【《鸡球虫病的诊断研究国内外文献综述》4700字】

鸡球虫病的诊断研究国内外文献综述目录TOC\o"1-3"\h\u32441鸡球虫病的诊断研究国内外文献综述 133961.1传统方法 1294911.2血清学诊断 156041.3分子生物学诊断 221701参考文献 41.1传统方法传统方法一般根据临床症状、肠道病变、寄生部位、致病性和卵囊形态等指标来诊断鸡球虫病（李建梅等2009；JoynerandLong1974）。鸡感染不同种类的球虫往往出现不同的临床症状和肠道病变，如感染高致病性的E.tenella或E.necatrix会出现精神沉郁、翅膀下垂、食欲减退、腹泻、排血便甚至死亡，死后剖检可见被寄生部位的肠段高度肿大，呈深红色，浆膜层出现针尖大小的白色坏死点或大小不一的出血点，剪开肠道可见大量血凝块、粘液和坏死的肠黏膜，肠壁变薄；而感染E.mitis和E.praecox则主要表现为吸收不良、增重和饲料转化率降低，肠道病变也较轻（李武尧2012；汪明2003）。临床上，单个宿主常感染多种鸡球虫，从而导致肠道中寄生部位的重叠以及病变范围的变化；而同种球虫的不同虫株在致病性方面往往也存在差异，不能单独作为判断种类的依据（Shirley1985）。临床常用直接涂片法或饱和盐水漂浮法检查粪便样品中的卵囊来判断是否存在球虫感染，利用麦克马斯特氏法（MacMaster′smethod）得到每克粪便卵囊数（Oocystspergramoffeces，OPG）还能一定程度反映球虫的感染强度（汪明2003）。但若想通过卵囊形态鉴别鸡球虫种类，除了E.maxima有较大的淡黄色卵囊易于区分外，其它鸡球虫卵囊无极冒，无明显的卵孔，卵囊壁的结构和质地相似，孢子囊的形状和大小也无明显区别，因此鉴别有一定难度且需要专业人员（LongandJoyner1984）。1.2血清学诊断目前有很多用于检测鸡球虫病的血清学方法，如中和试验、琼脂免疫扩散法、子孢子和裂殖子溶解试验、子孢子制动反应、间接荧光抗体法和酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）等（Davisetal.1978）。Saatara等（1984）利用ELISA和间接血凝法（Indirecthemagglutilation，IHA）测定实验感染鸡对柔嫩艾美耳球虫的抗体反应，ELISA技术相对容易操作，比IHA检测更敏感，而且只需要IHA所需抗原的一小部分。Uchida等（1994）用卵囊制备的可溶性抗原进行ELISA发现，3种球虫（E.tenella、E.necatrix、E.acervulina）免疫鸡血清之间存在交叉反应，其中E.tenella和E.necatrix之间的交叉反应更为明显。利用免疫印迹法检测E.tenella卵囊抗原，同源抗血清检测出7条主条带，E.necatrix和E.acervulina抗血清分别检测出10条和6条主条带。1.3分子生物学诊断1.3.1同工酶分析早期Shirley（1975）利用同工酶分析，发现6种艾美耳球虫（E.brunetti、E.tenella、E.acervulina、E.maxima、E.praecox、E.necatrix）的乳酸脱氢酶、葡萄糖磷酸异构酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的淀粉凝胶电泳存在种内和种间差异，可以作为鉴别鸡球虫种类的指标，但由于试验分析需要大量的卵囊和复杂的操作，此方法的临床应用受到了一定程度的限制。1.3.2限制性片段长度多态性分析（Restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis，RFLP）Ellis和Bumstead（1990）首次将印迹分析（Southernblot）结合RFLP应用于鸡球虫鉴定，成功区分E.tenella、E.acervulina和E.necatrix等三种球虫。后来Woods等（2000）在变性凝胶上对第二内转录间隔区（Internaltranscribedspacer2，ITS-2）的扩增产物进行RFLP分析，制出了单个物种的特征图谱，成功对澳大利亚的6种鸡球虫种类（除了E.mitis）进行了鉴定，同时也证明ITS-2是具有实用性的遗传标记。