CN115152352A 一种工业大麻无菌实生苗繁育方法 （黑龙江省农业科学院大庆分院）

街84号芮海英李泽宇郭丽王迪李冬梅刘冰A01G31/00(2018.01)代理有限公司232130.2%的次氯酸钠的三角瓶中进行灭菌处理，培21.一种工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：工业大麻无菌实生苗繁育方法按照以下步骤进行：挑选成熟、完整饱满、无病虫侵害、有光泽的工业大麻种子，种子净度达到100%,纯度达到100%,发芽率达到99%以上；用清水浸泡直至种子顶破种皮露出白色胚根后剥去外种皮和内种皮；将剥去外种皮和内种皮的工业大麻种子放入装有质量分数为0.2%的次氯酸钠的三角瓶中进行灭菌处理，灭菌时间总计30～35分钟；灭菌分3次处理，每隔10-12分钟更换1次新的次氯酸钠，灭菌处理过程中摇动三角瓶以达到灭菌彻底的效果；灭菌处理后用无菌水冲洗种子3-4遍，将发芽种子表面的次氯酸钠冲洗干净；将MS固体培养基灭菌后分装入培养皿中，待培养基凝固冷却后将灭菌完成的种子接种到皿中，培养皿用报纸包裹后，放于培养箱中进行培养，培养2-3天，得到无菌的发芽种子；将无菌的发芽种子转移到装有MS固体培养基的容器中继续培养10-15天，得到无菌实生苗；将无菌实生苗直接移栽，或将无菌实生苗扩繁生根后进行移栽。2.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤四所述培养条件为：温度我25℃,湿度为40-50%,光照强度为2000-2500Lux,16h光照/8h黑暗。3.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤五所述容器为组培瓶或试管。4.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤五所述培养条件为：温度为25℃,湿度为40-50%,光照强度为4000-5000Lux,16h光照/8h黑暗。5.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤六所述移栽方法为：选择株型完整、茎秆粗壮、根系完整的无菌实生苗移栽，出瓶时将培养基与无菌实生苗一起取出，洗净根部的培养基和琼脂，转移到装有基质的盆中，基质需要提前灭菌；所述基质由粗椰糠、细椰糠和泥炭组成；粗椰糠、细椰糠和泥炭的质量比为0.15:0.35:0.5;所述基质的灭菌方法为：在121℃的高压锅中湿热灭菌30-40分钟。6.根据权利要求1所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：步骤四和五中所述MS固体培养基中含有的营养元素包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物，每升培养基含有18-20g琼脂粉。7.根据权利要求6所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：所述大量元素为7H₂0、H₃BO₃、KI、Na₂Mn04·2H₂O、CuSO₄·5H₂0、CoCl₂·6H7H₂0;所述有机物为甘氨酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、烟酸和肌醇。8.根据权利要求7所述的工业大麻无菌实生苗繁育方法，其特征在于：所述培养基中大3所述培养基中微量元素的含量为：MnSO₄·4H₂0:0.023g/L,ZnSO4·7H₂0:0.0086g/L,H₃BO₃:0.0062g/L,KI:0.00083g/L,Na₂Mn04·2H₂0:0.00025g/L,CuSO₄·5H₂0:0.0所述培养基中铁盐的含量为：Na₂-EDTA:0.037g/L和FeSO₄·7H₂0:0.0278g/L;所述培养基中有机物的含量为：甘氨酸：0.0001g/L,盐酸吡哆醇：0.00025g/L,盐酸硫胺素：0.00005g/L,烟酸：0.00025g/L,肌醇：0.05g/L;所述铁盐的配置方法：将FeSO₄·7H20和Na₂-EDTA·2H₂0分别称好，分别放到馏水中，边加热边不断搅拌使溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5,加热至沸腾，当颜色变深黄色后，定容到1L,保存在棕色玻璃瓶中。