实验室微生物处理指南

实验室微生物处理指南###开头

实验室微生物处理是科研、检测和生物技术领域中的一项基础性工作，涉及微生物的采集、培养、鉴定、保存等多个环节。为确保实验结果的准确性、操作的安全性以及实验环境的洁净，必须遵循规范化的处理流程。本指南旨在提供一套系统化、标准化的微生物处理方法，帮助实验室人员高效、安全地完成相关工作。

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###一、微生物处理的基本原则

微生物处理必须遵循以下基本原则，以确保实验的科学性和安全性。

（一）无菌操作

1.确保所有操作环境（如超净工作台、无菌操作间）的洁净度达到要求。

2.操作前需对双手进行消毒，并穿戴洁净的工作服、手套和口罩。

3.使用无菌器材（如培养皿、移液管、接种环），避免交叉污染。

（二）生物安全

1.根据微生物的潜在风险等级，选择合适的生物安全柜（如B2级或B3级）进行操作。

2.处理致病性微生物时，需佩戴护目镜和防护服，并严格控制气溶胶的产生。

3.实验结束后，所有废弃物需经过高压灭菌或化学消毒处理。

（三）标准化流程

1.所有操作步骤应参照标准操作规程（SOP），避免随意更改。

2.记录详细的实验日志，包括培养基配制、接种量、培养条件等关键参数。

3.定期校准仪器设备（如培养箱、显微镜），确保其性能稳定。

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###二、微生物的采集与制备

微生物的采集和制备是实验的基础环节，需严格按照以下步骤进行。

（一）样品采集

1.选择代表性的样品（如土壤、水体、食物等），避免污染。

2.使用无菌工具（如镊子、注射器）采集样品，立即密封于无菌容器中。

3.样品采集后应尽快处理，避免微生物失活或生长失控。

（二）样品前处理

1.**均质化处理**：对于固体样品，可使用无菌研磨机或匀浆器进行破碎。

2.**稀释处理**：将样品用无菌生理盐水或缓冲液进行系列稀释，以获得合适的接种浓度。

3.**选择性培养**：若需富集特定微生物，可使用选择性培养基（如MAC培养基用于肠道杆菌）。

（三）微生物制备

1.**平板划线法**：将稀释后的样品滴加到琼脂平板表面，用接种环进行划线分离。

2.**液体培养法**：将样品接种到液体培养基中，置于摇床或静置培养。

3.**纯化培养**：挑取单菌落进行多次传代，直至获得纯种菌株。

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###三、微生物的培养与保存

微生物的培养和保存需控制适宜的环境条件，并采取科学的保存措施。

（一）培养条件控制

1.**温度**：根据微生物生长需求，选择合适的培养温度（如细菌37℃、酵母25℃、霉菌28℃）。

2.**pH值**：调节培养基pH值至适宜范围（如细菌7.2-7.4、真菌4.0-6.0）。

3.**氧气需求**：需氧微生物需通入无菌空气，厌氧微生物需使用厌氧罐或氮气保护。

（二）培养过程监测

1.每日观察菌落形态、颜色和生长速度，记录异常变化。