1.3.3随机扩增多态性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD）Macpherson和Gajadhar（1993）首次利用RAPD技术成功鉴别来自不同宿主的7种艾美耳球虫，其中一种来自于鸡（E.tenella）。刘群等（2000）分析了国内4种鸡球虫和多个虫株间的RAPD多态性，发现RAPD技术可以用于鸡球虫种类鉴定，并且可用来筛选区分不同虫株的分子标记。RAPD的引物序列是任意的，不需要事先了解基因组序列，还可以用于筛选序列特征扩增区（Sequencecharacterizedamplifiedregion，SCAR），该区域可以作为物种特异性或虫株特异性遗传标记。虽然RAPD在球虫种内和种间鉴定都取得到了广泛应用，但是RAPD重复性较差，并且由于在电泳时多个序列可能隐藏在共迁移带中，这种技术不适用于混合感染的检测（MorrisandGasser2006）。1.3.4PCR随着不同分子标记的发现和各种PCR技术的发展，PCR在鸡球虫的鉴别诊断和系统发育分析方面发挥着举足轻重的作用。Stucki等（1993）基于E.tenella的5S核糖体DNA（5SribosomalDNA，5SrDNA），利用反向PCR技术扩增出特异性条带，证明核糖体RNA（RibosomalRNA，rRNA）基因可以用来鉴别球虫种类。Tsuji等（1997）结合PCR和RAPD技术，扩增出8种鸡球虫的小亚单位核糖体RNA（SmallsubunitrRNA，SSUrRNA）基因，发现有8条RAPD引物可用于种类的鉴定，建立了两步法聚合酶链反应成功鉴别8种鸡球虫（当时认为E.hagani也是一种鸡球虫）。Ogedengbe等（2011）比较了球虫部分线粒体细胞色素C氧化酶亚基（cytochromecoxidasesubunitI，COI）和接近完整的18SrDNA序列，将COI基因作为DNA条形码标记，建立了更可靠的用于球虫物种鉴定和系统发育分析的DNA条形码技术。Fernandez等（2003a，b）筛选出能够有效区分7种鸡球虫的RAPD引物，转换为种特异性SCAR标记后建立了能够同时检测7种鸡球虫的多重PCR方法。Vrba等（2010）基于SCAR标记的唯一单拷贝序列建立了可以定量检测7种鸡球虫的定量PCR（Quantitativepolymerasechainreaction，qPCR），能够检测到相当于单个孢子化卵囊的DNA量。Peek等（2017）将Vrba等（2010）的方法合并为3种多重qPCR方法，同时改变了提取方法以便能够直接分析新鲜粪便。研究显示，尽管鸡球虫rDNA本身较为保守，但是内转录间隔区（Internaltranscribedspacer，ITS）在虫种之间的长度和序列相对异质，因此可以作为良好的分子标记（王鑫等2009；夏延富2009；夏延富等2009；薛方民2007）。Schnitzler等（1998）基于4种鸡球虫的第一内转录间隔区（Internaltranscribedspacer1，ITS-1）序列设计了种特异性引物，建立的PCR方法仅需约25个卵囊便能检测出球虫。Lew等（2003）针对ITS-1序列用巢氏PCR来鉴定鸡球虫，You（2014）建立了可同时检测4种鸡球虫的多重PCR方法，检测阈为1～4pg；辛玲等（2008）针对ITS-1序列建立了3种鸡球虫的单轮PCR和多重PCR方法，最小检出量为0.5ng，范现成等（2019）在此基础上建立了E.tenella和E.maxima双重PCR检测方法。Gasser等（2001；2005）对7种鸡球虫ITS-2基因进行PCR扩增，分别利用基于荧光标记的自动化电泳法和毛细管电泳法进行电泳，筛选出色谱图上特异的色谱峰用于虫种鉴定，在鸡球虫混合感染时同样适用。Morgan等（2009）针对鸡球虫ITS-2序列，使用TaqManMGB技术和种特异性探针建立定量PCR（Quantitativepolymerasechainreaction，qPCR）方法，实现了对7种鸡球虫的特异性检测和定量。