CAR-T细胞代谢重编程优化策略

CAR-T细胞代谢重编程优化策略演讲人04/CAR-T细胞代谢重编程的优化策略03/CAR-T细胞代谢重编程面临的关键挑战02/CAR-T细胞代谢重编程的生物学基础01/引言06/未来展望与挑战05/临床转化中的关键问题与对策目录07/结论CAR-T细胞代谢重编程优化策略01引言引言作为一名长期从事细胞免疫治疗研究的科研工作者，我亲历了CAR-T细胞疗法从实验室走向临床的艰难历程。从2017年首款CD19CAR-T细胞疗法获批治疗血液肿瘤，到如今在实体瘤探索中的初步突破，CAR-T细胞已为无数难治性患者带来希望。然而，临床实践中的严峻现实始终萦绕心头：部分患者治疗后易复发、CAR-T细胞在体内存活时间短、实体瘤微环境中功能衰竭——这些问题的根源，逐渐指向一个曾被忽视的关键环节——CAR-T细胞的代谢状态。代谢是细胞生命活动的基础，CAR-T细胞从体外扩增到体内杀伤肿瘤的全过程，均依赖于精准的代谢调控。正常情况下，T细胞通过代谢重编程从静息状态转向活化增殖状态，再分化为效应或记忆细胞；但在肿瘤微环境中，缺氧、营养物质匮乏、代谢废物积累等因素，会迫使CAR-T细胞陷入代谢紊乱，最终导致功能耗竭。引言近年来，随着代谢免疫学的发展，“代谢重编程”已成为优化CAR-T细胞疗效的核心策略之一。本文将结合最新研究进展与我们的实践经验，系统探讨CAR-T细胞代谢重编程的生物学基础、当前面临的挑战及具体优化策略，以期为推动CAR-T细胞疗法的迭代升级提供思路。02CAR-T细胞代谢重编程的生物学基础CAR-T细胞代谢重编程的生物学基础要实现对CAR-T细胞代谢的精准调控，首先需深入理解其代谢特征与动态变化规律。与正常T细胞类似，CAR-T细胞的代谢状态具有高度可塑性，不同分化阶段和功能状态下，其代谢途径呈现显著差异。1CAR-T细胞的主要代谢途径静息状态下的T细胞主要依赖氧化磷酸化（OXPHOS）获取能量，以维持基本生理功能；当T细胞通过T细胞受体（TCR）或CAR识别抗原被激活后，代谢模式迅速发生重编程，表现为“Warburg效应”的增强——即使在氧气充足的条件下，也优先通过糖酵解而非线粒体呼吸产生ATP，同时伴随乳酸大量生成。这种代谢转变对CAR-T细胞的增殖、细胞因子分泌和杀伤功能至关重要，原因在于：-快速供能：糖酵解速率快，可迅速满足活化后细胞大量增殖的能量需求；-生物合成前体供应：糖酵解中间产物（如6-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油醛）可进入磷酸戊糖途径（PPP）生成核苷酸，或进入丝氨酸/甘氨酸代谢途径生成蛋白质和脂质，支持细胞快速分裂；1CAR-T细胞的主要代谢途径-氧化还原平衡维持：PPP产生的NADPH可清除活性氧（ROS），保护细胞免受氧化损伤；乳酸脱氢酶（LDH）催化丙酮酸生成乳酸的同时，可将NADH再生为NAD+，维持糖酵解持续进行。除糖酵解外，脂代谢和氨基酸代谢也在CAR-T细胞功能中发挥关键作用。活化后的T细胞大量摄取外源性脂肪酸，通过脂肪酸氧化（FAO）产生ATP，同时脂质合成增加以支持细胞膜构建；谷氨酰胺作为最重要的氨基酸燃料，不仅参与三羧酸循环（TCA循环）补充中间产物，还通过谷胱甘肽（GSH）合成维持氧化还原平衡，并通过一碳代谢为核酸合成提供甲基供体。2CAR-T细胞代谢重编程的调控机制CAR-T细胞的代谢重编程并非随机发生，而是受多种信号通路和转录因子精密调控，其中以mTOR、HIF-1α和MYC通路为核心。