DB11T 1053.3-2013 实验用鱼 第3部分：遗传质量控制

备案号:40368-2014DB11北京市质量技术监督局发布前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4遗传分类及命名原则 5实验用鱼的繁殖方法 6近交系实验用鱼的遗传质量监测 7封闭群实验用鱼的遗传质量监测 附录A（资料性附录）斑马鱼相关基因的命名原则 附录B（资料性附录）斑马鱼微卫星遗传标记的检测方法 附录C（资料性附录）斑马鱼SNP遗传标记的检测方法 DB11/T1053的本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。DB11/T1053《实验用鱼》分为六个部分：——第1部分：微生物学等级及监测；——第2部分：寄生虫学等级及监测；——第3部分：遗传质量控制；——第4部分：病理学诊断规范；——第5部分：配合饲料技术要求；——第6部分：环境条件。本部分由北京市科学技术委员会提出。本部分由北京市科学技术委员会归口。本部分由北京市科学技术委员会组织实施。本部分起草单位：国家人口计生委科学技术研究所、中国科学院水生生物研究所、中国药品生物制品检定所、北京大学。本部分主要起草人：崔宗斌、岳秉飞、孙德明、张博、孙荣泽。实验用鱼第3部分：遗传质量控制DB11/T1053的本部分规定了实验用鱼（斑马鱼和剑尾鱼）的遗传分类及命名原则、实验用鱼的繁殖方法、近交系和封闭群的遗传质量监测。本部分适用于实验用鱼（斑马鱼和剑尾鱼）的遗传质量控制。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14923—2010实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制3术语和定义GB14923界定的，以及下列术语和定义适用本文件。指经人工饲养、繁育，对其携带的微生物及寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的鱼类。在一个鱼群内，任何个体基因组中98.6%以上的等位位点为纯合时定义为近交系。经过20代以上的全同胞兄妹交配培育而成，品系内所有个体都可以追溯到一对共同的祖先，其近交系数（inbreedingcoefficient）应大于99%。封闭群(远交系)closedcolony(outbredstock)以非近亲交配方式进行繁殖的实验用鱼群体，在不从外部引入新的基因的条件下，经过4代以上的繁殖，该群体称为封闭群，亦称远交系。杂交群hybrids由两个不同近交系杂交产生的后代群体。子一代简称F1。2两个近交系，除了在一个指明位点等位基因不同外，其他遗传基因全部相同，简称同源突变系。一般由近交系发生基因突变或人工诱变（如基因剔除）形成的。4遗传分类及命名原则4.1遗传分类根据实验用鱼群体内个体间遗传差异的不同，将其区分为近交系、封闭群和杂交群。4.2命名原则4.2.1近交系近交系一般以大写英文字母命名，亦可以用大写英文字母加阿拉伯数字命名，符号应尽量简短。如AB系、TU系、WIK11系等。近交代数用大写英文字母F表示。例如当一个近交系的近交代数为87代时，写成F87。如果对以前的代数不清楚，仅知道近期的近交代数为25，可以表示为F?+25。4.2.2封闭群(远交系)封闭群由2~4个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩写名称，第一个字母须大写，后面的字母小写，一般不超过4个字母。保持者与种群名称之间用冒号分开。4.2.3杂交群杂交群应按以下方式命名：以雌性亲代名称在前，雄性亲代名称居后，二者之间以大写英文字母“X”相连表示杂交。将以上部分用括号括起，再在其后标明杂交的代数（如F1、F2/等）。例如ABXWIK）F1，表示AB系和WIK系杂交的子一代。4.2.4斑马鱼相关基因的命名有关斑马鱼相关基因的命名原则，参见附录A。5实验用鱼的繁殖方法5.1近交系的繁殖方法5.1.1原则选择近交系实验用鱼繁殖方法的原则是保持近交系的同基因性及其基因纯合性。作为繁殖用原种的近交系实验用鱼必须遗传背景明确，来源清楚，有较完整的资料（包括品系名称、近交代数、遗传基因特点及主要生物学特征等）。