生物药物方法开发中色谱柱的选择 sjx

生物制品方法开发中色谱柱的选择----蛋白分析Theworldleaderinservingscience内容概要Ø生物制品的概念Ø生物制品的分类Ø生物制品与小分子药物的区别ØThermo在蛋白药物中的解决方案2生物制品的概念•生物制品是以微生物,细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术（如萃取，沉淀等传统方法）或现代生物技术制成，用于人类疾病的预防、治疗和诊断的产品。•生物制品主要有：各类菌苗、各类疫苗、类毒素、抗毒素、各类干扰素、酶制品、免疫调节剂、血液制品、转移因子、淋巴因子，单克隆抗体以及单克隆抗体与毒素相结合的各种“生物导弹”ADC药物，融合蛋白，双抗等。3生物制品的分类•按照生理功能和用途可分为治疗药物（治疗肿瘤，心脑血管疾病等），诊断药物（灵敏度高，特异性强的用于免疫诊断，酶诊断，放射性诊断和基因诊断的药物和预防药物（菌苗，疫苗和类毒素）。•按来源可分为天然生物材料（如人体，动植物，各种微生物和海洋生物等）基因工程技术得到的微生物或细胞。•按结构可分为氨基酸及其衍生物，多肽和蛋白类药物，酶和辅酶类药物，核酸及其降解物和衍生物类药物，糖类药物，脂类药物，细胞生长因子等。4生物制品与小分子药物的区别小分子药物生物制品•一般分子量小一般分子量大•通常是有机合成或者化学合成是从活体细胞或者组织中获得的（存在内在污染的风险）•比较少的关键质量工艺步骤•研究得很透彻很多关键质量工艺步骤不太容易研究透彻•结构已知不能或者不能完全定义结构不均一性混合物（可能包括变异体）常常有免疫原性•均一性药物•通常没有免疫原性5ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案蛋白的尺寸和复杂性6ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案蛋白的不均一性•氨基酸取代•氨基甲酰化•N或者C段修饰•二硫键的错配，•折叠方式，•截短•聚体•多聚体降解•变性•羧基化•甲酰化•γ谷氨酸羧化•O末端糖基化•N末端糖基化•甲基化•磷酸化•硫化•乙酰化•脂肪酸酰化•脱酰胺作用•氧化•PEG化7ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案蛋白结构评价工具•氨基酸序列和修饰：质谱，肽图，色谱分离•折叠：二硫键，热力学，氢氘交换质谱和离子迁移质谱，核磁共振技术，圆二色谱，傅立叶变换红外光谱，荧光光谱•亚基相互作用：色谱法，离子迁移质谱•尺寸不均一性：聚体和电荷异构体•疏水性：色谱法，毛细管电泳，光散射，离子迁移质谱，超速离心，尺寸排阻色谱，场流分级分流，光散射，显微镜•糖基化：阴离子交换，酶解，肽图，毛细管电泳，质谱8ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案ColumnsOrbitrapFusionQExactiveHFExactivePlusEMRTSQtriplequadseriesPepFinder1.0ProteinDeconvolution3.0ProSightPCSimGlycanIntactProteinNativeMSTop-down/middle-downBottom-upHDXGlycanMSIASamplePreparationKitsReagentsenzymesPinPointStandardsBioanalysis9ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案ThermoFisher液相色谱产品线BioColumnsMAbPacICColumnsIonPacASIonPacCSCarboPacAminoPacIonSwiftLCColumnsAccucoreAcclaimProPacHypersilGOLDSyncronisDNAPacGlycanPacProSwiftHyperCarbHypersilDNASwift10ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案蛋白药物色谱方法一级结构的确认电荷异构体疏水性特异性位点聚体和片段SEC/RP/HICRPHILICIEC/RPHIC/RPAFC11ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案蛋白药物分析中可以使用的色谱柱GlycanPacFamilyMAbPacFamily•AXH-1•ProteinA•AXR-1•SEC-1Acclaim•SCX-10/pHgradient•AccliaimPepMapFamilyNanocolumns•HIC-10,HIC-20,HIC-Butyl•MAbPacRPProPacFamily•WCX-10EASY-Spray•AcclaimSEC-300•AcclaimSEC-1000•WAX-10BiobasicFamily•SAX-10•BiobasicSEC-60/120/300/1000