2.使用显微镜检查细胞形态（如革兰染色、孢子观察）。

3.定期检测培养液浊度（如使用分光光度计测定OD值）。

（三）微生物保存方法

1.**冷冻保存**：将菌悬液与甘油混合后置于-80℃冰箱保存。

2.**超低温保存**：使用液氮（-196℃）长期保存，可保存数年。

3.**干燥保存**：将菌种制成冻干粉末，置于真空干燥器中保存。

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###四、微生物检测与分析

微生物检测是验证实验结果的关键环节，需采用标准化的检测方法。

（一）形态学检测

1.**显微镜观察**：使用革兰染色、抗酸染色等区分细菌类型。

2.**菌落特征**：记录菌落的形状、大小、颜色和透明度等特征。

（二）生化鉴定

1.**糖发酵试验**：检测微生物对不同碳源（如葡萄糖、乳糖）的利用能力。

2.**酶活性检测**：使用API测试条或微量生化管进行鉴定。

（三）分子生物学检测

1.**PCR检测**：通过特异性引物扩增目标基因片段（如16SrRNA基因）。

2.**基因测序**：对扩增产物进行测序，比对数据库确定物种。

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###五、实验废弃物处理

实验结束后，所有废弃物需经过规范处理，防止环境污染。

（一）灭菌处理

1.液体废弃物需加入70%乙醇或次氯酸钠溶液消毒后倾倒。

2.固体废弃物（如培养皿、试管）需高压灭菌（121℃，15分钟）。

（二）分类处置

1.无菌废弃物可直接焚烧或填埋。

2.潜在污染废弃物需放入专用生物危害垃圾桶。

（三）记录与备案

1.记录废弃物处理过程，确保符合实验室管理制度。

2.定期向相关部门（如环保部门）汇报废弃物处置情况。

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###结尾

微生物处理是一项严谨且复杂的工作，需严格遵循操作规范，确保实验的科学性和安全性。本指南提供了一套系统化的处理方法，但实际操作中可能需根据具体需求进行调整。实验室人员应持续学习，掌握最新的微生物处理技术，以提高实验效率和成果质量。

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###（续）二、微生物的采集与制备

微生物的采集与制备是整个实验流程的起点，其质量的优劣直接影响后续培养、鉴定和分析结果的准确性。必须严格按照无菌原则和标准化操作进行，以避免污染和样品降解。

**（一）样品采集**

1.**样品选择与目标确定**：

*根据实验目的（如环境监测、病原检测、资源勘探等）选择合适的样品来源。

*明确目标微生物的类型或范围，以便在采样时有所侧重。

*考虑样品的代表性，确保采集的样品能够反映整体环境或群体的特征。

2.**采样工具准备**：

*准备足量、洁净的无菌采样工具，如：无菌采样袋/瓶（根据样品类型选择合适的材质和体积）、无菌铲、无菌剪刀、无菌压舌板、无菌拭子（不同类型，如纤维头、毛刷头）、无菌注射器、无菌水等。

