甘薯健康种苗工厂化组培扩繁技术规程

甘薯健康种苗工厂化组培扩繁技术规程

（征求意见稿）

1范围

本文件规定了甘薯健康种苗工厂化组培扩繁的术语和定义、品种选择、组培

工厂建设、茎尖脱毒、病毒检测、组培生产以及种苗档案记载等技术要求。

本文件适用于育苗企业及科研单位甘薯健康种苗工厂化组培扩繁生产。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其

中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文

件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T3537甘薯脱毒种薯（苗）生产技术规程

NY/T402脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程

NY/T1200甘薯脱毒种薯

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1甘薯茎尖分生组织sweetpotatomeristem

甘薯茎尖部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群

3.2茎尖脱毒virus-freestemtip

通过茎尖分生组织培养获得无甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）、甘薯潜隐病毒

（SPLV）、甘薯G病毒（SPVG）、甘薯退绿斑病毒（SPCFV）、甘薯褪绿矮化病毒

（SPCSV）和甘薯双生病毒（Sweepoviuses）感染的种苗植株。

4甘薯健康种苗组培工厂规划设计

4.1甘薯健康种苗组培工厂选址

选择距离甘薯产区具有一定距离、交通运输便利、粉尘较少、空气及水源环

境条件较好、可承载一定建筑面积的区域进行新建或改扩建甘薯健康种苗组培工

厂

4.2甘薯健康种苗组培工厂规划

根据甘薯健康种苗组培生产需求，配置不同功能区域，包括：实验室：主要

用于培养基配制等；灌装室：主要用于培养基制作装灌；灭菌室：主要用于培养

基灭菌；无菌储藏室：主要用于培养基冷却和储备；更衣室：主要用于实验服、

鞋子、头套等更换、消毒；接种室：主要用于茎尖脱毒、试管苗继代等工作；培

养室：主要用于试管种苗培养；病毒检测室：主要用于种苗病毒病检测；清洗区：

主要用于培养瓶、植株等清洗；仓库：主要用于培养瓶、瓶盖等物资的储藏；参

观通道：用于日常参观学习等。

不同功能区域构成一个完整的组培工厂系统，布局上既要考虑不同功能室的

功能需求，又要考虑操作的连贯性。每个功能室的面积、光线、通风状况、灭菌

要求等各不相同，可根据现有条件合理布局，科学划分出各个功能区域。同时根

据自身实际的发展规划要求，做好建设规划，满足未来的扩张、产能增加等发展

需求。

4.3甘薯健康种苗组培工厂建设要求

4.3.1卫生环境

保持组培工厂洁净，这是组培快繁成功的最基本要求，是从根本上有效控制

污染的关键。组培工厂建设时，应当采用灰尘产生最少的建筑材料，墙壁、天花

板、地面的交界处，宜做成弧形，便于日常的清洁，管道尽量暗装，安排好暗装

管道的走向，确保维修时不造成污染，下水道开口位置应对实验室洁净度的影响

最小并有避免污染措施。接种室、培养室选择耐清洁、冲洗、灭菌材料，配置能

确保其洁净度相应的控温、控湿设施。

4.3.2设施系统

4.3.2.1基本设备需求

配备包括电脑、标签机、电子天平、移液枪、PH仪、搅拌机、超纯水机、加

热器、冰箱、灌装机、灭菌锅、空调、温湿度计、除湿机、超净工作台、灭菌器、

显微镜、小推车、培养架、离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、凝胶成像系统、

水平电泳仪、超微量分光光度计、超低温冰箱、水浴锅、旋涡混合仪、液氮研磨

仪、制冰机、微波炉、通风厨、洗瓶机等健康种苗生产所需设备。

4.3.2.2灭菌系统

在灭菌室、储藏室、更衣室、接种室、培养室、走廊等无菌工作区域，利用

具有臭氧功能的紫外灯建立紫外臭氧灭菌系统。

4.3.2.3新风系统

安装带有灭菌功能的新风机，建立组培工厂新风系统，保证组培工厂内的空

气循环，排出生产过程中室内陈风及频繁灭菌产生的有害物质、异味等

4.3.2.4电力控制系统

