DB15-T 3609-2024 黑土地土壤微生物肥力评价规范

ICS65.020.0115IDB15/T3609—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会(SAM/TC20)归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业生态与资源保护中心、内蒙古自治区农牧业科学研究院、内蒙古财经大学、呼伦贝尔市农业技术推广中心、兴安盟农牧技术推广中心、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、浙江省农业科学院、沈阳农业大学、呼伦贝尔农垦浩特陶海农牧场有限公司、内蒙古自治区农牧厅综合保障中心。本文件主要起草人：乔志刚、罗军、路战远、王跃飞、迟文峰、陈德、吴雪琨、刘宏金、武岩、刘亚龙、王萍、董芸雷、李晓敏、王璐、李文忠、杨茜雯、高娃、景宇鹏、王建国、任永峰、戴玉、李元文、赵靖丹、马超、刘亚萌、董子涵、李晓彦、白嘉骏、王旭、冬梅。DB15/T3609—20241黑土地土壤微生物肥力评价规范本文件规定了黑土地土壤微生物肥力评价中土壤样品的采集、制备及基础指标测定，土壤微生物肥力评价指标及测定，土壤微生物肥力评价方法等技术要求。本文件适用于黑土地土壤微生物肥力高低的评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备GB20287-2006农用微生物菌剂GB/T33469-2016耕地质量等级HJ613土壤干物质和水分的测定重量法LY/T1220森林土壤呼吸强度的测定NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1土壤微生物肥力soilmicrobialfertility能对土壤的物理和化学特性起到促进和维持作用的微生物，在生物过程中为植物生长发育提供所需养分的能力。3.2土壤微生物生物量soilmicrobialbiomassμm3微生物的总重量。微生物生物量表示方法即微生物量碳和氮。3.3土壤呼吸强度soilrespirationintensity单位时间内从单位面积土壤中释放出来的二氧化碳量。4土壤样品的采集、制备及基础指标测定2DB15/T3609—20244,1采样时间土壤微生物取样宜在植物生长旺盛期采样。内蒙古东北区采集时间宜选择在7～8月初进行，在野外采样时，应根据区域天气和农业管理条件的变化，避开降雨、施肥和灌溉等时期。4.2采样方法4.2.1样地设置用定位仪确定采样地点的地理位置（经纬度），每个样地面积原则上应＞1hm2，在平原区地形宜设置为100m×100m正方形，在丘陵山区狭长地带宜选择50m×200m的长方形。4.2.2采样单元确定根据所评价样地受自然及人为因素对土壤微生态系统影响的情况，按地形、土壤条件、土地利用方式、气候条件、耕作以及施肥方式等将所评价样地划分为3个条件相对一致的采样单元。4.2.3样品采集同一采样单元内按照均匀、随机、等量和多点混合的原则进行采样。取样时先去除土壤上面的覆盖物，包括植物、苔藓、可见根系、凋落物，以及可见的土壤动物等。在每个采样单元内，用酒精消毒过的不锈钢土钻随机采集15～20个0cm～20cm土层的土壤样品，按四分法混合成一个土壤微生物样品，以1kg左右为宜，若采集的样品量过多时，可用四分法（按照NY/T1121.1的规定执行）将多余的土壤弃去，最后保留1kg左右。每个样地分别采集3个微生物混合样作为重复。4.3样品处理4.3.1样品保存将采集土样放入无菌袋中，并在袋上写清采样编号后立即放于4℃冷藏箱或者冰袋中保存，并将保存有土样的4℃冷藏箱或者冰袋在48h内运回实验室，并统一保存于4℃环境中。4.3.2样品制备将土样充分混匀后分成三部分，用于土壤微生物肥力评价指标测定：一部分土样在一周内用于完成可培养微生物数量、酶活性、微生物量碳氮等的测定；一部分土样用于水分测定；一部分土样风干后过10目标准筛，选取一定量的土样用四分法过100目标准筛，用于土壤有机碳含量的测定。4,4土壤含水量和有机碳的测定土壤含水量的测定按照HJ613的规定执行，土壤有机碳的测定按照GB/T33469-2016中附录C的规定执行。5土壤微生物肥力评价指标及测定5.1土壤微生物肥力评价指标具体评价项目包括土壤微生物数量、微生物生物量碳氮、酶活性和微生物活性（微生物熵），其中微生物熵计算如公式(1)：DB15/T3609—20243qSMBC——微生物熵；Cmic——微生物生物量碳；Corg——土壤有机碳。5.2评价指标的测定5.2.1微生物数量测定土壤可培养细菌、真菌数量采用平板计数法，按照GB20287-2006中6.3.2的规定执行，所用培养基及其配制方法分别按照GB20287-2006的附录A中A.1、A.6的规定执行，单位换算成每克干土中所含的菌落数。