引种的实验用鱼应来自近交系的基础群，数量不少于10对。5.1.3近交系的繁殖近交系的繁殖可分为基础群、血缘扩大群和生产群。当近交系实验用鱼生产供应数量不是很大时，可不设血缘扩大群，仅设置基础群和生产群。具体要求同GB14923—2010的4.1.4～4.1.6。生产群随机交配应不超过4代。5.2封闭群的繁殖方法5.2.1原则选择封闭群实验用鱼繁殖方法的原则是尽量保持封闭群实验用鱼的基因异质性及多态性，避免近交系数随繁殖代数增加而过快上升。作为繁殖用原种的封闭群实验用鱼必须遗传背景明确，来源清楚，有较完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特性等）。为保持封闭群的遗传异质性及基因多态性，引种实验用鱼的数量要足够多，封闭群实验用鱼引种数5.2.3封闭群的繁殖为保持封闭群实验用鱼的遗传基因的稳定，封闭群应大于100对，采取群体循环或随机交配法进行繁殖，具体方法可按照GB14923—2010的附录B。5.3杂交群的繁殖方法将适龄的雌性亲代品系与另一个品系的雄性亲代杂交，即可得到F1实验用鱼。雌雄亲本交配顺序不同，得到的F1也不一样。6近交系实验用鱼的遗传质量监测6.1遗传质量要求近交系鱼应符合以下要求：a)具有明确的品系背景资料，包括品系名称、近交代数、遗传组成、主要生物学特性等，并能充分表明新培育的或引种的近交系鱼符合近交系的定义。b)用于近交系保种及生产的繁殖系谱及记录卡应清楚、完整、繁殖方法科学。c)遗传检测(生化标记、微卫星分子标记、SNP分子标记等)质量合格。6.2遗传检测及方法6.2.1微卫星分子标记检测抽样对基础群，凡在子代留有种鱼的双亲都应进行检测。对生产群，按表1要求从每个近交系中随机抽取成鱼，雌雄各半。4表1抽检数量微卫星分子标记的选择选择分列于近交系斑马鱼25对染色体、剑尾鱼24对不同染色体上的5个以上位点，作为遗传检测的微卫星分子标记。检测方法见附录B。结果判断按表2要求执行。表2结果判断未发现遗传变异，遗传质量有一个位点的分子或生化标记与增加检测位点数目和增加检两个或两个以上位点的标记基因6.2.2SNP分子标记检测抽样按表1要求执行。SNP分子标记的选择选择位于近交系斑马鱼25对染色体、剑尾鱼24对染色体上的10个以上位点，作为遗传检测的SNP标记。检测方法见附录C。结果判断按表2要求执行。6.2.3生化标记检测法抽样按表1要求执行。生化标记的选择选择位于近交系斑马鱼25对染色体、剑尾鱼24对染色体上的5个以上位点，作为遗传检测的生化标记。结果判断按表2要求执行。6.3检测频率每年至少对近交系鱼的生产群进行一次遗传质量检测。7封闭群实验用鱼的遗传质量监测7.1遗传质量要求封闭群实验用鱼应符合以下要求：a)具有明确的遗传背景资料，来源清楚，有完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特性等）；b)用于保种及生产的繁殖系谱及记录卡应清楚完整；c)封闭繁殖，保持鱼的基因异质性及多态性，避免近交系数随繁殖代数增加而过快上升；d)经遗传检测(微卫星分子标记、SNP分子标记、生化标记等)证明基因频率稳定，为相同群体。7.2遗传检测及方法7.2.1抽样随机抽取雌雄各25尾以上进行基因型检测。7.2.2微卫星分子标记检测按照方案进行。7.2.3SNP分子标记检测按照方案进行。7.2.4生化标记检测按照方案进行。7.2.5群体评价群体内遗传变异采用平均有效杂合度指标或群体平衡状态进行度量。所用分子标记或生化标记应能反映群体基因多态性。当平均有效杂合度在0.5～0.7时，群体为合格的封闭群实验用鱼群体。或用群体是否达到平衡状态来判定，如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群群体判为不合格。7.3检测频率封闭群实验用鱼每年进行一次遗传质量检测。6（资料性附录）斑马鱼相关基因的命名原则A.1斑马鱼基因的命名原则A.1.1斑马鱼基因的全名一般用小写斜体英文字母表示，其对应的基因符号至少包含三个字母，所命名的字母组合不能与斑马鱼的已有基因突变体或基因名重复，基因名前不加“Z”和“Zf”，字母中间一般不加标点符号。A.1.2新基因的命名应该到国际斑马鱼信息网（）网站上注册登记。