组培工厂内灌装室、灭菌室、接种室、培养室等用电较大，应计算每个功能

室功率，且最少预留25%以上的用电冗余，最好做到一室一漏电开关控制，确保

组培工厂的安全生产。

4.3.2.5环境控制系统

利用米家等智能家居设备及传感器等相互协作建立组培工厂环境控制系统，

监测及调控组培工厂内温度、湿度、气体等环境条件。

4.4甘薯健康种苗组培工厂环境条件

储藏室，温度控制不超过20℃，湿度不超过40%，防止菌落滋生。

接种室，温度控制不超过20℃，湿度不超过40%，防止菌落滋生。

培养室，温度区间控制在24-28℃，光照8-16小时，光照强度2000-4000lx。

其他区域，保证卫生环境干净整洁。

5、灭菌消毒

5.1组培工厂霉菌消毒

组培工厂建设完成，使用前对室内区域进行全面灭菌消毒，通过75%酒精、

巴氏消毒液或二氧化氯、高锰酸钾等药剂熏蒸方式进行全面灭菌消毒

5.2接种组培室日常消毒

接种室消毒：采用紫外加臭氧结合的灭菌方式，于每天工作结束后进行紫外

灭菌30分钟，臭氧沉降1-2个小时，既不影响白天正常工作，又能灭菌相对彻

底。

组培室消毒：组培室应定期消毒，可用紫外灯消毒灭菌或熏蒸消毒等方式,如

每1m3用二氧化氯1g、高锰酸钾5g，密闭熏蒸24h，彻底通风后使用。

5.3器具消毒

所有进入接种室、培养室器皿、器具等均采用75%酒精消毒，并于紫外等照

射20min

超净工作台使用前应用紫外灯照射20min，接种时打开风机，台面及内壁用

75%乙醇消毒。

操作过程中镊子、剪刀、解剖针、手术刀等工具，每次使用前接触植物材料

的部分应灼烧消毒或插入高温灭菌器中灭菌,冷却后使用。

5.4操作人员消毒

操作人员工作服、帽子、口罩、鞋子等，使用前进行消毒灭菌，并提前放进

缓冲区。操作前用肥皂清洗双手，并更换消过毒的工作服、工作鞋、工作帽、无

菌口罩，进入操作台前戴好乳胶手套，并使用75%的酒精进行充分的灭菌。

6甘薯健康种苗组培生产

6.1品种选择：

根据甘薯产业需求特点，选择市场需求大、种植面积广，适宜本区域气候特

点的高产、优质、抗逆、市场潜力高的甘薯新品种进行甘薯健康种苗生产，满足

产业生产需求。

6.2选株留种

在收获时，从大田中选择茎叶生长势优、单株结薯数多、薯形漂亮、无病虫

害侵染，且最具有本品种特点的单株，进行留种。

6.3优株种苗培育

将选好的优株种薯在合适的环境条件下进行种苗培育，待种薯出芽，且长至

4-6片叶时，剪取活力旺盛、再生能力强、无病虫害侵染的茎尖部位作为备用材

料。

6.4茎尖脱毒

6.4.1茎尖诱导培养基的制备

茎尖分生组织诱导培养基配方参见附录A，将制备好的茎尖培养基快速分装

于容器中，封口，在温度121℃，压力：0.11-0.15MPa，灭菌15-20分钟。并于无

菌储藏室内冷却储藏，放置3d~5d，无污染的培养基放入超净工作台备用。

6.4.2茎尖清洗消毒

利用优株培育出的种苗，剪取芽前段约3cm顶芽，去除叶片，洗洁精等洗涤

剂浸泡5分钟，自来水冲洗5分钟，然后加吐温80浸泡5分钟，再用自来水冲

洗5分钟，去除材料表面的污物。

将清洗好的甘薯茎尖装入组培瓶，70-75%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3遍，

0.1%的氯化汞溶液浸泡5-8分钟，期间不停摇晃，倒出氯化汞溶液，无菌水冲洗

3-5遍，均匀摇晃，去除残留的氯化汞。灭菌完成后，将茎尖组织夹取放置到经

过灭菌有滤纸的培养皿内待用。

6.4.3茎尖剥离及接种

在超净工作台内，将6.4.2处理的茎尖置于40倍镜显微镜下，用镊子和解剖

针对包住茎尖分生组织的叶原基进行剥离，显微镜下解剖针剥取带1-2个叶原基

的茎尖分生组织，将其迅速接种于茎尖诱导培养基中，密封并做好记录。

6.4.4茎尖培养

将接种好的茎尖分生组织，置于无菌培养室内进行培养，培养温度：28±2℃，

培养光照是12-16小时，光照强度是：2000-3000lx。3-7天内观察茎尖生长情况，

将污染及褐变材料剔除。20-40天后，分生组织长成带叶片的幼苗，将成功分化

长成幼苗的株系接种到继代培养基中进行培养。

7病毒病检测

待每个株系茎尖脱毒种苗扩繁至20株左右，开展病毒检测，检测方法参照

NY/T402规定执行，每个株系留存检测样本，并做好记录。

8田间鉴定