5.2.2微生物生物量测定5.2.2.1微生物生物量碳土壤微生物生物量碳测定具体方法见附录A中的A.1。5.2.2.2微生物生物量氮土壤微生物生物量氮测定具体方法见附录A中的A.2。5.2.3土壤酶活性测定5.2.3.1纤维素酶活性纤维素酶活性测定按照GB20287-2006的附录D中D.1的规定执行。5.2.3.2蔗糖酶活性蔗糖酶活性以蔗糖为底物，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定，具体方法见附录B中的B.1。5.2.3.3脲酶活性脲酶活性以尿素为底物，采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定，具体方法见附录B中的B.2。5.2.3.4磷酸酶活性磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法，具体方法见附录B中的B.3。5.2.3.5过氧化氢酶活性过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定，具体方法见附录B中的B.4。5.2.3.6硝酸还原酶活性硝酸还原酶活性采用酚二磺酸比色法测定，具体方法见附录B中的B.5。5.2.3.7多酚氧化酶活性多酚氧化酶活性采用底物（左旋多巴（L-DOPA））分光光度法测定，具体方法见附录B中的B.6。5.2.4土壤呼吸强度的测定DB15/T3609—20244土壤呼吸强度测定按照LY/T1220的规定执行。6土壤微生物肥力评价方法6.1确定各评价指标权重参照表1规定的层次分析法，建立目标层、准则层和指标层层次结构，构建判断矩阵。经层次单排序及其一致性检验、层次总排序、层次总排序的一致性检验，计算并确定所有评价指标对黑土地微生物肥力(目标层)相对重要性的排序权重值。具体方法按照GB/T33469的规定执行。表1黑土地土壤微生物肥力评价因子总集6.2计算各指标隶属度6.2.1函数模型选择及隶属度计算土壤微生物数量、微生物生物量碳氮、微生物熵及酶活性均属于S型隶属函数，各评价因素的隶属函数可简化为公式(2)：f(u)——隶属函数；u——评价指标；u0——评价指标的阈值上限值。6.2.2隶属函数阈值上限的确定采用累积频率曲线确定隶属函数阈值上限，一组样本u1,u2,...un，给定某一阈值u0，不大于u0的样本数为m，则称m/n为不大于u0的累积频率，计算得到累积频率曲线。以所有被测指标数据累积频率为75%的指标值作为隶属函数的阈值上限。6.3土壤微生物肥力指数模型采用主成分分析法确定单项评价指标的权重值Ci。根据作用效应曲线，建立隶属函数，计算各评价指标的隶属度Fi。利用累加法建立土壤微生物肥力指数模型，将所选的单个指标的评价结果转换为由各评价指标构成的土壤微生物肥力综合评价。土壤微生物肥力指数模型如公式(3)：DB15/T3609—20245MIF——土壤微生物肥力综合指数；ci——第i个评价指标的组合权重；Fi——第i个评价指标的隶属度。6.4土壤微生物肥力综合评价根据6.2.2确定的阈值上限，利用公式(2)计算各个土壤样品的隶属度值。然后应用公式(3)中所建立的土壤生物肥力指数模型，计算不同土壤样本的MIF值，其值在0～1之间。MIF值越大，代表黑土地土壤微生物肥力水平越高。DB15/T3609—20246微生物生物量测定A.1土壤微生物量碳的测定A.1.1方法原理新鲜土样经氯仿熏蒸24h后，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物量碳，用硫酸钾溶液提取微生物量碳，测定提取液中有机碳含量，根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤有机碳的差值及转换系数，计算土壤微生物量碳。A.1.2试剂配制A.1.2.1去乙醇氯仿（CHCl3量取适量的氯仿和二级水按1:2的比例置入分液漏斗中，充分震摇1min并静置分层后，慢慢放出底层氯仿于干燥的烧杯中，重复洗涤3次，得到无乙醇氯仿，向其中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在4℃、黑暗条件下保存。注意：氯仿具有致癌作用，所有操作应在通风橱中进行。A.1.2.2氢氧化钠溶液（1mol/L称取40g（精确至0.01g）氢氧化钠，用水溶解，定容至1000mL。A.1.2.3硫酸钾浸提剂（0.5mol/L称取174.26g（精确至0.01g）硫酸钾，用研钵磨成粉末，倒于2.5L塑料桶中，加水2L，盖紧螺旋盖置于摇床（150r/min）至完全溶解。