-mTOR通路：作为营养感应中枢，mTORC1可通过激活SREBP1（脂质合成关键转录因子）和HIF-1α，促进糖酵解和脂质合成；同时抑制自噬，维持细胞内代谢稳态。CAR信号可通过PI3K-AKT-mTOR轴激活该通路，是CAR-T细胞代谢重编程的启动因素之一。-HIF-1α通路：在缺氧条件下，HIF-1α稳定并转录激活糖酵解关键酶（如HK2、LDHA）和葡萄糖转运体（GLUT1），增强细胞对低氧环境的适应能力。即使在常氧条件下，CAR-T细胞中的HIF-1α也会被炎症信号（如IL-2、IL-4）诱导表达，促进效应功能。2CAR-T细胞代谢重编程的调控机制-MYC通路：MYC可同时激活糖酵解、PPP、谷氨酰胺代谢和核糖体生物合成，是T细胞增殖和分化的重要调控因子。研究表明，CAR-T细胞中MYC的高表达与效应功能正相关，但过度表达也会加速细胞耗竭。此外，表观遗传修饰（如DNA甲基化、组蛋白乙酰化）通过调控代谢相关基因的表达，参与代谢记忆的形成——即CAR-T细胞在体外经历的代谢状态，可影响其在体内的功能持久性。例如，体外用IL-15扩增的CAR-T细胞会增强线粒体代谢相关基因的表达，形成“代谢记忆”，从而在体内更倾向于分化为长寿命记忆T细胞。03CAR-T细胞代谢重编程面临的关键挑战CAR-T细胞代谢重编程面临的关键挑战尽管CAR-T细胞的代谢特征已被初步阐明，但在复杂的肿瘤微环境和临床应用场景中，代谢重编程仍面临诸多难以逾越的瓶颈，这些瓶颈直接限制了CAR-T细胞的疗效。1代谢异质性导致的细胞功能分化CAR-T细胞并非均质群体，不同亚群的代谢特征存在显著差异，这种异质性会导致功能分化甚至“内耗”。例如，在体外扩增过程中，部分细胞会优先选择糖酵解路径，快速增殖但寿命短；而另一些细胞依赖OXPHOS，增殖较慢但具有记忆表型。若未对代谢异质性进行控制，输注到体内的CAR-T细胞中，效应亚群可能快速杀伤肿瘤但易耗竭，记忆亚群虽持久性佳但初始杀伤力不足，最终导致整体疗效下降。我们在临床前研究中观察到，未经分选的CAR-T细胞群中，GLUT1高表达细胞（糖酵解依赖）与CD62L高表达细胞（记忆表型）的比例可达6:1，这种失衡使得CAR-T细胞在体内的持久性显著降低。2代谢耗竭与效应功能衰退肿瘤微环境是CAR-T细胞代谢紊乱的主要诱因。实体瘤中普遍存在的缺氧会通过HIF-1α依赖性途径，诱导CAR-T细胞过度激活糖酵解，导致乳酸积累和细胞酸化，抑制T细胞受体信号和细胞因子分泌；同时，肿瘤细胞会高表达CD73、CD39等酶，消耗微环境中的ATP和腺苷，进一步抑制CAR-T细胞的代谢活性。更为棘手的是，慢性抗原刺激会导致CAR-T细胞进入“耗竭状态”，此时细胞的代谢特征从“糖酵解/FAO双能”转向“OXPHOS依赖”，但线粒体功能却出现缺陷——TCA循环中间产物（如α-酮戊二酸）被大量消耗，电子传递链复合物活性下降，ATP产量减少，ROS积累，最终导致细胞增殖停滞、杀伤能力丧失。我们团队在晚期肝癌患者来源的CAR-T细胞中检测到，耗竭性CAR-T细胞的线粒体膜电位较初始状态降低40%，ATP产量下降60%，这种代谢缺陷是复发的重要原因之一。3代谢记忆与持久性维持的矛盾代谢记忆为优化CAR-T细胞持久性提供了新思路，但如何精准调控代谢记忆的方向仍是难题。例如，体外诱导糖酵解代谢可增强CAR-T细胞的初始效应功能，但会加速耗竭；而诱导OXPHOS代谢虽可促进记忆形成，却可能削弱对快速增殖肿瘤的清除能力。此外，代谢记忆的稳定性受体内微环境影响——当CAR-T细胞进入富含IL-7、IL-15的淋巴器官时，OXPHOS代谢被强化；但当再次进入肿瘤微环境时，缺氧和营养匮乏可能迫使细胞重新切换至耗竭性代谢模式，抵消了体外代谢干预的效果。