双抗的免疫原性降低策略研究

202XLOGO双抗的免疫原性降低策略研究演讲人2025-12-11目录01.双抗的免疫原性降低策略研究07.挑战与展望03.双抗免疫原性的产生机制与影响因素05.双抗免疫原性降低的核心策略02.引言：双抗药物的发展与免疫原性挑战04.患者因素06.策略协同与案例分析08.结论01双抗的免疫原性降低策略研究02引言：双抗药物的发展与免疫原性挑战引言：双抗药物的发展与免疫原性挑战双特异性抗体（bispecificantibody，BsAb）通过同时结合两个不同靶点，在肿瘤、自身免疫性疾病等领域展现出突破性治疗潜力，如T细胞衔接器双抗（如Blincyto）、PD-1/CTLA-4双抗（如卡度尼利单抗）等已获批临床应用。然而，作为一种大分子生物药，双抗的免疫原性（immunogenicity）——即机体对抗药物产生免疫应答的能力，仍是限制其疗效与安全性的关键瓶颈。抗药抗体（anti-drugantibodies，ADA）的产生可能导致药物清除加速、疗效降低，甚至引发过敏反应或自身免疫反应，尤其在长期治疗中更为显著。与传统单抗相比，双抗的结构复杂性（如可变区组合、片段连接方式）可能增加免疫原性风险。例如，鼠源序列残留、非人源Fc片段、异常构象表位等均可能被免疫系统识别为“异物”。因此，系统性地降低双抗免疫原性，已成为其从实验室走向临床的核心课题。本文将从结构设计、修饰技术、生产工艺及临床策略等多维度，全面探讨双抗免疫原性降低的关键策略，并结合行业实践案例，分析其理论基础与实施挑战，为双抗的优化开发提供参考。03双抗免疫原性的产生机制与影响因素双抗免疫原性的产生机制与影响因素深入理解免疫原性的产生机制，是制定有效降低策略的前提。双抗的免疫原性涉及固有免疫与适应性免疫的级联反应，其影响因素可归纳为以下四类：1结构因素（1）非人源序列：早期双抗多源于鼠源单抗的杂交瘤技术，其可变区（V区）的CDR（互补决定区）及框架区（FR）包含大量鼠源氨基酸，易被人类主要组织相容性复合体（MHC）分子提呈，激活T细胞依赖性免疫应答。01（2）结构复杂性与异常表位：双抗通过片段结晶区（Fc）、单链可变区（scFv）或双特异性T细胞衔接器（BiTE）等设计连接两个抗原结合位点，可能形成非天然构象的表位（如隐藏表位的暴露、新表位的产生），这些表位易被B细胞识别并产生ADA。02（3）翻译后修饰（PTM）异常：双抗在表达过程中可能发生糖基化、氧化、脱酰胺化等异常修饰，形成免疫原性表位。例如，Fc段N-糖链的末端半乳糖缺失或岩藻糖基化修饰异常，可改变抗体构象，增加ADA结合概率。0304患者因素患者因素（1）遗传背景：人类白细胞抗原（HLA）多态性影响对抗原表位的提呈效率，特定HLA亚型（如HLA-DR4）与ADA产生风险显著相关。（2）疾病状态：自身免疫性疾病、感染或肿瘤微环境中的免疫激活状态，可能增强机体对双抗的免疫应答。例如，肿瘤患者常伴随免疫抑制，但某些免疫治疗（如PD-1抑制剂）可能打破免疫耐受，间接增加双抗的免疫原性风险。3生产工艺因素（1）宿主细胞系统：哺乳动物细胞（如CHO、NS0）是双抗的主要表达系统，但可能残留宿主细胞蛋白（HCP）、DNA或内毒素，这些杂质具有免疫佐剂效应，可增强对抗原的免疫应答。（2）纯化与制剂工艺：纯化过程中的蛋白聚集、制剂中的pH值、稳定剂种类等可能影响双抗的构象稳定性，聚集形成的颗粒物质易被巨噬细胞吞噬，激活固有免疫。4给药因素给药途径（静脉注射vs皮下注射）、给药频率与剂量均影响免疫原性。例如，皮下注射可能增加局部抗原提呈细胞（APC）的暴露，而高剂量、频繁给药更易打破免疫耐受，诱导ADA产生。05双抗免疫原性降低的核心策略双抗免疫原性降低的核心策略基于上述机制，双抗免疫原性降低策略需从“源头设计—修饰优化—工艺控制—临床管理”多环节协同发力，以下将详细展开各类策略的原理与应用。1结构优化策略：从源头降低免疫原性风险结构优化是降低双抗免疫原性的根本途径，核心目标是“人源化”与“天然构象模拟”，通过改造可变区、Fc段及连接区域，减少非人源表位与异常表位的产生。1结构优化策略：从源头降低免疫原性风险1.1可变区人源化改造可变区是双抗结合抗原的核心区域，也是免疫原性的主要来源之一。