A.1.2.4重铬酸钾标准溶液（0.2500mol/L称取12.26g（精确至0.0001g）重铬酸钾（优级纯）溶于600mL～800mL水中，加水定容至1000mL。A.1.2.5硫酸亚铁标准溶液（0.05mol/L称取14g（精确至0.0001g）硫酸亚铁溶于600mL～800mL水中，加浓硫酸5mL搅拌均匀，静止片刻后定容至1000mL。此溶液易被空气氧化而致浓度下降，每次使用时应标定其准确浓度。A.1.2.6邻菲啰啉指示剂：称取邻菲啰啉1.49g（精确至0.0001g）溶于含有0.7g（精确至0.0001g）硫酸亚铁或1g（精确至0.0001g）硫酸亚铁铵的100mL水溶液中。A.1.3仪器设备电子天平（感量0.0001g和0.01g真空泵，油浴锅（可控温180℃±5℃)，恒温培养箱（25℃A.1.4水分测定按照HJ613测定土壤样品的干物质含量。A.1.5样品测定新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土壤中可见植物残体(如根、茎和叶)及土壤动物(如蚯蚓等)，过2mm孔径筛并混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，并经常翻动，以避免局部干燥，至土壤含水量约为田间持水量的40%（以手感湿润疏松但不结块为宜）。如果土壤过于干燥，用水调节含水量至田间持水量的40%。将土壤置于密封的塑料桶内，在25℃±1℃下预培养7d~15d。桶内有适量水以保证相对湿度为100%，并在桶内放一小烧杯1mol/LNaOH溶液以吸收土壤呼吸产DB15/T3609—20247生的CO2。这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响以及植物残体对测定的干扰。经预培养的土壤应立即分析，否则，应置于4℃下保存，且分析前需在上述条件下至少再培养24h。A.1.6熏蒸称取经预处理的土壤50.00g共3份，分别置于100mL烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3个，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯1mol/LNaOH溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，干燥器底部还应加入少量水以保持湿度，用真空泵抽真空，在-0.07MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3min～5min。关闭真空干燥器阀门，于25℃±1℃黑暗条件下熏蒸24h。打开干燥器阀门时，由于空气进入应该能听见有明显嘶嘶的声音，否则，意味着抽真空不够或漏气，应重新进行熏取出土壤和氯仿（氯仿倒回贮存瓶，可再使用），将装土壤的烧杯转入清洁真空干燥器中，反复抽真空（-0.07Ma）直到土壤无氯仿味为止，否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。一般需要反复抽真空5～6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器，以加快去氯仿速度和效果。在熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为对照土壤。A.1.7浸提将熏蒸后的土壤无损转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol/L硫酸钾浸提剂，使土水比为1:2（土壤为质量单位g，浸提液为体积单位mL），振荡（25℃,300r/min）浸提30min，用中速定量滤纸过滤于100mL塑料瓶中。另称取等量的3份对照土壤于200mL聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100mL0.5mol/L硫酸钾浸提剂同上浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白，过滤后的浸提液应立即分析，或在-18℃下保存。A.1.8测定取10mL土壤浸提液于硬质试管中（解冻的浸提液在取样前应彻底混匀），加5.00mL0.2500mol/L重铬酸钾标准溶液，5.00mL浓硫酸，摇匀，并在每个试管口插入玻璃漏斗。将试管逐个插入铁丝笼中。再将铁丝笼沉入加热至175℃~185℃的油浴锅内，使管中的液面低于油面，待试管中的溶液沸腾时开始计时，溶液剧烈沸腾时，可能因溢出而造成损失，其间可轻轻提起铁丝笼在油浴锅中晃动几次，以使溶液温度均匀，并维持在175℃~185℃,5min后，将铁丝笼从油浴锅内提出，冷却片刻，擦去试管外的油液。