A.1.3斑马鱼的基因为哺乳动物的同源基因（orthologue）时，一般采用哺乳动物中所用的命名，并用小写斜体字母表示。A.1.4基因家族的不同成员按照发现时间的先后顺序用数字加以区别。例如，基因名：engrailed1a、engrailed2b，对应的基因符号：eng1a、eng2b。按照哺乳动物同源基因的命名原则，对于少数已经发表的斑马鱼基因，旧名可以附在新名后的括弧内，如shha(syu)，bmp2b(swr)。A.1.5斑马鱼中存在的重复基因（duplicatedgenes在人或小鼠的同源基因名称后添加“a”或“b”字母标示，如hoxa13a、hoxa13b。如果用“a”或“b”字母与已经存在的哺乳动物同源基因冲突时，则采用“1”或“2”数字标示，如stat5.1、stat5.2。A.1.6当与哺乳动物同源性较高但又无法确认是否为同源基因时，一般在该哺乳动物基因名后加“lA.1.7对于斑马鱼测序计划中获得的新基因，一般用测序研究单位加克隆号和数字表示，如si:bz3c13.1、si:bz3c13.2、si:bz3c13.3，其中si表示SangerInstitute。A.1.8转录变体的命名采用该基因名加transcriptvariant（在基因符号中缩写为tv）和顺序数字表示，如基因名：myosinVIa,transcriptvariant1，对应的基因符号：myo6a_tv1。A.2斑马鱼蛋白质的命名原则斑马鱼的蛋白质符号表示方法与斑马鱼的基因符号表示相同，但不用斜体而用正体英文字母表示，并且首位字母大写，例如Ndrw、Brs、Eng1a、Eng2b、Ntl。一些斑马鱼基因符号和蛋白质命名不同于人和小鼠，见表A.1：表A.1人和小鼠与斑马鱼基因符号和蛋白质命名sha人SHSh注：在文献中，有时将一个众所周知的常用蛋白符号放入括弧内，附在根据同源基因命名的符号A.3染色体和畸变斑马鱼的25对染色体Chr1～Chr25对应于以前的连锁群LG1～LG25，但染色体发生重排时通常使用一Is表示插入（insertion）、T表示易位（translocation）、Tg表示转基因（transgene）。在描述缺失型时，一般用Df(Chr##)xxxallele表示，染色体序号用两位数字表示，如Chr03表示三号染色体；xxxallele表示由研究者描述的缺陷的主要特征及其等位基因，例如Df(Chr12)dlx3b380。在易位类型为相互易位时，这时涉及到两条染色体，一般要对每条染色体进行明确的描述。通用表示形式为：T(Chr##;Chr##)xxxallele,##U.##L和T(Chr##;Chr##)xxxallele,##U.##L，其中T表示易位型，(Chr##;Chr##)表示易位涉及到的染色体号码，染色体序号用两位数字表示，中间用分号区分；xxxallele表示由研究者描述的易位的主要特征及其等位基因；##U.##L表示染色体的上臂（upperarm）和下臂T(Chr02;Chr12)cycb213，12U.12L02L。等位基因和基因型命名在斑马鱼中，描述等位基因野生型用上标“+”表示，等位基因突变型则采用上标的实验室分配字母（例如：/zf_info/zfbook/lab_desig.html所示）外加数字表示，例如b代表Eugene实验室、m代表MGH和Boston实验室、t代表德国的Tuebingen实验室；如果是显性等位基因则还在实验室分配字母前加上“d”。例如：lof+表示lof基因的野生型等位基因，lofdt2则表示lof显性等位基因Tuebingen实验室突变编号2。非连锁基因座：纯合子的不同基因座依1～25号染色体顺序排列，其间用分号隔开，如ednrb1b140;连锁基因座：每个染色体上的单元型基因座按列出，同一染色体上的基因座间用空格隔开，按基因座在连锁群中的位置从上到下依次排列；同源染色体基因用“/”分开，非同源染色体基因用分号隔开，未定位基因座的基因型按字母顺序排列在“{}”中，并附在已定位的不同染色体基因型之后。如}（edi表示未定位，三个基因座位于不同的染色体）。同一染色体上分辨率差的基因座按字母顺序排列在“{}”中。如{abcb000defm000}（同一染色体上分辨率差的基因座)；ednrb1b140{abcb000defm000}cx41.8t1（同一染色体上位于已知基因座之间的分辨率差的基因座位）。