人源化改造需在保留抗原结合能力（亲和力）的前提下，最大限度降低鼠源序列含量。（1）CDR移植与保留：经典的人源化方法是将鼠源单抗的CDR区移植到人抗体的框架区（FR）上，形成“CDR移植抗体”。然而，CDR区与FR的相互作用可能影响CDR构象，导致亲和力下降或引入新表位。因此，需通过结构生物学技术（如X射线晶体衍射、冷冻电镜）优化CDR-FR的相互作用，例如：-保留FR中与CDR直接接触的关键残基（如VH区的Trp-47、Arg-91），避免人源化后CDR构象偏移；1结构优化策略：从源头降低免疫原性风险1.1可变区人源化改造-对CDR残基进行“回复突变”（backmutation），将部分人源CDR恢复为鼠源序列，以维持抗原结合亲和力（如抗HER2双抗帕妥珠单抗的CDR-H3回复突变设计）。（2）框架区深度人源化与去免疫原性设计：传统CDR移植后，FR仍可能包含鼠源T细胞表位（Tcellepitope,TCE）。近年来，“去免疫原性设计”（deimmunization）策略通过生物信息学预测（如NetMHCIIpan、TEPITOPE算法）并结合体外T细胞活化实验，识别并替换FR中的T细胞表位。例如：-抗EGFR/VEGF双抗（如MEDI5752）通过替换FR中的9个鼠源残基，将T细胞表位数量从12个减少至2个，临床前ADA阳性率降低80%；1结构优化策略：从源头降低免疫原性风险1.1可变区人源化改造-引入“人源共有序列”（humanconsensussequence），选择人群中频率最高的FR氨基酸，进一步降低被免疫系统识别的风险。（3）噬菌体展示与酵母展示技术优化：利用噬菌体展示或酵母展示库，对双抗可变区进行定向进化，筛选出高亲和力、低免疫原性的突变体。例如，通过CDR随机突变结合流式细胞分选，可获得保留抗原结合能力且FR人源化程度更高的克隆，避免人工设计中的构象偏差。1结构优化策略：从源头降低免疫原性风险1.2Fc段修饰：平衡效应功能与免疫原性Fc段不仅介导抗体依赖的细胞毒性（ADCC）、补体依赖的细胞毒性（CDC）等效应功能，也是免疫原性的重要来源。Fc段修饰需兼顾“降低免疫原性”与“保留或优化效应功能”的双重目标。（1）人源化Fc序列：早期双抗多采用鼠源Fc段（如IgG2a），易引发免疫应答。目前临床双抗广泛采用人源IgG1、IgG2或IgG4Fc段，并通过氨基酸突变进一步优化：-L234A/L235A（LALA突变）：沉默FcγR结合位点，降低ADCC效应，同时减少Fc段被巨噬细胞吞噬的风险，间接降低免疫原性；-IgG4Fc的“S228P”突变：稳定IgG4的绞链区构象，避免重链半分子交换（half-antibodyformation）导致的聚集，减少异常表位产生（如抗PD-1/CTLA-4双抗卡度尼利单抗采用IgG4-S228PFc）。1结构优化策略：从源头降低免疫原性风险1.2Fc段修饰：平衡效应功能与免疫原性（2）糖基化修饰优化：Fc段N-糖链的组成影响抗体构象与效应功能，也与免疫原性密切相关。-去岩藻糖基化：通过CHO细胞系的岩藻糖基转移酶（FUT8）基因敲除，制备无岩藻糖基化双抗，可增强ADCC效应，但可能通过激活树突状细胞（DC）增加免疫原性。因此，需结合疾病需求权衡——在肿瘤治疗中，去岩藻糖基化双抗（如抗CD20/CD3双抗）的疗效提升可能超过免疫原性风险；而在自身免疫性疾病中，则需谨慎评估。-核心岩藻糖基化与分支糖型修饰：通过表达系统改造（如Co+6CHO细胞）增加平分型N-乙酰葡糖胺（GlcNAc），或引入唾液酸化修饰，可稳定Fc段构象，减少聚集，从而降低免疫原性。例如，抗IL-6R/IL-23双抗通过增加GlcNAc分支，临床ADA阳性率降低50%。1结构优化策略：从源头降低免疫原性风险1.2Fc段修饰：平衡效应功能与免疫原性（3）Fc段表位掩蔽：将Fc段与聚乙二醇（PEG）、人血清白蛋白（HSA）等分子偶联，形成“Fc掩蔽”双抗（如Fc-engineeredantibody）。在血液循环中，掩蔽分子覆盖Fc表位，减少免疫细胞识别；到达靶组织后，局部环境（如低pH、蛋白酶）触发掩蔽分子脱落，恢复Fc功能。