把试管内的消煮液无损地转入250mL三角瓶中，用水冲洗试管及小漏斗，洗液并入三角瓶中，使三角瓶内溶液的总体积控制在50mL～60mL。加3滴邻菲啰琳指示剂，用硫酸亚铁标准溶液滴定剩余的重铬酸钾，溶液的变色过程是橙黄-蓝绿-棕红，即为终点。记录硫酸亚铁滴定量。A.1.9结果计算样品中有机碳含量以克每千克（g/kg）表示，按式（A.1）计算：C——样品中有机碳的含量，单位为克每千克（g/kg）；C——硫酸亚铁标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（moL/L）；V0——空白试验所消耗硫酸亚铁标准溶液体积，单位为毫升（mL）；V——试样试验所消耗硫酸亚铁标准溶液体积，单位为毫升（mL）；DB15/T3609—202480.003——1/4碳原子的毫摩尔质量，单位为克每毫摩尔（g/mmol）；1.10——氧化校正系数；m——称取土壤的质量，单位为克（gf——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%）；V1——用于测定的浸提液体积，单位为毫升（mL）。土壤微生物量碳含量以克每千克（g/kg）表示，按式（A.2）计算：Bc——土壤中微生物量碳的含量，单位为克每千克（g/kg）；Ec——熏蒸土壤浸提测定的有机碳－不熏蒸土壤浸提测定的有机碳，单位为克每千克（g/kgK——转换系数，取值0.45。结果保留三位有效数字。A.1.10精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。A.2土壤微生物量氮的测定A.2.1方法原理新鲜土样经氯仿熏蒸24h后，土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物量氮，用硫酸钾溶液提取微生物量氮，测定提取液中氮含量，根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤氮含量的差值及转换系数，计算土壤微生物量氮。A.2.2试剂配制A.2.2.1去乙醇氯仿（CHCl3同A.1.2中的去乙醇氯仿制备。A.2.2.2氢氧化钠溶液（1mol/L称取40g（精确至0.01g）氢氧化钠，用水溶解，定容至1000mL。A.2.2.3硫酸钾浸提剂（0.5mol/L称取174.26g（精确至0.01g）硫酸钾，用研钵磨成粉末，倒于2.5L塑料桶中，加水2L，盖紧螺旋盖置于摇床（150r/min）至完全溶解。A.2.2.4氢氧化钠溶液（400g/L称取400g氢氧化钠加水溶解，定容至1L。A.2.2.5硼酸溶液（20g/L称取20g硼酸加水溶解，定容至1L。A.2.2.6硫酸标准溶液（0.02mol/L准确移取5.56mL浓硫酸缓缓注入800mL水中，用水定容至1000mL，配制成浓度为0.1mol/L的硫酸标准溶液，按照GB/T601对其进行标定。将此溶液用水稀释5倍得到0.02mol/L的硫酸标准溶液。A.2.2.7指示剂：称取0.10g甲基红和0.50g溴甲酚绿指示剂放入玛瑙研钵中，加入100mL95%乙醇研磨溶解。A.2.3仪器设备电子天平（感量0.0001g和0.01g），真空泵，恒温培养箱（25℃±1℃)，凯氏定氮仪，摇床A.2.4水分测定DB15/T3609—20249A.2.5样品测定A.2.6熏蒸A.2.7浸提A.2.8消化取10.0mL浸提液（解冻的浸提液在取样前应彻底混匀）于250mL消化管中，加入0.100g硫酸铜，5mL浓硫酸，于电炉上消化，混合液消化变清后再回流3h。A.2.9测定按说明书检查凯氏定氮仪，空蒸15min洗管道。消化结束后，冷却，接在蒸馏装置上。将一三角瓶接在冷凝管的下端，并使冷凝管浸在三角瓶的液面下，三角瓶内盛有25mL20g/L硼酸吸收液和指示剂3滴。然后向消化管缓缓加入35mL400g/L氢氧化钠溶液，蒸馏5min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管的下端（洗入三角瓶中）。用0.02mol/L硫酸标准液滴定，溶液由蓝色变为酒红色时即为终点。记下消耗标准硫酸溶液的毫升数。A.2.10结果计算样品中氮含量以克每千克（g/kg）表示，按式（A.3）计算：N——样品中氮的含量，单位为克每千克（g/kg）；V1——滴定样品时消耗硫酸标准溶液的毫升数，单位为毫升（mL）；V0——滴定空白时消耗硫酸标准溶液的毫升数，单位为毫升（mLc——硫酸标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（moL/L）；0.014——氮原子的毫摩尔质量，单位为克每毫摩尔（g/mmolm——表示称取土壤质量，单位为克（gf——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%V2——用于测定的浸提液体积，单位为毫升（mL）。