【《吉氏巴贝斯虫病临床诊断及治疗分析报告》6500字（论文）】

吉氏巴贝斯虫病临床诊断及治疗分析报告吉氏巴贝斯虫病是一种由蜱传播，并寄生在红细胞中的一种原虫感染的血液寄生虫病。一般来说亚洲流行的病原体为吉氏巴贝斯虫和犬巴贝斯虫，但我国吉氏巴贝斯虫感染最为常见。其临床特点包括致使机体贫血、无特殊临床症状、发现期晚、致死率高、治疗昂贵等。随着我国社会和经济的发展，伴侣动物（犬类）饲养数量逐渐上升，而吉氏巴贝斯虫病的发病率也随之呈现出逐年上升的趋势。但目前国内关于犬吉氏巴贝斯虫病临床表现，治疗和预防方面数据资料较少，且临床病例缺乏代表性。本章设计根据2020.01-2021.12月山东省接诊巴贝斯虫病例的临床症状、诊断过程、治疗方法及预后情况进行总结分析，通过将两种治疗方法结合产生较好的临床治疗结果，为临床上正确诊断与治疗犬吉氏巴贝斯虫病提供参考数据。材料与方法1.1材料1.1.1试验动物2020.01-2021.12于山东省宠物医院采集共338份疑似吉氏巴贝斯虫血液样品。用EDTA抗凝管冷藏保存。1.1.2主要试剂及耗材Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司、中国)、琼脂糖（南京生兴生物科技有限公司）、2xTaqPCRMix、DNAMarker。1.1.3主要仪器设备MyGoPro荧光定量PCR仪（英国IT-IS公司），高速离心机(TG20WS、长沙湘智离心机仪器有限公司、中国)，高压灭菌锅(LDZX-18L上海申安有限公司、中国)，掌上离心机(D1008E、美国赛洛捷克SCILOGEX公司、美国)，全自动生化分析仪(BS-240VET、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，凝胶图形成像系统及分析软件(上海天能科技有限公司），垂直洁净工作台(BSW-1360V，青岛赛尚科技有限公司)等表2-SEQ表\*ARABIC1主要仪器设备表2-1主要仪器设备Table2-1Maininstrumentsandequipment仪器型号生产公司荧光定量PCR仪MyGoProBSW-1360V英国IT-IS公司高压灭菌锅LDZX-18L上海申安有限公司高速离心机TG20WS长沙湘智离心机仪器有限公司漩涡混合器VORTEX-5海门市其林贝尔仪器全自动生化分析仪BS-240VET深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司数显恒温水浴锅HH-4常州国华电器有限公司垂直洁净工作台BSW-1360V青岛赛尚科技有限公司1.2方法1.2.1临床检查临床上对于吉士巴贝斯虫病的临床检查和其他疾病检查方法都是一样的。主要检查方式为：问诊、视诊、触诊等。（1）问诊可以解动物详细信息。主要包括：疫苗驱虫情况、病程、患病动物日常的精神状态、患犬体表是否发现过蜱虫、患犬是否进行过治疗、外出史等。（2）通过视诊主要检查皮肤状态及被毛光泽、体温高低、可视黏膜颜色、齿龈颜色、尿液的颜色、精神状态，并根据实际情况做好记录。（3）通过触诊检查患犬的体表淋巴结是否肿大、动物水合状态是否脱水，同时触诊身体有无疼痛区域。1.2.2实验室检测实验室检查主要包括：血常规、血涂片、血液生化、尿液、影像学检查等。（1）血液样品采集将动物采血处被毛消毒。静脉采血使用黑三色头皮针防止针头过小造成红细胞破坏。将采集血液抗凝管中。溶血、凝血现象出现需要重新采集。（2）血常规检测血常规检查可检测20项与血细胞有关的项目。使用EDTA抗凝管中血液通过血细胞分析仪中进行检测。采用血常规检测主要是看RBC、HGB、HCT、MCV、PLT数值，根据这些数据我们可以准确判断受影响的患犬是否贫血以及贫血的程度并，由此可决定动物是否需要进行输血。也可判断机体是否发炎的情况及感染的严重程度；同时还会提示我们机体如果出现贫血，贫血是属于再生性还是非再生性。（3）生化检测生化可检测血液中17种指标。使用肝素锂内血液样本在全自动生化仪中开始检测。血液生化检测主要通过检测谷丙转氨酶(GPT)、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(ALP)、GGT、胆汁酸等评估患犬的肝胆系统功能，肾脏代谢能力是通过检测尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、UPC、SAMA、等指标来判读。结果可提示机体感染已经损伤到哪种器官并到达何种程度，同时也可看出动物是否脱水。（4）血液涂片的制作与判读取洁净载玻片两张，制作血涂片在10×100倍镜下观察红细胞中是否含有虫体。