冷却至室温后准确称量，坩埚和灰分的总质量记为m2。2.2.6结果计算与表述结果计算.1酸溶木质素试样中以干基计酸溶木质素含量，以质量分数（%）表示，按式（1）计算：ASL=A×V×Dm0×10式中：ASL——试样中酸溶木质素含量，单位为质量分数（%）；m0——称样量，单位为克（g）；A——滤液中酸溶木质素浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——滤液定容体积，单位为毫升（mL）；D——滤液定容后溶液的稀释倍数；w——试样水分含量，单位为百分数（%）。.2酸不溶木质素试样中以干基计酸不溶木质素含量，以质量分数（%）表示，按式（2）计算：AIL=(m1式中：AIL——试样中酸不溶木质素含量，单位为质量分数（%）；m0——称样量，单位为克（g）；m1——玻璃砂芯坩埚和酸不溶残渣的质量，单位为克（g）；m2——玻璃砂芯坩埚和灰分的质量，单位为克（g）；w——试样水分含量，单位为百分数（%）。.3木质素总量试样中木质素总含量，以质量分数（%）表示，按式（3）计算：Lig=ASL+AIL………（3）式中：Lig——试样中木质素总含量，单位为质量分数（%）；ASL——试样中酸溶木质素含量，单位为质量分数（%）；AIL——试样中酸不溶质素含量，单位为质量分数（%）。结果表述取两次平行测定结果平均值作为最终测试结果，精确至0.01%。两次平行测定结果相对平均偏差不应大于10%。3结果与讨论3.1前处理的优化3.1.1色素干扰的去除烟草中含有植物色素等，对酸溶木质素的紫外测定产生干扰，此外糖类、脂类等物质也影响后续的抽滤过程。通过文献调研发现，YC/T216-2013《烟草及烟草制品淀粉的测定连续流动法》采用25mL80%乙醇-饱和氯化钠溶液可洗去0.25g烟草样品中色素、糖类和醌类等化合物的干扰[20]。但通过前期实验发现样品经除色素、除蛋白质干扰两步萃取除去可溶物，剩余的骨架大约在40%～60%，为了提高检测的准确性，需加大样品称样量。因此，项目组借鉴YC/T216-2013对加大样品称样量后的萃取剂用量进行考察。称取0.5g试样，分别加入20mL、30mL、40mL、50mL80%乙醇-饱和氯化钠溶液，超声萃取30min。分别再加入30mL、20mL、10mL、0mL80%乙醇-饱和氯化钠溶液，混匀过滤后准确移取1mL用80%乙醇溶液-饱和氯化钠稀释定容到100mL，采用紫外分光光度计测定其在205nm下的吸光值A0，结果如表1、图4所示：表1不同萃取体积的选择样品吸光值A020mL30mL40mL50mLA(烤烟)0.38550.53710.54070.5432B(白肋烟)0.42170.57160.57680.5820C(香料烟)0.38060.52090.52060.5254D(梗丝)0.32940.37840.37820.3791图4不同萃取体积的选择结果表明：随着萃取试剂体积的增大，萃取液的吸光值逐渐升高；当萃取剂体积达30~50mL，萃取液的吸光值趋于稳定。因此，项目组采用40mL80%乙醇-饱和氯化钠溶液超声的条件去除样品中色素等干扰。3.1.2蛋白质干扰的去除萃取剂的选择由于烟草蛋白质等组分在200~220nm附近有紫外吸