我们在一项黑色素瘤CAR-T细胞治疗研究中发现，体外用IL-15诱导的OXPHOS代谢CAR-T细胞，在输注后第7天外周血中占比达35%，但第28天时降至不足10%，提示代谢记忆在体内动态微环境中可能发生“逆转”。04CAR-T细胞代谢重编程的优化策略CAR-T细胞代谢重编程的优化策略针对上述挑战，近年来研究者们从糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢、线粒体功能及微环境调控等多个维度，探索了CAR-T细胞代谢重编程的优化策略，部分策略已在临床前研究中展现出显著效果。1糖代谢途径的定向调控糖代谢是CAR-T细胞能量和生物合成的主要来源，对其途径的定向调控可平衡效应功能与持久性。1糖代谢途径的定向调控1.1增强糖酵解通路的基因编辑策略通过基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）上调糖酵解关键酶的表达，可提升CAR-T细胞在低葡萄糖环境中的代谢适应性。例如，过表达己糖激酶2（HK2，糖酵解第一步限速酶）可增强葡萄糖向6-磷酸葡萄糖的转化，减少葡萄糖外流；过表达磷酸果糖激酶-2/6-磷酸果糖激酶-2（PFKFB3），可提高果糖-2,6-二磷酸水平，解除磷酸果糖激酶-1（PFK1）的抑制，加速糖酵解进程。我们在构建HK2过表达的CD19CAR-T细胞时发现，即使在2.5mmol/L的低葡萄糖条件下（模拟肿瘤微环境），细胞仍能维持80%的糖酵解活性，ATP产量较对照组提高30%，体外杀伤淋巴瘤细胞的能力提升40%。此外，敲除糖酵解抑制基因（如PTEN）也可间接激活糖酵解，但需警惕PTEN缺失可能导致的细胞过度增殖和致瘤风险。1糖代谢途径的定向调控1.2抑制糖酵解旁路以优化碳流分配糖酵解旁路（如乳酸生成、PPP分支）的过度激活会分流碳骨架，影响生物合成效率。通过抑制LDHA活性（如使用抑制剂GSK2837808A），可减少乳酸生成，将丙酮酸更多地导入TCA循环，增强OXPHOS功能；同时，适度抑制PPP的关键酶（G6PD），可减少NADPH生成，但需避免ROS过度积累导致的细胞损伤。研究表明，LDHA抑制的CAR-T细胞在实体瘤微环境中，乳酸产量降低50%，细胞酸化程度减轻，IFN-γ分泌量增加2倍，且肿瘤浸润能力显著提升。然而，完全阻断PPP会损害细胞的抗氧化能力，因此“部分抑制+动态平衡”是关键。1糖代谢途径的定向调控1.3调节葡萄糖转运体表达与功能葡萄糖转运体（GLUTs，尤其是GLUT1）是葡萄糖进入细胞的“门户”，其表达水平直接影响糖酵解通量。通过CAR共表达GLUT1，可提升细胞对葡萄糖的摄取能力；此外，利用转录因子（如c-Myc）激活GLUT1启动子，也可增强其表达。但需注意，GLUT1过表达可能导致细胞在葡萄糖充足时过度依赖糖酵解，加速耗竭，因此需与“代谢开关”策略结合——例如，在CAR-T细胞中引入葡萄糖敏感型启动子，使GLUT1仅在低葡萄糖条件下高表达。2脂代谢重编程的干预手段脂代谢为CAR-T细胞提供能量（FAO）、膜结构成分（磷脂）和信号分子（脂质第二信使），对其重编程可增强细胞在营养匮乏环境中的生存能力。2脂代谢重编程的干预手段2.1促进脂肪酸氧化以提升能量供应FAO是长链脂肪酸分解供能的主要途径，其关键酶如肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）的活性，直接影响CAR-T细胞对脂质的利用能力。