多色组合原则和工具(includeIMAG)

多色组合原则

BD生物科学

鲍梅艳Maggie_百年BD全球足迹BD是由Becton和Dickinson于1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的开发、生产和销售医疗设备、医疗系统和试剂的医疗技术公司之一，目前经营超过产品10000余种。BD致力于提高全世界人类的健康水平，并以其领先的技术、卓越的产品质量和诚实可信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。BD在世界50多个国家和地区设有分支办事机构、研究发展中心和制造工厂，业务遍及世界六大洲，全球雇员约29,000人。百年BD持续创新1897公司成立

1906第一家美国注射器针头工厂

1924第一支胰岛素专用注射器

1942第一支青霉素专用注射器

1949第一支真空采血管 1952第一次生产使用一次性医疗器械 1954第一支可弃式小儿麻痹症疫苗注射器 1962第一个开始大批量生产注射器和针头 1968第一组全自动血培养系统 1973第一台流式细胞仪 1988第一支安全型注射器

1991第一支自毁式疫苗注射器

1993第一支密闭式留置针

BDBiosciences-PharmingenBDBiosciences-PharmingenFoundedinJune1987LocatedinSanDiego,CASuppliesreagentsforImmunology,CellBiology,CytokineBiologyandMolecularBiologyAcquiredbyBDin1997AllBDPharmingen™reagentsareRUOonlyandnotGMP(onlyforSanJoseplant)Review多色补偿调节多色配色原则多色工具及新染料pensation

多色补偿调节荧光染色对照的设置1阴性对照空白对照自发荧光，即不经荧光染色细胞荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强实验样本特异荧光，即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光同型对照（自发荧光＋非特异荧光）合适？同型对照同型对照（IsotypeControl）：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型（即Fc段相同，F(ab’)2段不同）与染色的单克隆抗体①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型③相同荧光素标记④相同剂量和浓度⑤但由未免疫动物血清纯化而来用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（γ2a），并分别标记FITC和PEFluorescenceSpectrumViewerspectraloverlap如何解决？荧光染色对照的设置补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发生光谱重叠时）荧光补偿pensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发生光谱重叠（spectraloverlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号已染色样本？真双阳？假双阳？荧光染色对照的设置补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时）荧光补偿pensation）使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色

※几色分析需要制备几个补偿对照管分析类型管功能加入的抗体双色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2pensation1A-FITCγ2a-PE3pensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PENo.AntibodyIsotypeMouseanti-human未免疫Mouse血清纯化而来1A-FITC（γ1）γ1-FITC2B-PE（γ2a）γ2a-PERelativeIntensity650nm700nm500nm550nm600nmWavelength

(nm)Detector-%SignalFITCpensationFL1530/30FL2585/42FITCpensation24.8%oftheSignalSensedinFL2650nm700nm500nm550nm600nmRelativeIntensityWavelength

(nm)Figure

CFL1530/30FL2585/42650nm700nm500nm600nmRelativeIntensityWavelength

(nm)550nmPEpensationFL3650andHigherFL1530/30FL2585/42OptimalpensationpensationExamplesUndepensationOvepensationNotenoughsubtractedToomuchsubtractedB、多色组合原则按照机器设置染料的亮度与抗原表达相匹配同种细胞的Marker染料重叠最小化尽量避免偶联染料的使用带来假阳性如果可能，用红激光做自发荧光高的样本。染料选择-按照机器设置6-color8-colorAdditionalFITCorAlexa488FITCorAlexa488FITCorAlexa488PEPEPEPE-CF594orPE-TexasRedorPE-Alexa610/594PE-CF594orPE-TexasRedorPE-Alexa610/594PerCP/PE-Cy5/PerCP-Cy5.5PerCP/PE-Cy5/PerCP-Cy5.5PerCP/PerCP-Cy5.5/PE-Cy5/PE-Cy5.5PE-Cy7PE-Cy7PE-Cy7APCorAlexa647APCorAlexa647APCorAlexa647APC-Cy5.5/Alexa680orAlexa700APC-Cy5.5/Alexa680orAlexa700APC-H7/APC-Cy7APC-H7/APC-Cy7APC-H7/APC-Cy7BV421HorizonV450/V500PacificOrange,Q-dots120荧光染料的强度CD5CD8染料选择2表达强弱-