同时结果可判断：动物贫血性质、是否脱水、机体感染情况、观察白细胞形态、炎症是否已将超出机体的代偿。（5）尿液分析尿液分析主要包括尿液试纸条检查和尿沉渣显微镜观察。并观察尿液颜色、尿量和透明度。及时使用尿液分析剂纸条进行化检测白细胞、蛋白质、pH、隐血、比重等。同时离心剩余尿液吸管吸取底部混合着尿液的尿沉渣，通过显微镜检验进行检测。尿液分析是判断肾脏功能有效手段。（6）影像学检查影像学检查是疾病的临床特征和生化改变相互补充，主要通过B超和X线检查手段。CT和MRI应用较少。主要检查患病动物内脏大小、形态结构、回声是否异常来辅助判断内脏器官有无其他病变。1.2.3分子生物学检测（DNA提取）DNA提取，犬的血液基因组DNA利用Ezup柱式抽提试剂盒按照使用说明提取。56℃提前水浴BufferDL。移液器吸取50~100μL犬血液样品于1.5mL离心管中，加入150~200μLPBSSolution至总体积为200μL，混匀。加入20uLProteinaseK，混匀；再加入200μLBufferDL，震荡混匀，56℃水浴10min。加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀(加入无水乙醇后可能会产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用)。将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，10000r/min室温离心1min，倒掉收集管中废液。将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μLCW1Solution(CW1Solution用之前按比例加入无水乙醇)，10000r/min室温离心30s，弃去废液。将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μLCW2Solution(CW2Solution用之前按比例加入无水乙醇)，10000r/min室温离心30s，弃去废液。60℃提前水浴CEBuffer，将吸附柱盖子打开于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的CW2Solution。准备新的1.5mL离心管，将吸附柱置于新离心管上，加入50μLCEBuffer，静置3min，12000r/min室温离心2min，收集DNA溶液，将提取好的DNA样品置于-20℃冰箱层保存。1.2.4实时荧光定量PCR(q-PCR）试验分为发病组和未发病组以提取的DNA为模板，用Primer５设计已公布吉氏巴贝斯虫病致病基因引物（具体如表所示）。为验证引物的特异性，在实时荧光定量PCR之前用普通PCR做预实验验证。表2-2引物信息Table2-2PrimerInformation基因引物序列引物大小退火温度目的基因F：GGCTTTCGGTGATTCATAS：CCTTCCGTCAATTCCTTT17955内参基因F：GTCTTGTAATTGGAATGATGGTGACS：ATGCCCCCAACCGTTCCTATTA15158反应体系为：GreenMix12.5μL;ddH2O9.5μL；上下游引物各1μL；DNA模板1μL。反应程序为：95℃预变性7min;95℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸30s，共45个循环。实时荧光定量PCR与普通PCR每个样品各进行3次重复，实时荧光定量PCR结果采用Ct(2-ΔΔCt）值法计算目标相对于内参基因的表达量。结果2.1临床基础检查结果临床基础检查结果显示常见异常临床症状如统计2-3所示，临床上大部分主诉主要为是精神沉郁（90.6%）、厌食（95.8%）、体重减轻（25.5%）、有蜱虫接触史（100%）；临床检查发现：可视粘膜苍白（95.7%）、发烧（75%）、淋巴结肿大（18.9%）。少数感染严重的病例会出现的症状：包括皮肤黄染、多饮多尿、尿液颜色改变、脾脏、肝脏肿大等。结果表明：巴贝斯虫常见临床表现为体温升高、可视粘膜苍白、精神沉郁、厌食等。图2-3巴贝斯虫病7种常见临床症状及异常体况\o"添加到收藏夹"Figure2-3sevencommonclinicalsymptomsandabnormalbodyconditionsofbabesiosis2.1.1血常规结果分析对于患病犬只进行血常规查结果进行统计显示统计（如表2-4）所示。