2-农业行业标准《枣及制品中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的测定  高效液相色谱法》（征求意见稿）

ICS FORMTEXT67.080.10FORMTEXTCCSB31FORMTEXT     FORMTEXTNYFORMTEXTNY/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXXFORMTEXT     FORMTEXT枣及制品中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的测定高效液相色谱法FORMTEXTDeterminationofcyclicadenosinemonophosphateandcyclicguanosinemonophosphateinjujubeanditsproductsbyhighperformanceliquidchromatoraphicmethodFORMTEXTFORMDROPDOWNFORMTEXT（本稿完成日期2025年12月07日）FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施FORMTEXT中华人民共和国农业农村部   发布NY/TXXXXX—XXXX前言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由农业农村部农产品质量安全监管司提出。本文件由农业农村部农产品营养标准专家委员会归口。本文件起草单位：青岛农业大学、农业农村部果品质量安全风险评估实验室（青岛）、天津市农业科学院、农业农村部食物与营养发展研究所、青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室。本文件主要起草人：聂继云、王堃宇、陈秋生、朱大洲、孔夏冰、刘晓丽、王昱心、万浩亮、贾东杰、李倩、韩令喜。枣及制品中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的测定高效液相色谱法范围本文件描述了枣及制品中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷测定的高效液相色谱法。本文件适用于枣及制品中环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷含量的测定。本文件测定的环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）的线性范围均为0.5mg/L-100mg/L。cAMP和cGMP的检出限和定量限详见附录A。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理样品中的环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷用水提取（鲜枣和干枣）或不提取（枣汁），经反相色谱分离，用紫外-可见光检测器或二极管阵列检测器检测，以保留时间定性，外标法定量。5试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.1甲醇（CH3OH）。5.2磷酸二氢钾（KH₂PO₄）：色谱纯。5.3流动相A：量取1000mL超纯水。5.4流动相B：称取2.722g磷酸二氢钾（5.2），用超纯水溶解、定容至1000mL，配成0.02mol/L的磷酸二氢钾水溶液。5.5标准品：纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质，相关信息参见附录A。5.6单标储备溶液（1000mg/L）：准确称取5.00mg标准品，用超纯水溶解、定容至5mL，装入密闭棕色玻璃瓶中，-18°C保存，有效期6个月。5.7混合标准工作液：将单标储备溶液混合后，用超纯水逐级稀释成0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L和100mg/L的混合标准溶液，现用现配。5.8微孔滤膜：0.45μm，水相。6仪器与设备6.1高效液相色谱仪：配有紫外-可见光检测器或二极管阵列检测器。6.2分析天平：感量0.01g、0.1mg、0.01mg。6.3离心机：转速≥12000r/min。6.4冷冻研磨机：转速25000r/min。6.5水浴锅：70°C±1°C。7分析步骤7.1试样制备果实洗净，擦干，去核，取可食部分约200g（鲜枣）或约50g（干枣），切碎混匀，用冷冻研磨机研成粉末。7.2提取7.2.1鲜枣称取4.00g试样于100mL离心管中，加入80mL超纯水，混匀，置65℃水浴锅中提取16h（期间不时震荡以保证料液充分接触），冷却至室温。吸取2mL提取液，12000r/min离心10min，过微孔滤膜（5.8），待测。7.2.2干枣称取2.00g试样于50mL离心管中，加入40mL超纯水，混匀，置65℃水浴锅中提取1h（期间不时震荡以保证料液充分接触），冷却至室温。吸取2mL提取液，12000r/min离心10min，过微孔滤膜（5.8），待测。7.2.3枣汁摇匀，称取2.00g试样于2mL离心管中，12000r/min离心10min，过微孔滤膜（5.8），待测。7.5测定7.5.1液相色谱参考条件a)色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm×5µm，或性能相当者；b)进样量：10µL；c)流速：1.0mL/min；d)柱温：35°C；e)检测波长：254nm；f)等度洗脱条件：流动相A，94%；流动相B，6%；35min。7.5.2色谱分析分别将混合标准工作液（5.7）和试样溶液（7.2、7.3、7.4）注入高效液相色谱仪中进行测定。以保留时间定性，以样品溶液峰面积与标准溶液峰面积比较定量。若样品溶液中环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）浓度超出了标准曲线的线性范围，应稀释后再行测定。7.6空白试验除不加试样外，均按照上述测定步骤操作。8结果计算试样中环磷酸腺苷（cAMP）和环磷酸鸟苷（cGMP）的含量以质量分数ω计，单位为毫克每千克（mg/kg），按式(1)计算：ω=ρ×V×f式中：ρ—从标准曲线上查得的试样提取液中待测组分的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；V—试样提取液定容体积，单位为毫升（mL）；m—试样质量，单位为克（g）；f—试样提取液稀释倍数。计算结果须扣除空白值，以两次平行测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。9精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。在再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的15%。10色谱图目标化合物的高效液相色谱图参见附录B。（资料性）环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的标准物质基本信息及检出限和定量限环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷标准物质基本信息及检出限和定量限见表A.1。表A.1环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷的标准物质基本信息及检出限和定量限序号名称CAS号分子式检出限mg/kg定量限mg/kg1环磷酸腺苷60-92-4C10H12N₅O₆P