土壤微生物量氮含量以克每千克（g/kg）表示，按式（A.4）计算：Bc——土壤中微生物量氮的含量，单位为克每千克（g/kg）；Ec——熏蒸土壤浸提测定的氮含量－不熏蒸土壤浸提测定的氮含量，单位为克每千克（g/kgK——转换系数，取值0.45。结果保留三位有效数字。DB15/T3609—2024A.2.11精密度DB15/T3609—2024土壤酶活性的测定B.1土壤蔗糖酶活性测定B.1.1方法原理土壤蔗糖酶将蔗糖酶促水解为还原糖，还原糖与3,5-二硝基水杨酸在沸水浴中反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸，颜色深度与还原糖量呈正相关，因而可用还原糖量来表示蔗糖酶的活性。B.1.2试剂配制具体如下：b)蔗糖（C12H22O11）；c)磷酸氢二钠（Na2HPO4）；d)磷酸二氢钾（KH2PO4）；e)葡萄糖（C6H12O6）；f)3,5-二硝基水杨酸（C7H4N2O7）；h)酶促反应试剂：1)蔗糖水溶液（80g/L）：称取8.00g蔗糖加水溶解后并定容至100mL；2)磷酸缓冲液（pH5.5）；3)磷酸氢二钠溶液：称取11.876g二水合磷酸氢二钠用水溶解定容至1L（A液）；磷酸二氢钾溶液：称取9.078g磷酸二氢钾用水溶解定容至1L（B液取A液0.5mL，B液9.5mL混合均匀即可。i)葡萄糖标准液（1mg/mL）：预先将葡萄糖置98℃~100℃干燥2h，准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀备用（4℃冰箱中保存期不超过7d）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制；j)3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：称取0.50g3,5-二硝基水杨酸，溶于20mL2mol/L氢氧化钠溶液中再加入50mL水，再称取30g酒石酸钾钠，溶于上述溶液中，用水定容至100mL（保存期不超过7d）。B.1.3仪器设备电子天平（感量0.0001g和0.01g恒温培养箱，分光光度计。B.1.4标准曲线绘制分别吸取1mg/mL的葡萄糖标准液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mL于50mL比色管中，再补加水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出后立即于冷水浴中冷却至室温，用水定容至50mL，以空白管调零在波长540nm处比色，以吸光值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。B.1.5测定步骤DB15/T3609—2024B.1.5.1水分测定按照HJ613测定土壤样品的干物质含量。B.1.5.2样品测定称取5g土壤（精确至0.0001g如含量高可适当减少称样量置于50mL具塞三角瓶中，加入15mL80g/L蔗糖溶液，5mLpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合后，放入恒温培养箱，在37℃±1℃下培养24h，取出迅速过滤。准确吸取滤液1.00mL，注入50mL容量瓶中，加入3mLDNS试剂，沸水水浴5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用水定容至50mL，在分光光度计上于540nm处进行比色。注意事项:a)每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的水代替基质（80g/L蔗糖水溶液），其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的蔗糖、葡萄糖对实验结果的影响；b)整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解，即空白试验；c)如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。