4一种工业大麻无菌实生苗繁育方法技术领域[0001]本发明涉及一种工业大麻繁育方法。背景技术[0002]大麻(CannabissativaL.)是大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)1年生草本植物，分为工业大麻和毒品大麻，现在国内外广泛应用的大麻为工业大麻。工业大麻是指四氢大麻酚含量低于0.3%的大麻，我国将工业大麻称为汉麻(hemp)。大麻浑身是宝，主料等方面。[0003]我国工业大麻产业发展势头很猛，但由于大麻属雌雄异株，为典型的异花授粉作物，在大麻的繁种过程中，由于生物学混杂、机械混杂和不良环境条件引起的品种混杂退化现象十分普遍，品种间极易串粉杂交，核心种质资源的防杂保纯和雄性大麻植株繁殖十分困难。要解决工业大麻种质资源提纯保存，具有优良种质特性的后代材料快速纯化扩繁，就需要解决工业大麻无性繁殖技术问题，在大麻离体培养过程中，无菌实生苗和外植体的获得是关键，选择适宜的种子灭菌方法(消毒剂和处理时间),既有良好的除菌效果，大大降低了初始污染率，又获得了生长状态更好的实生苗。目前种子的灭菌方法集中在用75%酒精、高浓度的次氯酸钠或升汞三种消毒剂组合应用对种子进行直接灭菌，然后再浸泡剥去种皮或不浸泡不剥去种皮直接种植于培养基中，但由于大麻种皮厚并且内生菌很多，这些方法发明内容[0004]本发明为了解决现有的种子灭菌方法灭菌率低、对种子伤害大的问题，提出一种工业大麻无菌实生苗繁育方法。[0005]本发明工业大麻无菌实生苗繁育方法按照以下步骤进行：[0007]挑选成熟、完整饱满、无病虫侵害、有光泽的工业大麻种子，种子净度达到100%,纯度达到100%,发芽率达到99%以上；[0009]用清水浸泡直至种子顶破种皮露出白色胚根后剥去外种皮和内种皮；种子浸泡时间一般为24-48小时，根据环境温度适当调整；[0011]将剥去外种皮和内种皮的工业大麻种子放入装有质量分数为0.2%的次氯酸钠的三角瓶中进行灭菌处理，灭菌时间总计30～35分钟；灭菌分3次处理，每隔10-12分钟更换1次新的次氯酸钠，灭菌处理过程中摇动三角瓶以达到灭菌彻底的效果；灭菌处理后用无菌水冲洗种子3-4遍，将发芽种子表面的次氯酸钠冲洗干净；5[0013]将MS固体培养基灭菌后分装入培养皿中，待培养基凝固冷却后将灭菌完成的种子接种到皿中，培养皿用报纸包裹后，放于培养箱中进行培养，培养2-3[0015]将无菌的发芽种子转移到装有MS固体培养基的容器中继续培养，发芽种子播种密度和容器体积以不影响工业大麻植株生长为宜，培养10-15天，得到无菌实生苗；获得的无菌实生苗根系强壮，生长良好，不需驯化炼苗，可直接出瓶，用做组织培养中的无菌外植体来源，用于工业大麻组织培养、遗传转化以及工厂化育苗等。[0017]将无菌实生苗直接移栽，或将无菌实生苗扩繁生根后进行移栽。[0018]本发明原理及有益效果为：[0019]本发明种子先浸泡种子至胚根顶破种皮后去除外种皮和内种皮，只将完全展开、裸露的子叶以及胚轴、胚根进行灭菌，低浓度的次氯酸钠对种子发芽基本无伤害，种子发芽率100%,长势好，灭菌率达到90-100%。[0020]种子常用的灭菌剂主要为酒精、次氯酸钠和升汞。酒精和次氯酸钠的杀菌效果差不多，只是用途不一样。次氯酸钠主要用于物体表面和环境等灭菌，其水解的次氯酸能将有还原性的物质氧化，使微生物最终丧失机能，无法繁殖或感染；医用酒精的主要成分是乙醇并且是混合物，酒精主要是让蛋白质变性来达到灭菌的效果。升汞又称氯化汞，具有杀菌力强，渗透性好的特点，但对人畜皆有剧毒。能达到灭菌的效果的酒精浓度通常是70-80%,常用的是75%,酒精浓度过高，用其灭菌对大麻种子发芽率影响很大，特别是去除种皮和内种皮后的大麻种子，应用其进行灭菌后，会造成不可逆的伤害；升汞毒性大并具有腐蚀性，不能接触金属物，操作过程应严格防护，对操作人员要求极高，且其在种子灭菌过程中对种子的伤害也不可避免，更不能直接用于去除种皮的工业大麻种子；本发明只采用了0.2%的次氯酸钠进行灭菌，对种子几乎不会造成任何伤害。