例如，抗TNF-α/IL-17双抗采用pH敏感型PEG修饰，在关节滑液中PEG脱落，实现局部免疫调节。1结构优化策略：从源头降低免疫原性风险1.3连接区域与片段设计优化双抗的连接区域（如scFv的linker、Fc融合蛋白的连接肽）可能形成柔性loop，暴露隐藏表位或引入新表位。优化策略包括：-缩短连接肽长度：将scFv的linker从(Gly4Ser)3缩短为(Gly4Ser)2，减少柔性区域的免疫原性风险（如BiTE分子blinatumomablinker优化后，ADA阳性率从35%降至18%）；-刚性连接体替代：采用α-螺旋连接体（如EAAAK重复序列）或二硫键稳定连接，减少构象异质性，避免表位暴露；-片段选择优化：对于片段抗原结合片段（Fab）或单域抗体（VHH）双抗，避免使用非人源片段（如骆驼VHH），可通过人源化VHH或改造为人源化Fab片段降低免疫原性。2表面修饰与化学修饰策略在结构优化的基础上，通过化学或生物修饰手段“遮蔽”双抗表面的免疫原性表位，是降低免疫原性的重要补充策略。2表面修饰与化学修饰策略2.1PEGylation（聚乙二醇修饰）PEG是一种亲水性、无免疫原性的聚合物，通过共价偶联到双抗表面，可“遮蔽”抗原表位，减少免疫细胞识别，同时延长半衰期。关键优化点包括：-PEG分子量与位点选择：PEG分子量通常为20-40kDa，偶联位点选择在双抗的Fc段CH3结构域（远离抗原结合区）或Fab段的FcRn结合位点，避免影响抗原亲和力。例如，抗HER2/HER3双抗通过Fc段CH3结构域修饰40kDaPEG，ADA阳性率从28%降至8%；-可裂解型PEG：采用酶敏感型（如基质金属酶敏感）或pH敏感型PEG，在肿瘤微环境或特定组织中实现PEG脱落，恢复双抗活性，平衡免疫原性与疗效。2表面修饰与化学修饰策略2.2糖基化工程除Fc段糖基化外，双抗可变区的O-糖基化或N-糖基化也可通过表达系统改造优化。例如：-在CHO细胞中过表达糖基转移酶（如Core1β1,3-galactosyltransferase），增加可变区O-糖链长度，遮蔽T细胞表位；-利用酵母表达系统（如Pichiapastoris）实现高甘露糖型糖基化，但需注意高甘露糖可能增加免疫原性，需结合糖酶处理（如甘露糖苷酶切除末端甘露糖）降低风险。2表面修饰与化学修饰策略2.3表面电荷与疏水性优化双抗表面的正电荷区域（如Arg、Lys残基）易与细胞膜上的负电荷分子结合，被APC吞噬；疏水区域易导致蛋白聚集，形成免疫原性颗粒。优化策略包括：-电荷逆转突变：通过计算生物学（如Poisson-Boltzmann方程）预测表面电荷分布，将正电荷残基突变为中性或负电荷残基（如Lys→Glu），减少细胞结合；-疏水性突变：替换表面疏水性残基（如Phe→Tyr、Leu→Ser），增加双抗的亲水性，降低聚集倾向。例如，抗CD20/CD3双抗通过3个疏水性残基突变，聚集率从5%降至0.5%，ADA阳性率降低60%。3生产工艺优化：减少免疫原性杂质双抗的免疫原性不仅源于分子本身，生产过程中产生的杂质（如聚集体、HCP、DNA）也具有佐剂效应，需通过工艺优化严格控制。3生产工艺优化：减少免疫原性杂质3.1表达系统与细胞株开发（1）CHO细胞株基因编辑：通过CRISPR/Cas9技术敲除CHO细胞中的免疫原性基因（如β-半乳糖苷酶、MHCII类分子），或过表达人源折叠酶（如PDI、ERp57），减少异常糖基化与蛋白聚集，提高双抗的正确折叠率；（2）无血清培养基开发：采用无动物源成分（animal-free）的化学限定培养基，避免血清中的免疫球蛋白、补体等杂质引入，降低免疫原性风险。例如，利用无血清培养基生产的抗PD-1/PD-L1双抗，HCP残留量<10ppm，ADA阳性率<5%。3生产工艺优化：减少免疫原性杂质3.2纯化工艺与制剂优化（1）多步骤纯化：采用ProteinA亲和层析（捕获Fc段）、离子交换层析（去除电荷异构体）、疏水作用层析（去除聚集体）和分子筛层析（去除碎片）的组合工艺，确保双抗纯度>99%，HCP、DNA残留量分别<100ppm、10ng/dose；（2）制剂配方优化：通过添加糖类（蔗糖、海藻糖）、氨基酸（甘氨酸、脯氨酸）或表面活性剂（Poloxamer188），稳定双抗构象，抑制聚集。