1.3.5环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）LAMP是一种简单、快速且相对便宜的诊断工具。Barkway等（2011）开发了一套针对7种鸡球虫的种特异性LAMP检测方法，能够检测到1到10个艾美耳球虫卵囊的基因组，相当于不到一个成熟裂殖体的基因量。1.3.6纳米PCR纳米PCR（Nanoparticle-assistedPCR，nano-PCR）是结合纳米技术与分子生物学的一种新型PCR方法，体系中的纳米粒子在反应中发挥着重要作用（Alietal.2018）。首先，某些纳米粒子具有良好的导热性，可以提高体系加热和冷却的速率。Li等（2005a）发现金纳米粒子优异的传热性能可以明显使普通PCR的灵敏度提高5~10倍，使实时荧光PCR的灵敏度提高104倍；还有研究者发现25nm的TiO2纳米粒子能够通过自身良好的导热性提高反应缓冲液的热导率来增强PCR效率，有助于大幅减少PCR反应周期，并增强DNA扩增（包括难以扩增的GC含量高的DNA模板）（AbdulKhaliqetal.2010）。其次，纳米粒子还能发挥与单链结合蛋白（Singlestrandbindingprotein，SSB）类似的作用，显著降低引物和模板的错配从而提高特异性。Li等（2005b）发现金纳米粒子能够提高PCR反应的特异性并推测可能和金纳米粒子发挥的类似SSB的机制有关，其增强效果甚至超过市面上可用的SSB；而氧化石墨烯（Grapheneoxide，GO）能够通过促进匹配的引物-模板复合物的形成，抑制错配引物的扩增来增强PCR反应的特异性（Wang2017）。另外，在PCR体系中，纳米粒子还能够吸附DNA聚合酶、Mg2+、寡核苷酸引物或DNA模板，使PCR反应物聚集，提高反应效率（Baietal.2015）。纳米粒子的这些作用，使得纳米PCR相较于普通PCR具有更高的敏感性和特异性，在病原检测方面的应用日趋广泛。纳米PCR近年来开始应用于不同寄生性原虫的检测，Gabriel等（2018）使用氧化石墨烯、氧化铜、氧化铝纳米颗粒和属特异性探针，建立了快速检测食脑性阿米巴原虫（Acanthamoebaspp.，Balamuthiamandrillaris，Naegleriafowleri）的纳米PCR方法并优化得到了针对不同食脑性阿米巴原虫的最佳纳米粒子用量。Upadhyay等（2020）发现在检测犬巴贝斯虫（Babesiacanisvogeli）和犬肝簇虫（Hepatozooncanis）的PCR体系中加入氧化锌纳米絮凝剂能够显著增强PCR检测灵敏度，同时在不影响DNA扩增产量的情况下，减少了约45%～50%的反应时间。目前尚未有利用纳米PCR特异性检测鸡球虫的相关报道。参考文献毕菲菲,郝振凯,孙霈,于咏兰,索勋,刘贤勇.2018.鸡球虫病防治药物及抗药性研究.寄生虫与医学昆虫学报,25(4):242-253董辉,索勋.2002.毒害艾美耳球虫的致病性研究.寄生虫与医学昆虫学报,9(3):129-135杜彩娟.2016.毒害艾美耳球虫子孢子cDNA文库的构建与筛选.[硕士学位论文].扬州:扬州大学范现成,马峋,张会军,唐欢,宋军科,赵光辉.2019.鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立.动物医学进展,40(2):17-21和潇,周宏生,杨再旭,和平.2010.鸡急性小肠球虫病诊断与药物试验.养殖与饲料,(12):16-17李超,顾小龙,卢春霞,廖琴,刘贤勇,索勋.2018.我国鸡球虫病流行病学研究进展.寄生虫与医学昆虫学报,25(4):230-241李佳暖,李得鑫,崔元,袁万哲,孙继国.2018.牛病毒性腹泻高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用.中国兽医学报,38(2):252-254李建梅,刘丹丹,任春芝,许金俊,陶建平.2009.和缓艾美球虫与早熟艾美球虫的分离与鉴定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