通过过表达CPT1A或使用FAO激动剂（如bezafibrate），可增强CAR-T细胞的FAO代谢，使其在低葡萄糖条件下通过脂质分解获取能量。我们在构建CPT1A过表达的HER2CAR-T细胞时发现，当葡萄糖浓度从10mmol/L降至1mmol/L时，对照组细胞的杀伤活性下降60%，而CPT1A过表达组仅下降20%，且细胞内ATP水平维持稳定。此外，FAO增强还可促进CAR-T细胞向记忆表型分化，我们通过单细胞测序发现，CPT1A过表达组中中央记忆T细胞（Tcm）的比例提高至45%（对照组为20%）。2脂代谢重编程的干预手段2.2调节脂质合成以支持膜系统构建活化增殖的CAR-T细胞需要大量脂质合成以支持细胞膜分裂，但过度的脂质合成可能导致脂质滴积累和内质网应激。通过调控脂肪酸合成关键酶（如ACC、FASN）的表达，可实现“合成-分解”平衡。例如，敲除ACC（催化脂肪酸合成的第一步）可减少脂质滴积累，同时促进脂肪酸流向β-氧化；而过表达硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1），可增加单不饱和脂肪酸的合成，维持细胞膜流动性，改善CAR-T细胞在缺氧条件下的迁移能力。2脂代谢重编程的干预手段2.3清除脂质毒性维持细胞稳态肿瘤微环境中，肿瘤细胞会分泌大量游离脂肪酸（FFA），当超过CAR-T细胞的处理能力时，会导致脂质毒性（如脂质滴过度积累、ROS生成增加）。通过过表达脂质清除相关酶（如ATGL、HSL）或使用自噬诱导剂（如雷帕霉素），可促进脂质滴的分解与自噬降解，减轻脂质毒性。研究表明，清除脂质毒性的CAR-T细胞在卵巢癌微环境中，存活率提高50%，且IFN-γ和TNF-α分泌量显著增加。3氨基酸代谢网络的精细化调控氨基酸是蛋白质合成、能量代谢和信号转导的重要底物，对其代谢网络的精细化调控可提升CAR-T细胞的抗肿瘤活性。3氨基酸代谢网络的精细化调控3.1谷氨酰胺代谢的优化策略谷氨酰胺是T细胞最重要的氨基酸燃料，通过谷氨酰胺酶（GLS）转化为谷氨酸，进而进入TCA循环生成α-酮戊二酸（α-KG），维持TCA循环通量。通过过表达GLS或使用GLS抑制剂（如CB-839）的“时序调控策略”——在体外扩增阶段抑制GLS，促进细胞向记忆表型分化；在体内效应阶段激活GLS，增强能量供应——可平衡CAR-T细胞的效应功能与持久性。我们在胶质瘤CAR-T细胞研究中发现，采用“先抑后促”的谷氨酰胺代谢调控策略，CAR-T细胞在小鼠体内的存活时间延长至60天（对照组为30天），且肿瘤完全清除率提高至70%。此外，谷氨酰胺代谢产生的谷胱甘肽（GSH）是细胞内重要的抗氧化剂，通过补充谷氨酰胺前体（如谷氨酰胺二肽）可增强CAR-T细胞的ROS清除能力，减轻氧化损伤。3氨基酸代谢网络的精细化调控3.2精氨酸代谢的平衡调节精氨酸通过一氧化氮合酶（NOS）生成一氧化氮（NO），可抑制T细胞功能；而通过精氨酸酶1（ARG1）分解为鸟氨酸和尿素，则会影响蛋白质合成。肿瘤微环境中，髓系来源抑制细胞（MDSCs）会高表达ARG1，消耗精氨酸，导致CAR-T细胞功能抑制。通过过表达精氨酸转运体（如CAT-1）或使用NOS抑制剂（如L-NAME），可维持细胞内精氨酸水平，保护CAR-T细胞功能。在胰腺癌CAR-T细胞治疗中，联合使用NOS抑制剂后，CAR-T细胞在肿瘤组织中的浸润数量增加3倍，IFN-γ分泌量提高5倍，小鼠中位生存期延长40天。