*所有工具在使用前均需进行高压蒸汽灭菌（通常121℃，15-20分钟）或使用有效的化学消毒剂（如70-75%乙醇、次氯酸钠溶液）进行彻底消毒，并确保干燥。

*提前准备好样品标签，包含样品编号、采集日期、采集地点、采集人、样品类型等信息。

3.**现场采样操作**：

***环境样品（空气、水体、土壤、表面等）**：

*确保采样环境符合无菌要求，尽量减少人员流动和无关操作。

*采样前，用消毒剂（如70%乙醇）擦拭采样设备外部，或将其放入无菌袋中一同灭菌。

***空气采样**：使用无菌采样器（如撞击式采样器、滤膜采样器），按照预设流量和时间进行采样。采样前后的采样器部件需进行灭菌处理。

***水体采样**：使用无菌采样瓶，采用无菌操作将瓶中残留空气排出后浸入水体预定深度，保持瓶口朝下缓慢提出，避免引入空气和表层污染物。对于沉积物样品，使用无菌采样管或采样勺深入沉积层采集。

***土壤采样**：使用无菌铲或无菌土钻，在选定区域采取表层以下（通常5-15厘米）的混合样品。避免接触土壤表面和周围环境。采集后，将样品轻轻混合，用无菌勺取适量放入无菌采样袋/瓶中。

***表面采样**：使用无菌拭子（如接触皿法或旋转法），在目标表面（如设备外壳、操作台面）规定面积内反复擦拭或旋转，以收集表面附着的微生物。擦拭后，将拭子放入含有无菌缓冲液（如生理盐水、磷酸盐缓冲液）的无菌试管或袋中，充分震荡洗脱。

***生物样品（植物、动物、食品等）**：

*根据样品特性选择合适的采集工具和方法。例如，植物叶片可用无菌剪刀剪取小块；动物体表可用无菌棉签擦拭；食品样品需使用无菌镊子或勺子取样。

*采集时避免样品受到损伤或污染。采集后立即放入无菌容器中，并考虑是否需要添加防腐剂（如需短期保存送检，根据情况添加）。

4.**样品标识与运输**：

*立即、清晰地标记所有样品容器，确保信息准确无误。

*根据样品类型和目标微生物的敏感性，选择合适的运输条件（如保温、冷藏）。需使用带冰袋或冷藏箱的运输工具，防止微生物在运输过程中死亡或过度生长。

*尽快将样品送至实验室进行处理，一般建议在采集后2小时内到达实验室。

**（二）样品前处理**

1.**均质化处理**：

***固体样品（土壤、食物、组织等）**：

*将样品在无菌条件下进行初步破碎（如使用无菌研钵、研磨机）。

*对于较难均质的样品（如土壤、植物根茎），可使用无菌高速搅拌机或均质器，加入适量无菌生理盐水或缓冲液进行匀浆，确保微生物分布均匀。

*对于需要精细分离的样品（如土壤中的特定微生物群落），可能需要采用更温和的物理方法（如球磨）或密度梯度离心。

***半流体样品（粪便、污泥等）**：

*可直接进行稀释或加入无菌液体进行均质。

2.**稀释处理**：

***系列稀释法**：这是最常用的稀释方法，适用于从高浓度样品中分离出单菌落或测定微生物数量。

*(1)**准备稀释液**：使用无菌生理盐水、缓冲液或特定培养基上清液作为稀释液。

*(2)**逐级稀释**：取适量（如10克或1毫升）原始样品加入含有一定体积稀释液的无菌容器中，充分混匀。然后取上层清液（或混合液）再次加入新的无菌容器中稀释，如此重复多次，得到一系列浓度递减的样品液。

*(3)**确定稀释倍数**：根据预估的样品微生物浓度，选择合适的起始稀释倍数和最终稀释倍数，确保后续平板接种时的菌落数量在30-300个之间，以保证计数的准确性。

*(4)**记录**：详细记录每次稀释所用的稀释液体积和稀释倍数。

***直接接种法**：对于微生物浓度较低的样品，或需要直接进行富集培养时，可直接取少量样品接种到液体培养基或固体培养基上。

3.**选择性培养**：

***目的**：当样品中微生物种类繁多，目标微生物含量较低时，使用含有特定抑制剂或营养物质的选择性培养基，可以抑制非目标微生物的生长，促进目标微生物的繁殖。

***方法**：根据目标微生物的特性，选择合适的商业化选择性培养基（如MAC培养基用于分离肠道杆菌、TSB-YE培养基用于分离酵母菌、罗氏肉汤培养基用于分离分枝杆菌等），或自行配制。

***操作**：将适当稀释的样品接种到选择性培养基上，或使用选择性液体培养基进行富集培养。注意控制接种量，避免培养基过度生长。

**（三）微生物制备**

1.**平板划线法（StreakPlateMethod）**：

***目的**：用于从混合菌样的稀释液或原始样品中分离得到纯培养物（单菌落）。

***步骤**：

*(1)**准备**：将无菌培养皿底部用酒精灯火焰灭菌（或使用一次性无菌培养皿）。配制并灭菌固体培养基（如营养琼脂NA、TSB等）。待培养基冷却至45-50℃（手握培养皿感觉温热但不烫手）。

*(2)**接种**：使用已灭菌的接种环（或接种针），蘸取少量（如10-100μL）样品稀释液或挑取少量（如针尖大小）样品。在无菌操作台内（或超净工作台），将菌液均匀涂布在培养皿底部表面的一小区域。