•BiobasicC4/C8/C18•BiobasicSCX•SCX-10•HIC-10ProSwiftFamily•RP-1S•RP-4H12ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案MAbPacFamily•ProteinA(亲和色谱分离模式）•SEC-1（尺寸排阻分离模式）•SCX-10/pHgradient（离子交换分离模式）•HIC-10,HIC-20,HIC-Butyl（疏水相互作用模式）•MAbPacRP（反相分离模式）13ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilyProteinA(亲和色谱分离模式）•分离原理：中性pH条件下抗体结合在柱子上，其他杂蛋白流穿，酸性条下抗体洗脱出来。•柱子特色：1.2分钟内有效分离目标抗体与杂质，最快可以在1分钟内完成一个分析。2.有着极高的灵敏度可以检测到0.025mg/mL的浓度，实际上样量0.5ug）。3.寿命长，连续进样2000针，峰形良好•柱子特性参数：IgG动态载量/柱子ParticleFlowrate(ml/min)PressureTemperatur(µg)*(atColumnMAbPacProteinASize(µm)Limit(psi)e(C)pHRange1.9-7.52mL/min)122.510003010014ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案MAbPacFamilyProteinA(亲和色谱分离模式）分析细胞发酵液谱图UnboundColumn:Flowrate:EluentA:EluentB:Gradient:MAbPacProteinA,4×35mm5,2002mL/min50mMSodiumPhosphate,150mMNaCl,5%acetonitrile,pH7.550mMSodiumPhosphate,150mMNaCl,5%acetonitrile,pH2.50%Bfor0.2mins,100%Bfor0.60mins,0%Bfor1.20mins4,0003,0002,0001,000Temperature:25ºCDetection:280nmInj.volume:10µLSample:Harvestcellculture(HCC)mAu0.025mg/mL-5mg/mLIgG-2000.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.0Minutes15ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案MAbPacFamilyProteinA(亲和色谱分离模式）•进样2000针以上的对比谱图Column:MAbPacProteinA,4×35mmFlowrate:2mL/minEluentA:7.550mMSodiumPhosphate,150mMNaCl,5%acetonitrile,pH1,4001,2001,000800EluentB:2.550mMSodiumPhosphate,150mMNaCl,5%acetonitrile,pHGradient:Temperature:Detection:Inj.volume:Sample:0%Bfor0.2mins,100%Bfor0.60mins,0%Bfor1.20mins25ºC280nm20µLRabbitIgG,1mg/mL#2011#1811mAu600400200#1611#1411#1211#1011#811#611#411#211#30-500.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.50Minutes16ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案MAbPacFamilyProteinA(亲和色谱分离模式）•常见问题1.这根柱子的目标应用？•抗体滴度分析•捕集后的2D分析2.该亲和柱的最大流速是多少?•最高2.5mL/min.3.该亲和柱能耐受最高乙腈比例是多少?•最高是20%.为了延长柱子的寿命，乙腈的浓度请保持恒定。4.我能使用这款柱子进行IgG的纯化?•可以的，最大可以到100µgIgG.如果纯化的IgG，第二维用于IEC分析，流动相中应该降低盐的浓度，否则纯化好的IgG可能不能结合在IEC色谱柱上。17ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案MAbPacFamilyProteinA(亲和色谱分离模式）•清洗方法1.溶剂清洗方法准备pH在3或者以下的缓冲液以1mL/min的流速冲洗柱子这根柱子30分钟，然后使用上样缓冲液平衡30分钟2.盐清洗调整B相盐的浓度为1mol/L,以1mL/min的流速冲洗40-60分钟，然后使用上样缓冲液平衡30分钟3.