A.4转基因载体和转基因斑马鱼品系的命名转基因载体一般表示为Tg(promoter:gene)，其中Tg表示为转基因，括号中左边显示调控序列如启动子，右边表示编码基因，中间用“:”分开。例如Tg(SsNdr2:GFP)表示由SsNdr2驱动GFP基因表达的转基因载。此外，调控序列可以由增强子和启动子组成；当编码基因为两个不同的基因融合而成时则用“-”分开，例如Tg(-3.5hex-ERE:sptb-GFP)。但当转基因载体存在多个表达框，并且每个表达框都有自己的调控序列和编码基因时，可以用“,”区分，如Tg(isl3-RARE:GAL4,UAS:GFP)。转基因品系存在两种情况，一种是由被转入基因产生等位基因，另一种不知道是否成为等位基因。对于前者，用等位基因名上标加转基因Tg上标，如arnthi2639cTg；对于后者则用转基因载体命名加上实验A.5增强子、启动子、基因诱捕载体和诱捕斑马鱼品系的命名增强子、启动子、基因诱捕载体的命名与转基因构载体的命名基本相同，需要将相应的Tg改为Pt（启动子捕获），Gt（基因捕获），Et（增强子捕获）等。A.6核转移系（Conplasticstrains）的命名命名方法为NUCLEARGENOME-mtCYTOPLASMICGENOME，如AB-mtTU指带有AB系核基因组和TU系细胞质的品系。这样的品系是以雄的AB系斑马鱼与雌的TU系斑马鱼交配，子代雌鱼与AB系雄鱼反复回交10代而成。8（资料性附录）斑马鱼微卫星遗传标记的检测方法B.1基因组DNA的提取剪取斑马鱼TU或AB等品系的尾鳍，参照标准平衡酚—氯仿抽提程序提取DNA。具体方法如下：a)将尾鳍置1.5mL的Eppendorf管中，用消毒剪刀剪碎，加入50μL无水乙醇进行脱水处理，并让无水乙醇挥发掉；b)向管中加入适量的细胞裂解液（800μL～1mL终浓度为0.5%的SDS，以及终浓度为100μg/mL的蛋白酶K，慢慢混匀后于55℃水浴锅或烘箱中消化3h以上；c)取出消化后的样品，将其摇匀，冷却至室温，然后向管中加入与细胞裂解液等体积的平衡酚，轻轻混匀15min，12000rpm4℃离心10min，缓慢抽取上清液，置于一新的Eppendorf管中。如此重复再次酚-氯仿抽提；d)向抽提吸出的上层清液中加入等体积的氯仿异戊醇（24：1），以去除残留的酚，轻轻混匀15min，12000rpm4℃离心10min，吸取上清液于一新Eppendorf管中；e)加入2.5倍体积在-20℃预冷的无水乙醇，于-20℃放置30min，之后12000rpm4℃离心10min，弃去管内的液体；f)用75%的乙醇洗涤两次，每次都要12000rpm4℃离心5min，弃去液体；根据设计好的目标微卫星引物（参见表B.1）进行PCR扩增。PCR反应体系如下：10×PCRbuffer2.5μLdNTP(2.5mmol/L)上游引物（5pmol/L）0.5μL下游引物（5pmol/L）Taq酶（1U/μL）DNA模板（100ng/μL）灭菌双蒸水PCR反应程序为:95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃~60℃退火(因引物而异)40s，72℃延伸40s，35个循环，最后于72℃下延伸10min。B.3PCR产物的电泳因为要分辩小至几个bp的DNA片段，所以需要利用分辨率较高的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行产物检测，而不能用琼脂糖凝胶电泳进行检测。a)制胶：10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶；b)电泳：每个产物上样3μL，同时点上DNA分子量标记Marker，用1×TBE电泳缓冲液，250V恒压电泳，2.5h。B.4PCR产物染色观察染色：在1×TBE电泳缓冲液中加入几滴10mg/mL溴化乙啶染色10min左右，然后用水浸洗5min。观察：运用GeneGenius凝胶成像系统扫描，并拍照，保存记录。B.5微卫星分析所需试剂的配制B.5.1提取DNA所用试剂的配制B.5.1.10.5mol/LEDTA(pH8.0)18.61gEDTA二钠盐溶于80mL双蒸水中，用NaOH调pH值至8.0，定容至100mL，高压灭菌20min。