*(3)**划线分离**：冷却后的培养基放置于水平桌面上。用接种环在涂有菌液的区域开始划线。将接种环在酒精灯火焰上灭菌后冷却。然后，将接种环伸入菌液区域，取少量菌，沿培养皿表面画一条直线（第一区）。将接种环再次火焰灭菌并冷却。将接种环在第一区线末端附近轻轻划弧，跨越部分第一区，进入第二区，并在此区划直线。重复此步骤，每次都将接种环火焰灭菌、冷却，并在前一个区域的末端附近进入下一个区域，划线时尽量交叉，使线条逐渐变得稀疏。通常划3-4个区域（如第一区、第二区、第三区、第四区）。

*(4)**培养**：划线完毕后，立即盖上培养皿盖。将培养皿倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入恒温培养箱中，根据微生物种类设置合适温度（如细菌37℃、酵母25-28℃、霉菌28-30℃）和时间（通常18-48小时）。

*(5)**观察与挑取**：培养后，观察平板上形成的菌落。纯培养的菌落通常形态一致、大小、颜色、透明度等特征相同。挑取单菌落（形态典型的、孤立的）进行后续实验。挑取时使用无菌接种环或接种针，在菌落边缘操作。

2.**液体培养法（LiquidCulture）**：

***目的**：用于大量繁殖微生物，或进行某些生理生化试验。

***步骤**：

*(1)**准备**：配制并灭菌液体培养基（如营养肉汤NB、马铃薯葡萄糖琼脂PDA等）。准备无菌试管或三角瓶，并装好液体培养基，封口（如棉塞、硅胶塞或使用螺旋盖加硅胶垫）。

*(2)**接种**：将灭菌后的培养瓶/管冷却至适宜温度（约45℃）。使用无菌接种环或移液器，从平板或液体样品中取少量（通常为原液10-1%的量）菌体接种到液体培养基中。对于从固体培养基转接，需先在平板上刮取少量菌苔。

*(3)**混匀与培养**：盖紧瓶盖（注意气密性，厌氧菌需特殊封口），轻轻摇晃使菌体均匀分散。将接种后的培养基放入恒温培养箱中，设置合适温度和时间进行培养。可根据需要设置振荡培养（使用摇床，调节转速和振荡频率）以增加氧气供应和促进物质交换。

*(4)**观察与使用**：培养后，可通过观察液体浑浊度（可用分光光度计测定OD值）、气体产生、沉淀、颜色变化等判断微生物生长情况。可根据实验需求，将培养液用于后续试验（如提取、检测、酶活性测定等）。

3.**纯化培养**：

***目的**：确保获得纯种菌株，排除其他微生物的污染。

***方法**：通常采用平板划线法进行初步纯化。从原始样品或混合培养物中分离出的单个菌落，再进行以下操作：

***重复划线**：将初步纯化的单菌落再次进行平板划线，重复多次划线分离过程，直至获得菌落形态、大小、颜色等完全一致的纯培养物。

***斜面培养**：将纯化的单菌落接种到无菌斜面培养基上，进行斜面培养。斜面培养有利于观察菌体的生长形态和特性，也便于保存。

***传代**：必要时，可对纯化后的菌株进行连续传代（在无菌条件下，将培养物接种到新的培养基中），以巩固纯度或扩大培养量。注意传代次数不宜过多，以免引起菌株退化或变异。

***验证**：对于需要高纯度保证的实验，纯化后的菌株还应通过显微镜观察形态、革兰染色、生化反应测试等方法进行验证，确保无杂菌污染。

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###开头

实验室微生物处理是科研、检测和生物技术领域中的一项基础性工作，涉及微生物的采集、培养、鉴定、保存等多个环节。为确保实验结果的准确性、操作的安全性以及实验环境的洁净，必须遵循规范化的处理流程。本指南旨在提供一套系统化、标准化的微生物处理方法，帮助实验室人员高效、安全地完成相关工作。