有机溶剂清洗添加10%乙腈到流动相A中，以1mL/min的流速冲洗40-60分钟，然后使用上样缓冲液平衡30分钟18ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySEC-1(尺寸排阻色谱分离模式）•分离原理：样品空间尺寸大小差异进行分离。•柱子特色：1键和了亲水性专利表面，能最大程度的减少了色谱柱与样品之间的非尺寸排阻作用.2.稳定的表面键合技术，低的柱流失效应可以跟MS,ELSD以及CAD检测器兼容。3.稳定可靠的高端装填技术4.分析单克隆抗体，聚体和片段有着超优的性能•柱子特性参数：键合官能团硅胶基质粒径二醇基球形，高纯，多孔硅胶5µm孔径300Å色谱柱材质PEEK（4.0mm内径柱子）SST（7.8mm和2.1mm内径柱子）球蛋白分离范围球蛋白排阻极限10,000-1,000,000>1,000,00019ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySEC-1(尺寸排阻色谱分离模式）•色谱柱规格规格目标应用应用目的7.8×300mm单抗与聚体实现最高分辨率的分析精确定量单抗聚体的含量，用于QC的批次放行。4.0×300mm4.0×150mm单抗与聚体实现分辨率的分析用于SEC-MS分析4.0×300mm柱子跟7.8×300mm柱子对比，只需要1/4的样品量能够实现单抗单体与聚体基线分离。2.1×300mm2.1×150mm低流速和低样品量可以完美的跟MS联用。20ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySEC-1(尺寸排阻色谱分离模式）分离单抗的例子mAbmonomer(a)Column:MAbPacSEC-1,5µm,a.7.8×300mmb.4.0×300mma.2.1×300mm50.040.030.020.010.00.0Dimension:AggregatesMobilephase:50mMSodiumPhosphatepH6.8,in300mMNaCl30ºC0.02.55.07.510.012.515.018.0Temp.lowrate:a.760µL/minb.200µL/minc.50µL/min(b)Inj.volume:a.10µLb.5µL5025a.1µL0Detection:280nm0.02.55.07.510.012.515.018.0Sample:mAb(1mg/mL)70.060.0(c)50.040.030.020.010.00.00.02.55.07.510.012.515.018.0RetentionTime(min)21ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamily离子强度的影响:MAbPacSEC-1eColumn:Format:Mobilephase:MAbPacSEC-1,5µm7.8×300mm50mMsodiumphosphate,pH6.8and1.300mMNaCl2.200mMNaCl3.100mMNaCl4.50mMNaCl5.25mMNaCl6.0mMNaClIsocratic30ºC0.76mL/min20µLUV(280nm)SECstandard25022520017515012510075dcab6.Rs=1.645.Rs=1.724.Rs=1.803.Rs=1.902.Rs=2.031.Rs*=2.02Gradient:Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:a.Thyroglobulin(bovine):0.1mg/mLb.γ-globulin(bovine):0.1mg/mLc.Ovalbumin(chicken):0.1mg/mLd.Myoglobin(horse):0.05mg/mLe.VitaminB12:0.01mg/mL50250MAbPacSEC-1column上，样品与柱子之间存在非常低的离子性吸附，流动相盐浓度对分离不敏感。-25-502.04.06.08.010.012.014.016.018.0RetentionTime(min)*Rs是γ-球蛋白和卵清蛋白的分离度。22ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamily非变性条件下SEC-MS分析SEC-1非变性条件下分析单抗单体与聚体Column:MAbPacSEC-1,5µm,2.1×150mm(a)Dimension:单体Mobilephase:20mMammoniumformateTemp.:30ºCFlowrate:50µL/min聚体Inj.volume:1µLDetection:Samples:ExactivePlusEMRmAb(1mg/mL)+38+39(b)+40+37+26+25(c)+27+24+2823ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySEC-1快速聚体分析mAbmonomerColumn:MAbPacSEC-1,5µm,a.4.0×300mm140Dimension:(a)4.0×300mmb.4.0×150mmMobilephase:50mMSodiumPhosphatepH6.8,in300mMNaCl10075Temp.:30ºCFlowrate:200µL/min50AggregatesInj.volume:2µLDetection:Sample:280nmmAb(5mg/mL)25(b)4.0×150mm300200100150mmMAbPacSEC-1柱子缩短了分析时间。