12.11gTrisBase溶于80mL双蒸水中，用浓盐酸调节pH值至8.0，定容至100mL。高压灭菌20min。B.5.1.3细胞裂解液1mol/LTris-HCl1mL0.5mol/LEDTA20mL补足双蒸水至100mL，充分搅拌，高压灭菌20min。B.5.1.410％SDS（十二烷基硫酸钠）称取10gSDS慢慢转移到盛有约90mL双蒸水的烧杯中，充分搅拌直至完全溶解。用水定容至100mL，用几滴浓盐酸调pH至7.2。高压灭菌15min。B.5.1.5氯仿异戊醇96mL氯仿和4mL异戊醇混合，棕色瓶保存。1mol/LTris-HCl1mL0.5mol/LEDTA0.5mL补足双蒸水至100mL，充分搅拌，高压灭菌20min。B.5.1.770%乙醇350mL无水乙醇，加双蒸水定容至500mL。B.5.2聚丙烯酰胺凝胶电泳及EB染色所需溶液的配制B.5.2.15×TBETris硼酸0.5mol/LEDTA(pH8.0)54.0g29.0g20mL溶解于800mL双蒸水，充分搅拌后，补足双蒸水至1000mL。B.5.2.230%丙烯酰胺单体贮液丙烯酰胺29.0g加水定容至100mL，过滤。低温贮存，配一次最多用一个月。B.5.2.310%过硫酸铵称取0.1g过硫酸铵，加1.0mL双蒸水溶解，用时新鲜配制。B.5.2.410mg/mL溴化乙啶将100mg的溴化乙啶溶于10mL双蒸水中。B.5.2.5加样缓冲液（6×)0.125g溴酚蓝，15mL甘油，去离子水加至50mL。B.6实验用斑马鱼微卫星分子标记的遗传特征常用实验用斑马鱼微卫星分子标记的遗传特征见表B.1。表B.1常用实验用斑马鱼微卫星分子标记的遗传特征表B.1常用实验用斑马鱼微卫星分子标记的遗传特征(续)（资料性附录）斑马鱼SNP遗传标记的检测方法C.1基因组DNA的提取参见附录B.1中的方法进行。C.2PCR扩增），C.3SNP标记的检测将热循环之后的PCR产物用25μL的水稀释，并用枪头吹打混匀。然后取1μl为模板，用表C.1中的引物进行PCR扩增和双脱氧循环测序，最后可使用PolyPhred等程序软件分析SNP标记的测定结果。C.4SNP分子标记的特征SNP分子标记的名称及常用近交系斑马鱼的SNP分子标记的特征见表C.1。表C.1常用实验用斑马鱼品系SNP分子标记的特征GGCGATTCCTACAATTCTTCGAAAGTCCTGTGTTGAAGGTGGGCACATCGTCATATAATGCACAATACTGGAATGACACTGGGAAGTCCATGTTGGCATCTACAGTGTTGAGAAACGGTCAGGAACACTGGCACGTACACAAGGGGAATCGTGAACTCGTAACTCATTGTAATAGCAGTAATGACGTGCAATGTTTGTTTCAGACC表C.1常用实验用斑马鱼品系SNP分子标记的特征（续）TCATTGTAATAGCAGTAATGACGTGCAATGTTTGTTTCAGACCCTGCTGTTACTGGGTCAGTGACTGCATGATAATGCCAAACCTGCTGTTACTGGGTCAGTGACTGCATGATAATGCCAAACCCCATTTGTAGAAGAATCCAGTTGCATTAGAGCCTTATCCTGTGTTCTTATGCTCTGTGACTGGAGCAGCGATACTCACACAGTTCACTAGGTAAGACTCTTGAAGCTCTCTTTAATGTTGGACTGCTGCCTTTAATCCATAGCCTTAGCGACACATACCTGGCACTCGTCTCCTGAGAAGGATTCCACCAGTTGAGAAGGGAGAAACGGCTGTTGGGTTGACTTGCAGGAAAGACACCATCACTGAGCTTTAGGCGCAATAACAAGGTATCTCGGTTAACGGGAGTGGCAGGGATATTTGACTTGAATGTTCCCAAATACTGAATCTGCGGATCTGTTCATCGAGGTTC表C.1常用实验用斑马鱼品系SNP分子标记的特征（续）CATTTAATAAAGGAATCACTACTCTTAGTCAGTTTACTAACCTTGCTTTCATTTAATAAAGGAATCACTACTCTTAGTCAGTTTACTAACCTTGCTTTAAAGAGCGTCAAGATGTGTGGCC