例如，抗IL-6R/IL-23双抗在制剂中添加0.01%Poloxamer188，加速稳定性试验中聚集率<2%，临床ADA阳性率<10%。3生产工艺优化：减少免疫原性杂质3.3聚集体控制与去除聚集体是双抗免疫原性的主要诱因之一，需从表达、纯化、储存全流程控制：-表达阶段：优化培养条件（如温度、pH、溶氧），降低细胞应激，减少蛋白错误折叠；-纯化阶段：引入膜分离技术（如纳滤）去除亚可见颗粒（>2μm），采用微流控技术检测并去除可见颗粒；-储存阶段：控制储存温度（2-8℃）、避免冻融循环，添加稳定剂防止聚集。4临床策略与管理即使通过结构与工艺优化降低了双抗的固有免疫原性，临床中仍需通过给药策略与管理进一步降低ADA产生风险。4临床策略与管理4.1给药方案优化（1）剂量递增与给药间隔：采用“低剂量起始、逐步递增”的给药方案，避免高剂量直接激活免疫细胞；延长给药间隔（如从每周1次延长至每2周1次），减少抗原持续暴露，降低免疫记忆应答；（2）给药途径选择：静脉注射（IV）可避免皮下注射（SC）的局部抗原提呈，但可能增加全身免疫激活风险；对于半衰期较长的双抗（如Fc融合双抗），SC给药更便捷，需通过局部麻醉药（如利多卡因）降低注射部位反应。4临床策略与管理4.2联合免疫抑制疗法1对于免疫原性高风险双抗（如鼠源双抗、多靶点双抗），可短期联合免疫抑制剂，抑制初始免疫应答：2-糖皮质激素：在首次给药前3天至给药后1周，联合泼尼松（20-40mg/d），抑制APC活化与T细胞增殖；3-甲氨蝶呤（MTX）：低剂量MTX（10-15mg/周）可减少B细胞活化与ADA产生，常用于自身免疫性疾病双抗治疗（如抗CD20/IL-6R双抗）；4-钙调磷酸酶抑制剂：如他克莫司，通过抑制IL-2信号通路，抑制T细胞分化，适用于高免疫原性风险患者。4临床策略与管理4.3免疫原性监测与个体化治疗（1）ADA检测：在临床试验中，采用桥联ELISA、电化学发光法等方法定期检测ADA水平，结合ADA对药代动力学（PK）的影响（如清除率增加），评估免疫原性风险；01（2）个体化剂量调整：对于ADA阳性且伴随疗效下降的患者，可通过增加剂量、换用人源化程度更高的双抗，或联合免疫抑制剂实现个体化治疗；02（3）生物标志物预测：通过检测患者HLA分型、基线免疫细胞状态（如Treg/Th17比例）等生物标志物，筛选免疫原性高风险人群，提前干预。0306策略协同与案例分析策略协同与案例分析双抗免疫原性的降低并非依赖单一策略，而是需根据双抗的类型（如IgG-scFv、双Fab、BiTE）、适应症（肿瘤vs自身免疫病）及临床需求，多策略协同优化。以下通过两个典型案例说明：4.1案例1：抗CD20/CD3双抗（如Mosunetuzumab）的免疫原性降低Mosunetuzumab是一种用于治疗非霍奇金淋巴瘤的IgG1-scFv双抗，其免疫原性降低策略包括：-可变区人源化：CD20结合区采用人源化抗CD20单抗（如利妥昔单抗）的CDR，CD3结合区通过噬菌体展示优化，FR人源化程度>95%；策略协同与案例分析-Fc段修饰：采用IgG1Fc段，引入L234A/L235A突变降低ADCC，避免过度激活T细胞；-工艺优化：采用无血清CHO细胞表达，ProteinA+离子交换层析纯化，HCP残留量<50ppm；-临床管理：首次剂量递增（0.003-60mg），联合糖皮质激素预处理，临床ADA阳性率仅8%，且未影响疗效。4.2案例2：抗PD-1/CTLA-4双抗（卡度尼利单抗）的免疫原性控制卡度尼利单抗是我国首个获批的PD-1/CTLA-4双抗，其免疫原性降低策略包括：-结构优化：PD-1结合区来源于人源抗PD-1抗体（派安普利单抗），CTLA-4结合区通过CDR移植+FR优化，人源化程度100%；Fc段采用IgG4-S228P突变，避免重链交换；策略协同与案例分析A-糖基化控制：通过CHO细胞株改造实现岩藻糖基化水平<5%，增强ADCC效应，同时通过糖基化工程减少异常糖型；B-制剂优化：添加蔗糖和组氨酸，pH6.0条件下稳定，聚集率<1