-500.02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.022.025.0RetentionTime(min)24ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamily单抗片段结构(a)(b)(c)25ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySEC-1分析单抗以及片段1mAb70.0Column:MAbPacSEC-1,5µm7.8×300mmFormat:Mobilephase:50mMsodiumphosphate,300mMNaCl,pH6.8-10.070.0F(ab)2234Gradient:IsocraticTemperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:30ºCscFcFab0.76mL/min10µLUV(280nm)1.Rituximab(5mg/mL),inject2µL2.Rituximab+IdeS(2mg/mL)3.Rituximab+Papain(2mg/mL)4.Rituximab+DTT(2mg/mL)Fc-10.0140DTTmAb的片断F(ab)2和scFc,Fc，Fab,HCandLC都得到了分离。HC+LCHCLC-200.05.010.015.020.0RetentionTime(min)26ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamily变性条件下SEC-MS分析SEC-1变性条件下分析单抗重链与轻链(a)FullMSoflightchain(LC)FullMSofheavychain(HC)(d)+9(b)+20+10+8+18+16+11+12+13+14+7(c)(e)G0G0+LysG1G1+LysG227ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySEC-1色谱条件ColumnID(mm)Flowrate(µL/min)UVflowcell2.150-754.07.8200-300760-1,000Micro(180nL)Semi-microAnalytical(11µL)(2.5µL)TubingID(µm)50-7511005150-25020SampleLoopSize(PullLoopWPS(µL))28ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySEC-1常见问题如果分离度比较差，请确认以下事宜•系统设置:连接管路，流速，检测池体积和进样方法•使用混合蛋白标准品控制系统。Bio-radGelFiltrationStandard#151-1901•如果压力比较高，请确认系统没有堵。29ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySEC-1(尺寸排阻色谱分离模式）清洗方法1.100%纯水以200μL/min流速冲洗30分钟。2.80%甲醇水以200μL/min流速冲洗30分钟。.3.0.1M乙酸铵（pH5.0）缓冲液以200μL/min流速冲洗30分钟。4.使用流动相以200μL/min流速冲洗至少30分钟。5.如果上述操作没有效果，可以在流动相中添加0.05%SDS冲洗柱子，使用此步骤操作后，该柱子要专柱专用6.如果色谱柱压力很高，可以以200ul/min的流速采用反冲的方法进行清洗。清洗时，请设置限压保护。30ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySCX-10(强阳离子交换色谱）•分离原理：样品电荷差异进行分离。•柱子特色：1键和了亲水性专利表面，能最大程度的减少了色谱柱与样品之间的疏水相互作用.2.特定的键和了磺酸基官能团，保证了键和密度和键和链的长度。3.稳定可靠的高端装填技术4.