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###一、微生物处理的基本原则

微生物处理必须遵循以下基本原则，以确保实验的科学性和安全性。

（一）无菌操作

1.确保所有操作环境（如超净工作台、无菌操作间）的洁净度达到要求。

2.操作前需对双手进行消毒，并穿戴洁净的工作服、手套和口罩。

3.使用无菌器材（如培养皿、移液管、接种环），避免交叉污染。

（二）生物安全

1.根据微生物的潜在风险等级，选择合适的生物安全柜（如B2级或B3级）进行操作。

2.处理致病性微生物时，需佩戴护目镜和防护服，并严格控制气溶胶的产生。

3.实验结束后，所有废弃物需经过高压灭菌或化学消毒处理。

（三）标准化流程

1.所有操作步骤应参照标准操作规程（SOP），避免随意更改。

2.记录详细的实验日志，包括培养基配制、接种量、培养条件等关键参数。

3.定期校准仪器设备（如培养箱、显微镜），确保其性能稳定。

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###二、微生物的采集与制备

微生物的采集和制备是实验的基础环节，需严格按照以下步骤进行。

（一）样品采集

1.选择代表性的样品（如土壤、水体、食物等），避免污染。

2.使用无菌工具（如镊子、注射器）采集样品，立即密封于无菌容器中。

3.样品采集后应尽快处理，避免微生物失活或生长失控。

（二）样品前处理

1.**均质化处理**：对于固体样品，可使用无菌研磨机或匀浆器进行破碎。

2.**稀释处理**：将样品用无菌生理盐水或缓冲液进行系列稀释，以获得合适的接种浓度。

3.**选择性培养**：若需富集特定微生物，可使用选择性培养基（如MAC培养基用于肠道杆菌）。

（三）微生物制备

1.**平板划线法**：将稀释后的样品滴加到琼脂平板表面，用接种环进行划线分离。

2.**液体培养法**：将样品接种到液体培养基中，置于摇床或静置培养。

3.**纯化培养**：挑取单菌落进行多次传代，直至获得纯种菌株。

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###三、微生物的培养与保存

微生物的培养和保存需控制适宜的环境条件，并采取科学的保存措施。

（一）培养条件控制

1.**温度**：根据微生物生长需求，选择合适的培养温度（如细菌37℃、酵母25℃、霉菌28℃）。

2.**pH值**：调节培养基pH值至适宜范围（如细菌7.2-7.4、真菌4.0-6.0）。

3.**氧气需求**：需氧微生物需通入无菌空气，厌氧微生物需使用厌氧罐或氮气保护。

（二）培养过程监测

1.每日观察菌落形态、颜色和生长速度，记录异常变化。

2.使用显微镜检查细胞形态（如革兰染色、孢子观察）。

3.定期检测培养液浊度（如使用分光光度计测定OD值）。

（三）微生物保存方法

1.**冷冻保存**：将菌悬液与甘油混合后置于-80℃冰箱保存。

2.**超低温保存**：使用液氮（-196℃）长期保存，可保存数年。

3.**干燥保存**：将菌种制成冻干粉末，置于真空干燥器中保存。

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###四、微生物检测与分析

微生物检测是验证实验结果的关键环节，需采用标准化的检测方法。

（一）形态学检测

1.**显微镜观察**：使用革兰染色、抗酸染色等区分细菌类型。

2.**菌落特征**：记录菌落的形状、大小、颜色和透明度等特征。

（二）生化鉴定

1.**糖发酵试验**：检测微生物对不同碳源（如葡萄糖、乳糖）的利用能力。

2.**酶活性检测**：使用API测试条或微量生化管进行鉴定。

（三）分子生物学检测

1.**PCR检测**：通过特异性引物扩增目标基因片段（如16SrRNA基因）。

2.**基因测序**：对扩增产物进行测序，比对数据库确定物种。

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###五、实验废弃物处理

实验结束后，所有废弃物需经过规范处理，防止环境污染。

（一）灭菌处理

1.液体废弃物需加入70%乙醇或次氯酸钠溶液消毒后倾倒。

2.固体废弃物（如培养皿、试管）需高压灭菌（121℃，15分钟）。

（二）分类处置

1.无菌废弃物可直接焚烧或填埋。

2.潜在污染废弃物需放入专用生物危害垃圾桶。

（三）记录与备案

1.记录废弃物处理过程，确保符合实验室管理制度。

2.定期向相关部门（如环保部门）汇报废弃物处置情况。

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###结尾

微生物处理是一项严谨且复杂的工作，需严格遵循操作规范，确保实验的科学性和安全性。本指南提供了一套系统化的处理方法，但实际操作中可能需根据具体需求进行调整。实验室人员应持续学习，掌握最新的微生物处理技术，以提高实验效率和成果质量。

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###（续）二、微生物的采集与制备

微生物的采集与制备是整个实验流程的起点，其质量的优劣直接影响后续培养、鉴定和分析结果的准确性。必须严格按照无菌原则和标准化操作进行，以避免污染和样品降解。

**（一）样品采集**

1.**样品选择与目标确定**：

*根据实验目的（如环境监测、病原检测、资源勘探等）选择合适的样品来源。

*明确目标微生物的类型或范围，以便在采样时有所侧重。

*考虑样品的代表性，确保采集的样品能够反映整体环境或群体的特征。

2.**采样工具准备**：

*准备足量、洁净的无菌采样工具，如：无菌采样袋/瓶（根据样品类型选择合适的材质和体积）、无菌铲、无菌剪刀、无菌压舌板、无菌拭子（不同类型，如纤维头、毛刷头）、无菌注射器、无菌水等。