RBC平均值为2.98×1012/L，最低值为0.87×1012/L，严重低于正常参考范围的最低值（5.50-8.50×1012/L），病例统计中100%出现RBC低于正常值；血红蛋白的平均值为50g/L，98.6%的患犬血红蛋白低于正常范围（120-180g/L），最低值低至16g/L；红细胞压积的平均值为15.5%，在病例统计中HCT数值全部都在正常范围（37.0-54.0%）之下；80.8%的患犬的MCV高于正常范围（60.0-70.0fL）：PLT数目平均值也低于正常范围（110-460×109/L），最低值低至5×1012/L。243例患犬红细胞数据值大都严重低于正常范围。结果表明：吉氏巴贝斯虫裂解红细胞速度大于自身生成速度造成机体出现贫血症状；MCV增大说明吉氏巴贝斯虫不会抑制机体红细胞生成，动物机体贫血处于再生状态；PLT偏低则说明疾病会造成血小板损耗过大于机体产生。患病犬只白细胞总数升高，说明机体处于感染状态。表2-4吉氏巴贝斯虫病血常规统计Fig.2-4RoutinebloodstatisticsforBabesiagissiidisease项目白细胞数目红细胞数目红细胞压积血红蛋白平均红细胞体积血小板ItemWBC×109/LRBC×1012/LHCT(%)HGB(g/L)MCV(fL)PLT×109/L参考值6.0-17.05.50-8.5037.0-54.0120-18060.0-70.0110-460平均值29.42.982850.584.6117最高值87.85.0139.5140.8118.2689.7最低值4.30.8711.450.536.85偏高比例60.5%00080.6%8.6%偏低比例26.5%100%92%94.6%0%58.9%2.1.2血涂片结果分析吉氏巴贝斯虫患犬的静脉血涂片检查结果(如图2-5、2-6)显示。243例患犬中30%的患犬平均每个视野中可观察到疑似单个圆环或小杆状大小为1×3.1μm的虫体寄生在犬红细胞边缘或中央。通常一个红细胞内可发现1-2个虫体。血涂片中红细胞的体积大小不一，多染性红细胞和球形红细胞增多，红细胞色素低，网织红细胞增多，出现大量幼稚中性粒细胞、部分病例出现有核红细胞、海因茨小体、影细胞、血小板数量结果不一。结果表示：有发现吉氏巴贝斯虫的病例很容易进行确诊，但是临床医生主观意识、经验，很容易影响疾病准确诊断结果。此方法也需要很高的运气。红细胞大小不同、网织红细胞和有核红细胞出现提示着动物机体再大量的造血，并且机体存在严重的非常严重的贫血状态。球形红细胞、影细胞、海因茨小体的生成代表着红细胞膜被大量破坏，细胞内容物流出。血小板降低可能提示动物有出血可能性。图2-5染色下红细胞内单个吉氏巴贝斯虫（×1000）Fig.2-5StainasingleBabesiagibberiiinerythrocytes（×1000）图2-6染色下红细胞内多个吉氏巴贝斯虫Fig.2-6StainmultipleBabesiagirdiiinerythrocytes2.1.3生化结果分析临床收集的243例犬吉氏巴贝斯虫病例中，在临床统计结果如表2-8所示：74.1%TBIL高于正常范围(0-0.9umol/L)，最高值为50.7umol/L；45.8%ALT高于正常范围，最高达到238.3U/L；48.8%ALP高于正常值，最高的达到480.5U/L；68.6%的BUN高于正常范围，最高达到35.7mmol/L。总蛋白（TP）不同程度的有所升高、临床症状严重的动物会出现GLU降低、CREA、UPC、SDMA、胆汁酸均不同程度升高。结果表明：患病犬只肝脏细胞损伤，肝脏功能、肾脏功能异常。对于出现TP、GLU降低的动物提示肝细胞损伤75%以上预后不良。对于CREA升高较多的动物提示动物肾脏损伤严重，可能会发展成为慢性肾衰。图2-7吉氏巴贝斯虫病血液生化果统计Figure2-7BloodbiochemicalfruitstatisticsofBabesiageethrosis项目总胆红素谷氨酸转氨酶碱性磷酸酶尿素氮ItemTBIL（umol/L）ALT(U/L)ALP(U/L)BUN(mmol/L)参考值2-1510-11840-3002.5-9.6平均值26.6711.45289.5616.78最高值50.7238.3480.535.7最低值3.022.5145.66.6偏高比例74.1%45.8%48.8%87.6%2.1.4尿检结果分析临床上可观察到尿液颜色会偏深。根据疾病严重程度，颜色会从黄色变为红色。显微镜下可以观察到尿液中含有红细胞和白细胞，有大量颗粒管型和细胞管型出现。肾脏缺血梗死会导致肾小管上皮细胞脱落导致细胞管型最为常见。