附图说明[0021]图1为实施例1中清水浸泡后的种子；成熟种子浸泡后胚根顶破种皮；[0022]图2为实施例1中剥去外种皮和内种皮后的发芽种子；[0023]图3为实施例1中外种皮和内种皮后的种子在几种灭菌处理后的发芽情况；[0024]图4为实施例1中挑选的0.2%次氯酸钠处理后无菌的发芽种子；[0025]图5为实施例1中获得的无菌实生苗。具体实施方式[0026]本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意合理组合。[0027]具体实施方式一：本实施方式工业大麻无菌实生苗繁育方法按照以下步骤进行：[0029]挑选成熟、完整饱满、无病虫侵害、有光泽的工业大麻种子，种子净度达到100%,纯度达到100%,发芽率达到99%以上；6[0031]用清水浸泡直至种子顶破种皮露出白色胚根后剥去外种皮和内种皮；种子浸泡时间一般为24-48小时，根据环境温度适当调整；[0033]将剥去外种皮和内种皮的工业大麻种子放入装有质量分数为0.2%的次氯酸钠的三角瓶中进行灭菌处理，灭菌时间总计30～35分钟；灭菌分3次处理，每隔10-12分钟更换1次新的次氯酸钠，灭菌处理过程中摇动三角瓶以达到灭菌彻底的效果；灭菌处理后用无菌水冲洗种子3-4遍，将发芽种子表面的次氯酸钠冲洗干净；[0035]将MS固体培养基灭菌后分装入培养皿中，待培养基凝固冷却后将灭菌完成的种子接种到皿中，培养皿用报纸包裹后，放于培养箱中进行培养，培养2-3[0037]将无菌的发芽种子转移到装有MS固体培养基的容器中继续培养，发芽种子播种密度和容器体积以不影响工业大麻植株生长为宜，培养10-15天，得到无菌实生苗；获得的无菌实生苗根系强壮，生长良好，不需驯化炼苗，可直接出瓶，用做组织培养中的无菌外植体来源，用于工业大麻组织培养、遗传转化以及工厂化育苗等。[0039]将无菌实生苗直接移栽，或将无菌实生苗扩繁生根后进行移栽。[0040]本实施方式种子先浸泡种子至胚根顶破种皮后去除外种皮和内种皮，只将完全展开、裸露的子叶以及胚轴、胚根进行灭菌，低浓度的次氯酸钠对种子发芽基本无伤害，种子发芽率100%,长势好，灭菌率达到90-100%。[0041]具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四所述培养条件为：温度我25℃,湿度为40-50%,光照强度为2000-2500Lux,16h光照/8h黑暗。[0042]具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤五所述容器[0043]具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤五所述培养条件为：温度为25℃,湿度为40-50%,光照强度为4000-5000Lux,16h光照/8h黑暗。[0044]具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤六所述移栽方法为：选择株型完整、茎秆粗壮、根系完整的无菌实生苗移栽，出瓶时将培养基与无菌实生苗一起取出，洗净根部的培养基和琼脂，转移到装有基质的盆中，基质需要提前灭菌；所述基质由粗椰糠、细椰糠和泥炭组成；粗椰糠、细椰糠和泥炭的质量比为0.15:0.35:0.5;所述基质的灭菌方法为：在121℃的高压锅中湿热灭菌30-40分钟。[0045]具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四和五中所述MS固体培养基中含有的营养元素包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物，每基含有18-20g琼脂粉。