*所有工具在使用前均需进行高压蒸汽灭菌（通常121℃，15-20分钟）或使用有效的化学消毒剂（如70-75%乙醇、次氯酸钠溶液）进行彻底消毒，并确保干燥。

*提前准备好样品标签，包含样品编号、采集日期、采集地点、采集人、样品类型等信息。

3.**现场采样操作**：

***环境样品（空气、水体、土壤、表面等）**：

*确保采样环境符合无菌要求，尽量减少人员流动和无关操作。

*采样前，用消毒剂（如70%乙醇）擦拭采样设备外部，或将其放入无菌袋中一同灭菌。

***空气采样**：使用无菌采样器（如撞击式采样器、滤膜采样器），按照预设流量和时间进行采样。采样前后的采样器部件需进行灭菌处理。

***水体采样**：使用无菌采样瓶，采用无菌操作将瓶中残留空气排出后浸入水体预定深度，保持瓶口朝下缓慢提出，避免引入空气和表层污染物。对于沉积物样品，使用无菌采样管或采样勺深入沉积层采集。

***土壤采样**：使用无菌铲或无菌土钻，在选定区域采取表层以下（通常5-15厘米）的混合样品。避免接触土壤表面和周围环境。采集后，将样品轻轻混合，用无菌勺取适量放入无菌采样袋/瓶中。

***表面采样**：使用无菌拭子（如接触皿法或旋转法），在目标表面（如设备外壳、操作台面）规定面积内反复擦拭或旋转，以收集表面附着的微生物。擦拭后，将拭子放入含有无菌缓冲液（如生理盐水、磷酸盐缓冲液）的无菌试管或袋中，充分震荡洗脱。

***生物样品（植物、动物、食品等）**：

*根据样品特性选择合适的采集工具和方法。例如，植物叶片可用无菌剪刀剪取小块；动物体表可用无菌棉签擦拭；食品样品需使用无菌镊子或勺子取样。

*采集时避免样品受到损伤或污染。采集后立即放入无菌容器中，并考虑是否需要添加防腐剂（如需短期保存送检，根据情况添加）。

4.**样品标识与运输**：

*立即、清晰地标记所有样品容器，确保信息准确无误。

*根据样品类型和目标微生物的敏感性，选择合适的运输条件（如保温、冷藏）。需使用带冰袋或冷藏箱的运输工具，防止微生物在运输过程中死亡或过度生长。

*尽快将样品送至实验室进行处理，一般建议在采集后2小时内到达实验室。

**（二）样品前处理**

1.**均质化处理**：

***固体样品（土壤、食物、组织等）**：

*将样品在无菌条件下进行初步破碎（如使用无菌研钵、研磨机）。

*对于较难均质的样品（如土壤、植物根茎），可使用无菌高速搅拌机或均质器，加入适量无菌生理盐水或缓冲液进行匀浆，确保微生物分布均匀。

*对于需要精细分离的样品（如土壤中的特定微生物群落），可能需要采用更温和的物理方法（如球磨）或密度梯度离心。

***半流体样品（粪便、污泥等）**：

*可直接进行稀释或加入无菌液体进行均质。