B.1.6结果计算蔗糖酶活性以24h，1g风干土壤可水解生成葡萄糖毫克数表示，按式（B.1）计算：X——样品中蔗糖酶的含量，单位为毫克每克每24h（mg/g·24h）；c1——加基质样品由标准曲线求得的葡萄糖的含量，单位为毫克每毫升（mg/mL）；c2——未加基质样品由标准曲线求得葡萄糖的含量，单位为毫克每毫升（mg/mL）；V——显色定容体积，单位为毫升（mL）；N——为分取倍数=浸出液体积（mL）／吸取滤液体积（mL）；m——表示称取新鲜土壤质量，单位为克（g）；f——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%）；t——表示土壤培养时间，单位为24小时（24h）。结果保留三位有效数字。B.1.7精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。B.2土壤脲酶活性测定B.2.1方法原理土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质，经土壤脲酶酶促基质水解生成氨，氨与苯酚—次氯酸钠在常温条件下作用生成蓝色靛酚，颜色深度与生成氨的量呈正比，用比色法测定氨的量来表示脲酶活性。B.2.2试剂配制B.2.2.2尿素（CON2H4）。DB15/T3609—2024B.2.2.3柠檬酸（C6H8O7）。B.2.2.4氢氧化钾（KOH）。B.2.2.5苯酚钠（C6H5ONa）。B.2.2.6次氯酸钠溶液：根据市售次氯酸钠溶液浓度稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%。B.2.2.7尿素溶液（100g/L称取10g尿素，用水溶解，定容至100mL。B.2.2.8檬酸盐缓冲液（pH6.7称取184g柠檬酸和147.50g氢氧化钾各溶于水中，将两溶液合并，用1mol/L氢氧化钠将pH调至6.7，用水定容至1000mL。B.2.2.9苯酚钠溶液（1.35mol/L称取62.50g苯酚钠溶于少量乙醇，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，用乙醇定容至100mL（A液称取27g氢氧化钠，用水溶解后定容至100mL（B液）。将A、B溶液保存在4℃冰箱中。使用前将A液、B液各20mL混合，用水定容至100mL。B.2.2.10氨的标准溶液：精确称取0.4717g经干燥箱105℃烘干3h硫酸铵溶于水并定容至1000mL，得到1mL含有0.1mg氨的储备溶液。使用前将上述溶液用水稀释10倍，配制成浓度为0.01mg/mL的工作液。B.2.3仪器设备电子天平（感量0.0001g和0.01g恒温培养箱，分光光度计。B.2.4标准曲线绘制在测定样品吸光值之前，分别吸取0.00、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00、13.00mL氨的标准溶液，移于50mL容量瓶中，然后加水20mL。再依次加入4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20min后显色，定容，配成浓度为0.0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6µg/mL的一组标准浓度。1h内在分光光度计578nm波长处比色。然后以氨浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。B.2.5测定步骤B.2.5.1水分测定按照HJ613测定土壤样品的干物质含量执行。B.2.5.2样品测定称取5g土样（精确至0.0001g如含量高可适当减少称样量）于100mL具塞三角瓶中，加入1mL甲苯，振荡均匀，15min后加入10mL100g/L尿素溶液和20mLpH6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃±1℃恒温箱培养24h。培养结束后过滤，过滤后吸取1.00mL滤液至50mL容量瓶中，再依次加入4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，边加边摇匀。20min后显色，用水定容至50mL。注意事项:a)每一个样品应做一个无基质对照，以等体积的水代替基质（100g/L尿素水溶液），其他操作与样品实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响；b)整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯度和基质自身分解，即空白试验；c)如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。