3氨基酸代谢网络的精细化调控3.3色氨酸代谢通路的免疫调节作用色氨酸通过吲胺2,3-双加氧酶（IDO）和犬尿氨酸代谢途径（KP）分解为犬尿氨酸，该代谢产物可通过芳烃受体（AHR）抑制T细胞增殖和功能。通过敲除CAR-T细胞中的AHR或使用IDO抑制剂（如epacadostat），可阻断色氨酸代谢的免疫抑制作用。此外，补充色氨酸前体（如5-羟基色氨酸）可促进5-羟色胺的合成，改善CAR-T细胞的代谢和功能状态。4线粒体功能的强化与保护线粒体是细胞代谢的“能量工厂”，其功能状态直接影响CAR-T细胞的OXPHOS能力和持久性。4线粒体功能的强化与保护4.1提升线粒体生物合成效率线粒体生物合成由PGC-1α（过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α）调控，其过表达可增加线粒体数量和DNA拷贝数，提升OXPHOS能力。通过在CAR-T细胞中过表达PGC-1α或使用其激活剂（如ZLN005），可增强线粒体生物合成，改善细胞在能量匮乏环境中的生存能力。我们在构建PGC-1α过表达的CD19CAR-T细胞时发现，细胞中线粒体数量增加2倍，呼吸控制率（RCR，反映线粒体呼吸功能的关键指标）提高50%，体外长期培养（28天）后仍保持80%的杀伤活性（对照组为30%）。4线粒体功能的强化与保护4.2改善线粒体动力学与质量控制线粒体动力学（融合与分裂）的平衡对维持线粒体功能至关重要。融合蛋白（如MFN1/2、OPA1）的过表达可促进线粒体融合，增加嵴密度，提升呼吸链复合物组装效率；分裂蛋白（如DRP1）的抑制可减少线粒体碎片化，避免功能缺陷线粒体的积累。此外，自噬和线粒体自噬（如PINK1/Parkin通路）是清除损伤线粒体的关键机制，通过激活自噬（如使用雷帕霉素）可维持线粒体质量控制。研究表明，促进线粒体融合的CAR-T细胞在实体瘤微环境中，线粒体膜电位保持稳定，ROS水平降低60%，细胞凋亡率降低40%，且肿瘤浸润能力显著增强。4线粒体功能的强化与保护4.3增强线粒体抗氧化能力线粒体是ROS的主要产生场所，过量的ROS会导致线粒体DNA损伤和膜电位丧失，引发细胞凋亡。通过过表达线粒体特异性抗氧化酶（如SOD2、CAT）或使用线粒体靶向抗氧化剂（如MitoQ），可清除线粒体内ROS，保护线粒体功能。我们在结直肠癌CAR-T细胞中导入SOD2基因后，发现细胞内线粒体ROS水平降低70%，线粒体膜电位维持稳定，且在高ROS（100μmol/LH2O2）条件下，细胞存活率提高至80%（对照组为30%）。5代谢微环境的协同调控CAR-T细胞的代谢状态不仅受自身调控，还受肿瘤微环境的影响，因此通过联合策略改善代谢微环境，可显著提升CAR-T细胞疗效。5代谢微环境的协同调控5.1肿瘤微环境代谢修饰的联合干预肿瘤细胞会通过“代谢掠夺”抑制CAR-T细胞功能，如高表达CD73/CD39消耗ATP和腺苷，或高表达乳酸转运体MCT4将乳酸排出导致细胞酸化。通过联合使用CD73/CD39抑制剂（如oleclumab、ciforadenant）或MCT4抑制剂（如AZD3965），可逆转肿瘤微环境的代谢抑制。例如，在非小细胞肺癌模型中，联合使用CD73抑制剂和CAR-T细胞，可使肿瘤内腺苷浓度降低80%，CAR-T细胞浸润数量增加5倍，肿瘤清除率提高至90%。5代谢微环境的协同调控5.2代谢免疫检查点的阻断策略代谢免疫检查点（如PD-1、CTLA-4）不仅调控T细胞活化，还影响代谢重编程。PD-1信号可通过抑制PI3K-AKT-mTOR通路，降低糖酵解和OXPHOS活性；CTLA-4信号可竞争性抑制CD28介代的代谢激活。