2.**稀释处理**：

***系列稀释法**：这是最常用的稀释方法，适用于从高浓度样品中分离出单菌落或测定微生物数量。

*(1)**准备稀释液**：使用无菌生理盐水、缓冲液或特定培养基上清液作为稀释液。

*(2)**逐级稀释**：取适量（如10克或1毫升）原始样品加入含有一定体积稀释液的无菌容器中，充分混匀。然后取上层清液（或混合液）再次加入新的无菌容器中稀释，如此重复多次，得到一系列浓度递减的样品液。

*(3)**确定稀释倍数**：根据预估的样品微生物浓度，选择合适的起始稀释倍数和最终稀释倍数，确保后续平板接种时的菌落数量在30-300个之间，以保证计数的准确性。

*(4)**记录**：详细记录每次稀释所用的稀释液体积和稀释倍数。

***直接接种法**：对于微生物浓度较低的样品，或需要直接进行富集培养时，可直接取少量样品接种到液体培养基或固体培养基上。

3.**选择性培养**：

***目的**：当样品中微生物种类繁多，目标微生物含量较低时，使用含有特定抑制剂或营养物质的选择性培养基，可以抑制非目标微生物的生长，促进目标微生物的繁殖。

***方法**：根据目标微生物的特性，选择合适的商业化选择性培养基（如MAC培养基用于分离肠道杆菌、TSB-YE培养基用于分离酵母菌、罗氏肉汤培养基用于分离分枝杆菌等），或自行配制。

***操作**：将适当稀释的样品接种到选择性培养基上，或使用选择性液体培养基进行富集培养。注意控制接种量，避免培养基过度生长。

**（三）微生物制备**

1.**平板划线法（StreakPlateMethod）**：

***目的**：用于从混合菌样的稀释液或原始样品中分离得到纯培养物（单菌落）。

***步骤**：

*(1)**准备**：将无菌培养皿底部用酒精灯火焰灭菌（或使用一次性无菌培养皿）。配制并灭菌固体培养基（如营养琼脂NA、TSB等）。待培养基冷却至45-50℃（手握培养皿感觉温热但不烫手）。

*(2)**接种**：使用已灭菌的接种环（或接种针），蘸取少量（如10-100μL）样品稀释液或挑取少量（如针尖大小）样品。在无菌操作台内（或超净工作台），将菌液均匀涂布在培养皿底部表面的一小区域。

*(3)**划线分离**：冷却后的培养基放置于水平桌面上。用接种环在涂有菌液的区域开始划线。将接种环在酒精灯火焰上灭菌后冷却。然后，将接种环伸入菌液区域，取少量菌，沿培养皿表面画一条直线（第一区）。将接种环再次火焰灭菌并冷却。将接种环在第一区线末端附近轻轻划弧，跨越部分第一区，进入第二区，并在此区划直线。重复此步骤，每次都将接种环火焰灭菌、冷却，并在前一个区域的末端附近进入下一