B.2.6结果计算DB15/T3609—2024脲酶活性以24h，1g风干土壤可水解生成氨量的毫克数表示，按式（B.2）计算：…………………(B.2)X——样品中脲酶的含量（mg/g，24h）；c1——样品加基质吸光值由标准曲线求得的氨量(µg/mL）；c2——样品未加基质吸光值由标准曲线求得的氨量(µg/mLV——显色定容体积（mLN——为分取倍数=浸出液体积（mL吸取滤液体积（mLm——表示称取新鲜土壤质量，单位为克（g）；f——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%）；t——表示土壤培养时间，单位为24小时（24h）。结果保留三位有效数字。B.2.7精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。B.3土壤磷酸酶活性测定B.3.1方法原理本方法以磷酸苯二钠为基质，在磷酸酶的作用下，基质水解生成酚，使其与氯代二溴对苯醌亚胺试剂反应生成蓝色，颜色深度与酚含量呈正相关，用比色法测定游离的酚含量来表示磷酸酶的活性。B.3.2试剂配制具体如下：b)冰醋酸（C2H4O2c)无水醋酸钠（C2H3O2Na）；d)柠檬酸（C6H8O7e)磷酸氢二钠（Na2HPO4）；g)氢氧化钠（NaOH）；i)磷酸苯二钠（C6H5Na2PO4j)苯酚（C6H6O）；k)氯代二溴对苯醌亚胺（C6H2Br2CLNO）；l)醋酸盐缓冲液（pH5.0）：1)醋酸溶液（0.2mol/L）：准确移取11.55mL冰醋酸用水溶解定容至1L；2)醋酸钠溶液（0.2mol/L）：称取16.40g无水醋酸钠用水溶解定容至1L；3)准确移取14.80mL醋酸溶液（0.2mol/L）和35.20mL醋酸钠溶液（0.2mol/L）用水定m)柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：1)柠檬酸溶液（0.1mol/L）：称取19.20g柠檬酸，用水溶解定容至1L；DB15/T3609—20242)磷酸氢二钠溶液（0.2mol/L）：称取53.63g七水合磷酸氢二钠或71.70g十二水合磷酸氢二钠，用水溶解定容至1L；3)准确移取6.40mL0.1mol/L柠檬酸溶液加43.60mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水n)硼酸盐缓冲液（pH9.6）：1)硼砂溶液（0.05mol/L）：称取19.05g四硼酸钠，用水溶解定容至1L；2)氢氧化钠溶液（0.2mol/L）：称取8.00g氢氧化钠，用水溶解定容至1L；3)准确量取50mL硼砂溶液（0.05mol/L）加23mL氢氧化钠溶液（0.2mol/L）用水定容至200mL。o)磷酸苯二钠溶液（5g/L）：称取5.00g磷酸苯二钠，用醋酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液或硼酸盐缓冲液溶解定容至1L；p)氯代二溴对苯醌亚胺试剂：称取0.125g氯代二溴对苯醌亚胺，用10mL96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，放冰箱4℃冷藏保存。溶液颜色未变褐色之前均可使用；q)硫酸铝溶液（3g/L）：称取3.00g硫酸铝，用水溶解定容至1L；r)酚标准溶液（1mg/mL）：1)酚储备液：准确称取1g（精确至0.00012)酚工作液（0.01mg/ml）：准确移取10.00mL酚储备液，用水定容至1L。B.3.3仪器设备电子天平（感量0.0001g和0.01g恒温培养箱，分光光度计。B.3.4标准曲线绘制准确吸取0.00、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00、13.00mL酚工作液（0.01mg/ml置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后用水稀释定容至刻度，配成浓度为0.0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2、2.6µg/mL的一组标准浓度。30min后，于分光光度计上660nm处比色。以显色液中酚浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。B.3.5测定步骤B.3.5.1水分测定按照HJ613测定土壤样品的干物质含量。B.3.5.2样品测定准确称取5g（精确至0.0001g）土样（如含量高可适当减少称样量）置于100mL具塞三角瓶中，加入2.5mL甲苯，轻摇15min后，加入20mL5g/L磷酸苯二钠溶液，仔细摇匀后放入恒温培养箱，37℃±1℃下培养24h后取出，在培养液加入100mL3g/L硫酸铝溶液摇匀，并过滤。