[0046]具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同的是：所述大量元素为KNO₃、7[0047]具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七不同的是：所述培养基中大量元L,H₃BO₃:0.0062g/L,KI:0.00083g/L,Na₂Mn04·2H₂0:0.00025g/L,CuSO₄·5H₂0:[0049]所述培养基中铁盐的含量为：Na₂-EDTA:0.037g/L和FeSO₄·7H[0050]所述培养基中有机物的含量为：甘氨酸：0.0001g/L,盐酸吡哆醇：0.00025g/L,盐[0051]所述铁盐的配置方法：将FeSO₄·7H20和Na₂-EDTA·2H₂0分别称好，分别放到馏水中，边加热边不断搅拌使溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5,加热至沸腾，当颜色变深黄色后，定容到1L,保存在棕色玻璃瓶中。[0052]实施例1:[0053]本实施例工业大麻无菌实生苗繁育方法按照以下步骤进行：[0055]挑选成熟、完整饱满、无病虫侵害、有光泽的工业大麻种子，种子净度达到100%,纯度达到100%,发芽率达到99%以上；[0057]用清水浸泡直至种子顶破种皮露出白色胚根后剥去外种皮和内种皮；[0058]所述种子浸泡时间为36小时，根据环境温度适当调整；[0060]将剥去外种皮和内种皮的工业大麻种子放入装有质量分数为0.2%的次氯酸钠的100ml三角瓶中进行灭菌处理，灭菌时间总计30分钟；灭菌分3次处理，每隔10分钟更换1次新的次氯酸钠，灭菌处理过程中摇动三角瓶以达到灭菌彻底的效果；灭菌处理后用无菌水冲洗种子4遍，将发芽种子表面的次氯酸钠冲洗干净；[0062]将MS固体培养基灭菌后分装入培养皿中，待培养基凝固冷却后将灭菌完成的种子接种到皿中，培养皿用报纸包裹后，放于培养箱中进行培养，培养3天，得到无菌的发芽种[0063]步骤四所述培养条件为：温度我25℃,湿度为45%,光照强度为2500Lux,16h光照/[0065]将无菌的发芽种子转移到装有MS固体培养基的容器中继续培养，发芽种子播种密度和容器体积以不影响工业大麻植株生长为宜，培养15天，得到无菌实生苗；获得的无菌实用于工业大麻组织培养、遗传转化以及工厂化育苗等。[0066]步骤五所述容器为组培瓶；[0067]步骤五所述培养条件为：温度为25℃,湿度为45%,光照强度为4500Lux,16h光照/8[0069]将无菌实生苗直接移栽，或将无菌实生苗扩繁生根后进行移栽；[0070]步骤六所述移栽方法为：选择株型完整、茎秆粗壮、根系完整的无菌实生苗移栽，出瓶时将培养基与无菌实生苗一起取出，洗净根部的培养基和琼脂，转移到装有基质的盆[0071]所述基质由粗椰糠、细椰糠和泥炭组成；粗椰糠、细椰糠和泥炭的质量比为0.15:[0072]所述基质的灭菌方法为：在121℃的高压锅中湿热灭菌40分钟；[0073]移栽后管理：移植好的盆栽苗需要进行覆膜处理，先放于培养箱中，培养条件为：温度为24-25℃,湿度为65-70%,光照强度为4000-5000Lux、16h光照/8h黑暗条件下培养7天左右将覆盖的膜揭开，继续培养7天左右，有新叶长出，可转移到室内进行培养，然后按照常规方法管理即可。[0074]步骤四和五中所述培养基中含有的营养元素包括大量元素、微量元素、铁盐和有[0076]所述培养基中大量元素的含量为：KNO₃:1.9g/L,NH₄NO₃:1.65g/L,MgSO₄·7H₂0:0.37g/L,KH₂PO₄:0.17/L,CaCl₂·[0077]所述微量元素为MnSO₄·4H₂0、ZnSO4·7H₂0、H₃BO₃、KI、Na₂Mn04·2H₂0、CuSO₄·[0078]所述培养基中微量元素的含量为：MnSO₄·4H₂0:0.023g/L,ZnSO4·7H₂0:0.0086g/L,H₃BO₃:0.0062g/L,KI:0.00083g/L,Na₂Mn04·2H₂0:0.00025g/L,CuSO₄·5H₂0:[0080]所述培养基中铁盐的含量为：Na₂-EDTA:0.037g/L和FeSO₄·7H₂0:0.0278g/L;[0082]所述培养基中有机物的含量为：甘氨酸：0.0001g/L,盐酸吡哆醇：0.00025g/L,盐[0083]所述铁盐的配置方法：将FeSO₄·7H20和Na₂-EDTA·2H₂0分别称好，分别放到馏水中，边加热边不断搅拌使溶解