将7获得的无病毒株系，每个株系3-5株进行田间种植，观察植株品种特性

是否发生变异，淘汰变异株系，保留符合原品种典型性状且长势旺盛株系进行组

培扩繁。

9甘薯健康种苗组培扩繁

9.1组培扩繁培养基的制备

组培扩繁培养基配方参见附录B，将制备好的组培扩繁培养基，利用灌装机

分装于组培瓶内，封口，在温度121℃，压力：0.11-0.15MPa，灭菌15-20分钟。

并于无菌储藏室内冷却储藏，放置3d~5d，无污染的培养基放入超净工作台备用。

9.2组培扩繁

选择经过田间鉴定的株系，置于超净工作台内，从组培瓶中取出继代培养的

茎尖脱毒种苗，根系、叶子等修剪干净后，将茎段剪切成1-2个节位一段的小茎

段，扦插于组培扩繁培养基内，每瓶接种4-5株，培养条件同6.4.4，待植株生长

至6-8片叶时，进行下一轮扩繁，一般扩繁代数不超过8代，每代培养周期4-8

周。组培工厂可根据不同季节、不同产能需求开展甘薯健康种苗扩繁生产。

9.3病毒检测及出苗

待植株长至3-5cm高时，即可装车出苗，出苗前随机选取不同株系瓶苗进行

病毒检测，检测方法参照NY/T402和NY/T1200规定执行，每个株系留存检测

样本，并做好记录。

附录A

茎尖诱导培养基配方

编号分类试剂名称母液倍数母液含量

NH4NO3硝酸铵1650mg/L82.5g/L

KNO3硝酸钾1900mg/L95g/L

A1

CaCl2·2H

大量氯化钙440mg/L22g/L

2O50

元素MgSO4·7H

七水硫酸镁370mg/L18.5g/L

A22O

KH2PO4磷酸二氢钾170mg/L8.5g/L

H3BO3硼酸6.2mg/L0.62g/L

MnSO4·H2

一水硫酸锰16.9mg/L1.69g/L

O

ZnSO4·7H

硫酸锌8.6mg/L0.86g/L

2O

微量KI碘化钾0.83mg/L0.083g/L

B1100

元素NaMoO4·2

钼酸钠0.25mg/L0.025g/L

H2O

CuSO4·5H

五水硫酸铜0.025mg/L0.0025g/L

2O

CoCl2·6H

六水氯化钴0.025mg/L0.0025g/L

2O

FeSO4·7H

硫酸亚铁27.85mg/L1.3925g/L

2O

C1铁盐50

Na2EDTA·乙二胺四乙酸

37.3mg/L1.865g/L

2H2O二钠

肌醇100mg/L10g/L

烟酸VB30.5mg/L0.05g/L

盐酸吡哆

有机0.5mg/L0.05g/L

D1辛VB6100

物

盐酸硫胺

0.4mg/L0.04g/L

素VB1

甘氨酸2mg/L0.2g/L

其他激素6-BA1-4mg/L1g/L

NAA1-2mg/L1g/L

支撑

琼脂7g/L

物

碳源蔗糖20g/L

注1:铁盐母液的配制，2种试剂分别称量并分别加热溶解，待2种试剂均溶解后混合，

混合后的溶液继续加热使其充分螯合，冷却后定容备用。

注2:本配方pH为5.6～5.8。

注3：需要将各类试剂和激素等按一定的倍数配置成母液备用。试剂可按编号内进行配

置，可大概率避免试剂间的反应而发生沉淀。

附录B

继代扩繁培养基配方

编分

试剂名称母液倍数母液含量

号类

NH4NO3硝酸铵1650mg/L82.5g/L

大

A1KNO3硝酸钾1900mg/L95g/L

量

CaCl2·2H2O氯化钙440mg/L5022g/L

元

MgSO4·7H2O七水硫酸镁370mg/L18.5g/L

A2素

KH2PO4磷酸二氢钾170mg/L8.5g/L

H3BO3硼酸6.2mg/L0.62g/L

MnSO4·H2O一水硫酸锰16.9mg/L1.69g/L

微

ZnSO4·7H2O硫酸锌8.6mg/L0.86g/L

量

B1KI碘化钾0.83mg/L1000.083g/L

元

NaMoO4·2H2O钼酸钠0.25mg/L0.025g/L

素

CuSO4·5H2O五水硫酸铜0.025mg/L0.0025g/L

CoCl2·6H2O六水氯化钴0.025mg/L0.0025g/L

FeSO4·7H2O硫酸亚铁27.85mg/L1.3925g/L

铁

C1乙二胺四乙50

盐Na2EDTA·2H2O37.3mg/L1.865g/L

酸二钠

肌醇100mg/L10g/L

烟酸VB30.5mg/L0.05g/L

有盐酸吡哆辛