尿液试纸检测显示蛋白尿，尿比重升高，PH值大部分处于正常范围。结果表明：动物肾脏有不同程度损伤。2.1.5影像学结果分析患病动物的脾脏呈现全面性增大，脾脏上40%会有明显的低回声结构。肝脏大多数处于增大状态，回声会强于脾脏且不均匀。结果表明：脾脏增大可能为髓外造血。这是由于炎症性感染和严重贫血造成的。肝脏增大回声不均与，可能是疾病造成肝脏发炎而导致的。2.1.6分子生物学分析普通PCR产物利用２％琼脂糖凝胶电泳结果表明（如图2-8）：PCR后产物条带单一明亮，无引物二聚体及杂乱的条带，引物特异性良好，可用于荧光定量实验。图2-8琼脂糖凝胶电泳Figure2-8Agarosegelelectrophoresisq-PCR：q-PCR扩增曲线及溶解曲线（如图2-9）所示，曲线峰值清晰且单一，无杂乱的峰及多峰情况，可用于定量分析。所得结果用SPSS22.0处理，结果表明，发病组基因表达量极显著高于对照组（P＜0.01）。因此，认为q-PCR可作于区分发病组与对照组的良好手段。图2-9犬吉氏巴贝斯虫荧光定量PCR结果Figure2-9Real-timePCRresultsofBabesiacanis2.2吉氏巴贝斯虫治疗结果利用抗原虫药物杀灭病原的同时，根据患犬的临床症状进行对症治疗和营养支持疗法能起到比较好的治疗结果。本实验采取联合三氮脒、咪唑苯脲治疗同时应用多西环素、甲硝唑、克林霉素纠正继发感染，同时调节体况，取得较为不错的治疗结果，提高了治愈率。对因治疗通过使用特效药杀死机体内寄生虫，通过联合用药使用：三氮脒（3.5mg/kg，IM）、咪唑苯脲（3mg/kg，IM），在1d、3d和7d注射使用。同时配合使用克林霉素（11mg/kg，q24，SC/PO）、甲硝唑（15mg/kg，BID，PO/IV）和多西环素（5mg/kg，BID，PO）可以在控制寄生虫数量同时达到降低机体感染的作用。对症治疗巴贝斯虫病例由于潜伏较长，发并不明显，症状不严重，许多饲养者不会特别在意这些临床症状，所以就诊动物到医院身体机能相对较差，就诊时一般没有休克意识不清淅的情况出现。临床上对于HCT低于16%的患病动物，首先应采取措施为维持动物正常的生命体征，进行输血扩充血容量和加大组织灌流量，以缓解低血氧、低灌流量器官损伤。每输注2.2ML全血，HCT上升1%。输血结束，根据HTC数值算出所需输血量。输血的速度尚无统一定论。但是输血量一般不超过20ml/kg/d。由于全血在室温下保存超过6h可能会出现感染的情况，所以一般输血时间建议控制在4h以内。前半小时输血可较慢一些，观察动物出没出现呼吸窘迫、有无肺水肿发生，如没有可根据动物体况和输液量调整合适的输血速度。同时在输血前应皮下注射苯海拉明和地塞米松以防犬只出现输血不良反应。再输血后动物因抗凝血剂的原因通常可能会出现低钾低纳情况应补充葡萄糖酸钙和氯化钾。HCT在16%以上的患犬，可使用促红细胞生成素，来缓解临床症状，并做好监护如有降低趋势，及时进行输血；对于出现呕吐动物给予赛瑞宁和奥美拉唑，若严重呕吐上述治疗未见效果可加昂丹司琼联合用药进行止吐；对腹泻动物给予益生菌以调节胃肠道的异常菌群。对出现免疫介导性贫血动物可应用泼尼松龙和环孢素进行治疗。根据临床表现缓慢停药。（3）支持疗法主要有：抗感染、补充能量、调节代谢、增强抵抗力、保肝、饮食营养补充、促进食欲等，通过实验室检查和临床检查进行用药。抗感染常用的是林克霉素、多西环素、甲硝唑联合用药；常用的补充能量的药物为ATP；应根据血气检查结果进行水电解质代谢调节和组织代谢调节常应用乳酸林格、0.9%氯化钠、氯化钾进行调节；犬用乳铁蛋白粉、高免因子可以用来增加机体抵抗力等；保护肝脏：肝脏是许多水溶性维生素的储存和活化的重要器官应及时进行补充。S-腺苷甲硫氨酸（100mg/犬）：该药物可修复肝细胞功能并缩短恢复期需要长期服用。水飞蓟和腺苷甲硫氨酸多搭配使用，有协同作用。维生素K1：由于厌食症导致的维生素K1肠吸收减少，维生素B12每周2ml皮下注射有促进食欲缓解患病动物因钴胺素缺乏而引起的腹泻。营养补充可以经肠道营养补充一些商业化的补血产品，据个人临床经验患病犬口服阿胶口服液对于贫血改善有较为明显的作用。促进食欲可应用一些健脾的中药有良好的促进食欲的作用。3.讨论本研究共采集338份在临床表现和实验室检查疑似患病动物血液，运用分子生物学q-PCR方法共检测出243份酸阳性结果，阳率为71.89%。由于病例统计方法主要发现的是已表现出临床症状的犬，体检动物和健康动物体检往往不会有此项体检。无症状或感染初期病例不会到医院进行就诊，且病例统计的数据来源主要是根据临床医生提供，因临床经验的高低，有些患病动物