AntigenDensity染料选择2Example高表达的抗体可用不太亮的染料，低/弱表达的Marker用亮的染料Example:CD8“bright”PacificBlueCD7“lessbright”PECD8=90Kmolecules/cellCD7=20Kmolecules/cell荧光染料光谱重叠最小化spectraviewer3光谱重叠会导致数据丢失CD45-FITCDimCD4-PECD45FITC漏到PE，CD4PE弱信号分不开CD45-PerCPDimCD4-PECD45PerCP不漏到PE，弱CD4可以分开Upensatedpensateddataspreadduetospillover1）采用多激光激发减少重叠同一细胞的抗原,用不同激光激发减少重叠Example:CD3“bright”APC-Cy7CD7“lessbright”PEBothantigensexpressedonsamecell,lowspilloverofCD3intoCD7andviceversa.CD3=124Kmolecules/cellCD7=20Kmolecules/cell2）避免双激发荧光染料荧光染料可被不止1laser激发，导致光谱重叠干扰，影响结果.AmCyan可被Violet（405nm)和Blue（488nm)(FITCdetector).PE-Cy5可漏到APCdetector.WithoutCD45AmCyan:WithCD45AmCyan:CD19FITCOnlyanissuewhenthetwomarkers(CD45andCD19)areco-expressedonthesamecellpopulation.0hours2hours22.5hoursPECD8CD3PE-Cy5PE-Cy7样本曝光时间PerCP避免同一细胞使用偶联染料4由于tandem-dye降解会产生假阳性A.FalsepositivesinAPCchannelreducedinabsenceofAPC-Cy7FalsepositivesinPEchannelremainCD8APC-Cy7+cellsCD4PE-Cy7+cellsB.WithCD8APC-Cy7andCD4PE-Cy7WithoutCD8APC-Cy7避免同一细胞使用偶联染料避免染料和其衍生物（tandem-dye）在同一细胞上标记，或者选用更稳定的tandem-dye4BDHorizonTMV500CD45BDTMAPC-cy7CD14FITCCD8PerCP-CyTM5.5CD4BDHorizonTMV450CD3APCCD19PE-Cy™7CD56PECD80FluorochromeAntigenBDHorizonTMV500CD45BDTMAPC-cy7CD14FITCCD8PerCP-CyTM5.5CD4BDHorizonTMV450CD3APCCD19PE-Cy™7CD56PECD80FluorochromeAntigen不同细胞不同细胞NewTandemsAreMoreStableAPC-H7toreplaceAPC-Cy7:parisonofSampleStability(inBDStabilizingFixativeatRT)0501001502002500124682448Hoursoflightexposure%SpilloverCD4APC-H7CD8APC-H7CD4APC-Cy7CD8APC-Cy7自发荧光多的选择用红激光激发的染料BDHorizonTMV500CD45BDTMAPC-H7CD14FITCCD8PerCP-CyTM5.5CD4BDHorizonTMV450CD3APCCD19PE-Cy™7CD56PECD80FluorochromeAntigenPerfect!5多色组合原则1、按照机器设置：激光器（488nm？633nm？）/通道（滤光片530/30?585/42?）2、染料的亮度与抗原表达相匹配：强弱搭配3、同种细胞的Marker染料重叠最小化：不同激光器激发/避免双激发染料4、尽量避免偶联染料的使用带来假阳性：不同细胞5、自发荧光高的样本：红激光激发C、多色应用工具及新染料35

BrilliantViolet™421

BrilliantViolet™421ExMax:407nmEmMax:421nmand448nm用标准的HorizonV450filter:450/50nmBrilliantViolet™421

：极亮极亮：更好的细胞分群亮的染料使细胞分群更明显阳性率增加

PerCP-Cy5.5CD279PEBrilliantViolet™42120%26%31%CD18444%79%溢漏更少BV421V450V500稳定：StabilityinPFAfixativesSamplePrepTestingCriteriaStabilityResultsFixcells&storeinStainBuffer

@4CinthedarkAbilitytoresolvepositive&negativepopulations≥96hoursStainIndexdoesnotchangemorethan25%ofTime072hoursFixcells&storeinFixative@4CinthedarkAbilitytoresolvepositive&negativepopulations≥96hoursStainIndexdoesnotchangemorethan25%ofTime048hours(1%PFA)24hours(4%PFA)BV421特点总结极亮溢漏更少稳定应用：MulticolorBV421是多色组合的理想选择尤其是弱表达/低表达Panels（FACSVerse）很亮的10色组合BrilliantViolet™605PolymerbasedtandemdyedevelopedbySirgenBV421+Cy3.5=BV605ExMax:407nmEmMax:602nmpatiblewithstandardfilter:610/20nmshouldalsoworkinrmendedfiltersfor:QDot605:605/20,eFluor605NC:610/4055Optimal3rdColorfortheVioletLaserAdditionalBrightDyeBrightnessissimilartoPE57LowspilloverintoadjacentchannelsSpilloverdataintoPE-CF594channeldetectedwithabluelaserand610/20filter.谢谢BDImag磁珠分选BDIMag磁珠分离系统步骤1向细胞悬液中加入抗体标记的磁珠2磁珠通过特异性抗体与带有相应抗原的细胞结合3置于磁场中，与磁珠连接的细胞被磁场吸附4吸去上清，带有抗原的细胞留在试管里，其他细胞在吸出的上清中正选法:去除上清，将试管移出磁场，分析被磁珠捕获的细胞，即为目的细胞负选法:分析上清，目的细胞在上清液中其他磁珠分选系统目前的2种磁性细胞分离系统：

Smallparticles(≈50nm)－MACSLargeparticles(1200~4500nm)－others磁珠分离系统的重要指标：Purity&Recovery大磁珠小磁珠优点：技术简单，分离可在试管中完成速度快，得率较高便宜优点：对细胞，不影响分离细胞的后续培养可直接上流式检测，不影响散射光缺点：影响细胞生物活性及功能,影响后续培养纯度低不能直接上流式，FCM喷嘴

缺点：需要很强的磁场来分离细胞必须用一次性分离柱，不能在普通试管进行速度慢，耗时长，昂贵大小磁珠分离的优缺点

优势：技术简单，分离在试管中完成纯度高，