准确吸取3.00mL滤液于50mL容量瓶中，按绘制标准曲线方法显色，呈现蓝色，于分光光度计660nm处比色。B.3.6结果计算DB15/T3609—2024磷酸酶活性以24h，1g风干土壤可水解生成酚的量（mg）表示，按式（B.3）计算：…………………X——样品中磷酸酶的含量，单位为毫克每克每24小时（mg/g·24hc1——样品加基质吸光值由标准曲线求得的酚含量，单位为微克每毫升(µg/mL）；c2——样品未加基质吸光值由标准曲线求得的酚含量，单位为微克每毫升(µg/mLV——显色液定容体积，单位为微升（mL）；N——为分取倍数=浸出液体积（mL吸取滤液体积（mLm——表示新鲜土壤质量，单位为克（g）；f——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%）；t——表示土壤培养时间，单位为24小时（24h）。结果保留三位有效数字。B.3.7精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。B.4土壤过氧化氢酶活性测定B.4.1方法原理在4℃条件下，土壤过氧化氢酶酶促分解过氧化氢，用高锰酸钾标准溶液滴定反应剩余过氧化氢，所消耗的高锰酸钾标准溶液体积数来表示过氧化氢酶的活性。B.4.2试剂配制B.4.2.2浓硫酸（H2SO4）。B.4.2.3过氧化氢（H2O2）。B.4.2.4高锰酸钾（K2MnO4）B.4.2.5硫酸溶液（0.2mol/L准确移取5.43mL浓硫酸，缓缓注入400mL水中，冷却后用水定容B.4.2.6高锰酸钾标准溶液c（1/5K2MnO4）=0.1mol/L：称取3.30g高锰酸钾，溶于1050mL水中，缓缓煮沸15min，冷却，于暗处放置两周，过滤。贮存于棕色瓶中，并按照GB/T601对其进行标定。B.4.2.7过氧化氢水溶液（3%准确量取30%过氧化氢溶液25mL，用水定容至250mL，配成3%过氧化氢水溶液，置于4℃冰箱贮存，临用时用0.1mol/L高锰酸钾标准溶液标定。准确吸取1.00mL3%过氧化氢溶液于50mL三角瓶中，加入5mL水，5mL0.2mol/L的硫酸溶液，用0.1mol/L的高锰酸钾标准溶液标定，所消耗的体积数为16.51mL。于16.51mL时，说明过氧化氢的实际浓度大于或小于3%，这种B.4.3仪器设备电子天平（感量0.0001g和0.01g冰箱，酸式滴定管。B.4.4测定步骤DB15/T3609—2024B.4.4.1水分测定按照HJ613测定土壤样品的干物质含量。B.4.4.2样品测定分别称取5g（精确至0.0001g）土壤（如含量高可适当减少称样量）样品于具塞三角瓶中（用不加土样的作空白对照加入0.5mL甲苯，摇匀，于4℃冰箱中放置30min。取出，立刻加入25mL4℃冰箱贮存的3%过氧化氢水溶液，充分混匀后，再置于4℃冰箱中放置1h。取出，迅速加入25mL贮存于4℃冰箱的0.2mol/L硫酸溶液，摇匀后过滤。准确吸取1.00mL滤液于50mL三角瓶中，加入5mL水和5mL0.2mol/L硫酸溶液，用0.1mol/L高锰酸钾标准溶液滴定，滴定至紫色褪去出现浅粉色为终点。根据空白和样品的滴定差，求出相当于分解过氧化氢的量所消耗的高锰酸钾标准溶液。B.4.5结果计算过氧化氢酶活性以1h，1g风干土壤所消耗0.1mol/L高锰酸钾标准溶液的体积数来表示，按式（B.4）计算：…………(B.4)X——过氧化氢酶活性，单位为毫升每克每小时（mL/g·hV——样品所消耗的高锰酸钾标准溶液的滴定体积，单位为毫升（mLc——1/5高锰酸钾标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；m——表示新鲜土壤质量，单位为克（g）；f——表示土壤样品干物质含量，单位为百分含量表示（%）；t——表示土壤培养时间，单位为1小时（1h）。结果保留三位有效数字。B.4.6精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。B.5土壤硝酸还原酶活性测定B.5.1方法原理采用酚二磺酸比色法。在厌氧环境下，通过与酚二磺酸的蓝色反应，求出反应前后硝态氮量差值，用于表示硝酸还原酶活性。其反应式如：NO3-→NO2-→NH2OH→NH4+。B.5.2试剂配制B.5.2.21%葡萄糖。B.5.2.3CaCO3。B.5.2.4铝钾矾饱和溶液。B.5.2.5酚二磺酸：取3g重蒸酚与37g(20.1mL)浓H2SO4混合，在沸水浴上回流加热6h即成或直接使用商品化试剂。B.5.2.610%NaOH。B.5.2.7KNO3标准溶液：精确称取16.3052g重结晶KNO3溶于蒸馏水中并稀释至1L(1mL含10mgDB15/T3609—2024NO3-N)。使用前，将标准液再进行稀释(1mL含0.1m