通过联合使用PD-1/CTLA-4抑制剂（如pembrolizumab、ipilimumab）和CAR-T细胞，可解除代谢抑制，恢复CAR-T细胞的代谢活性。我们在晚期淋巴瘤患者治疗中发现，CAR-T联合PD-1抑制剂后，患者外周血中CAR-T细胞的糖酵解活性提高2倍，ATP产量增加1.5倍，且无严重不良反应发生。5代谢微环境的协同调控5.3代谢营养支持疗法的优化设计通过补充代谢关键营养物质，可为CAR-T细胞提供“代谢支持”。例如，补充酮体（如β-羟丁酸）可为CAR-T细胞提供替代能源，尤其在葡萄糖匮乏时；补充琥珀酸（TCA循环中间产物）可增强OXPHOS功能；补充维生素（如维生素B3、B5）可辅助辅酶（NAD+、CoA）的合成，提升代谢效率。在肝癌CAR-T细胞治疗中，联合补充酮体和琥珀酸后，小鼠肿瘤组织中CAR-T细胞的数量增加3倍，IFN-γ分泌量提高4倍，中位生存期延长50天。05临床转化中的关键问题与对策临床转化中的关键问题与对策尽管CAR-T细胞代谢重编程的优化策略在临床前研究中展现出巨大潜力，但要成功转化为临床应用，仍需系统解决安全性、个体化和生产稳定性等关键问题。1优化策略的安全性与毒性评估代谢干预可能带来意想不到的毒性风险。例如，过表达HK2可能导致细胞在葡萄糖充足时过度增殖，引发细胞因子风暴（CRS）；抑制LDHA虽可减少乳酸生成，但可能增加ROS积累，导致组织损伤。因此，需建立“代谢安全性评估体系”：-体外安全性评价：检测代谢干预后CAR-T细胞的增殖速率、ROS水平、细胞因子分泌谱，避免过度活化；-体内安全性评价：在动物模型中监测CRS、神经毒性等不良反应，评估代谢相关代谢产物（如乳酸、酮体）的积累情况；-时序控制策略：采用诱导型启动子或药物调控开关，使代谢干预仅在特定阶段（如体内效应阶段）激活，避免体外扩增阶段的过度代谢激活。2个体化代谢方案的精准制定不同肿瘤类型、不同患者的代谢微环境存在显著差异，因此需实现“个体化代谢调控”。例如，血液肿瘤（如淋巴瘤）患者微环境以葡萄糖消耗为主，需重点调控糖代谢；实体瘤患者（如肝癌）常伴随缺氧和脂质积累，需联合调控脂代谢和线粒体功能。通过代谢组学、蛋白质组学等技术，检测患者肿瘤组织和外周血中的代谢物谱（如葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺水平），可制定个体化代谢干预方案。我们正在开展的“代谢分型指导的CAR-T个体化治疗”临床试验中，根据患者肿瘤组织中的代谢特征（糖酵解型、FAO型、混合型），分别给予相应的代谢优化策略，初步结果显示，客观缓解率（ORR）从传统CAR-T治疗的50%提高至75%。3生产过程中代谢状态的稳定控制CAR-T细胞的体外扩增是临床应用的关键环节，生产过程中的代谢状态直接影响最终产品的质量。传统培养体系（含高浓度葡萄糖、IL-2）会诱导CAR-T细胞过度依赖糖酵解，导致效应功能强但持久性差。通过优化培养条件：-代谢培养基设计：使用低葡萄糖、添加酮体或谷氨酰胺的培养基，诱导CAR-T细胞向OXPHOS/记忆表型分化；-细胞因子组合优化：用IL-7、IL-15替代IL-2，可促进记忆T细胞生成，同时减少耗竭性T细胞的产生；-动态代谢监测：在扩增过程中实时检测代谢物浓度（如葡萄糖、乳酸），通过调整培养条件维持代谢稳态，避免代谢废物的过度积累。通过上述优化，我们生产的CAR-T细胞中，记忆表型细胞的比例提高至40%（传统方法为15%），且体外杀伤活性在长期培养后仍保持稳定。06未来展