配合CX-1pHbuffer缓冲液，分析蛋白样品有着超优的性能•柱子特性参数：键合官能团基质磺酸基聚苯乙烯-二乙烯基苯3um,5µm,10um无孔粒径孔径色谱柱材质PEEK（3um5um10um）SST（5umRS色谱柱）31ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySCX-10(强阳离子交换色谱）分离原理：根据样品电荷差异进行分离柱子规格参数：色谱柱规格推荐流速最大压降10µm,4x250mm10µm,4x150mm10µm,2x250mm0.5to1.0mL/min0.5to1.0mL/min0.1to0.3mL/min3,000psi3000Psi3,000psi1.0to1.3mL/min(UHPLCRS,5µm,4.6x250mmRS,5µm,4.6x150mm7,000psi7,000psiinstrumentationrequired)1.0to2.0mL/min(UHPLCinstrumentationrequired)Upto2.0mL/minRS,5µm,4.6x50mmRS,5µm,2.1x250mm7,000psi7,000psiUpto0.32mL/min(UHPLCinstrumentationrequired)Upto0.42mL/min(UHPLCRS,5µm,2.1x150mmRS,5µm,2.1x50mm7,000psi7,000psiinstrumentationrequired)Upto0.42mL/min5µm,4x250mm(PEEK)5µm,4x150mm(PEEK)5µm,4x50mm(PEEK)3μm,4x50mm(PEEK)0.5-0.7mL/min0.5-1.0mL/minUpto2mL/min0.5to0.8mL/min5,000psi5,000psi5,000psi5,000psi32ThermoScientificCX-1pHGradientBuffersBufferABufferBpH值形态5.6液态10X10.2液态10X浓缩倍数•10倍纯水稀释就可以了•100%缓冲液A到100%缓冲液B可以得到一个从5.6到10.2线性的pH范围.运输条件储存条件室温室温•通用，快速和高分辨率分析。4~8C4~8CpH梯度缓冲液是电荷变异体的分析平台33蛋白和单抗在IEC色谱柱上的分离盐梯度pH梯度•最广泛使用的方法•能根据pI值进行样品的洗脱•配制缓冲液相对比较简单•收集到的组分中低的盐浓度•很多情况下可以提高分辨率•形成线性pH梯度比较困难•花费更长的时间进行条件优化（如pH,盐浓度）34ZwitterionicBufferCocktail的线性pH梯度35蛋白标准品在线性CX-1pH梯度缓冲液下洗脱图MAbPacSCX-10Column,4×250mmPeaklabel:proteinname–elutionpH9011109Lectin-1-6.11pHtrace6040208CytochromeC-10.15Lectin-2-6.28RibonucleaseA-8.727Lectin-3-6.45Trypsinogen-7.7560-105400510152025303536蛋白标准品在Phosphate-basedpH梯度下洗脱图MAbPacSCX-10Column,4×250mmpH7010.09.59.08.58.07.57.06.56.05.5605040pHtrace30.20100-10051015202530354037为什么要使用pH梯度缓冲液?•盐梯度洗脱用于离子交换色谱15.010.05.0因为电荷的差异需要改变盐的浓度30.0Saltgradient•pH梯度缓冲液特性0.0%B:10.00.0min5.010.015.020.025.030.0•快速，稳定和重现性好15.010.05.0•和现有的阳离子交换柱和液相系统搭配使用50.0•操作简单，容易实现自动化•可以应用在大部分抗体上pHgradient25.00.0%B:25.00.0min5.010.015.020.025.030.038线性pH梯度缓冲液兼容性：WCX和SCX•pH梯度缓冲液可以同时用于弱阳离子交换柱(ProPacWCX-10)和强阳离子交换柱(MAbPacSCX-10)•在弱阳离子交换柱上，pH梯度缓冲液会有一些延迟。39ProPacWCX-10和MAbPacSCX-10分析标准蛋白对比谱图25010.508.00ProPacWCX-10,4×250mm100-505.0040.00.05.010.015.020.025.030.035.035010.50MAbPacSCX-10,4×250mm2508.00125-505.0040.00.05.010.015.020.025.030.035.0RetentionTime(min)40线性pH梯度缓冲液的优势:通用方法•pH值从5.6-10.2是一种通用的电荷变异体分析方法•该pH梯度缓冲液可以应用于大多数等电点在6-10之间的蛋白。•从线性曲线图上可以得到未知蛋白的等电点。41pH洗脱值与标准蛋白pI的线性曲线关系图42pH梯度条件下标准蛋白谱图60.050.040.030.020.010.0-5.00510152025303540RetentionTime[min]43线性pH梯度条件下不同等电点的标准单抗的对比谱图20018010.5010.009.509.008.508.007.507.006.506.005.505.00pHtrace160140120100806040200-200.05.010.015.020.025.030.035.040.0RetentionTime(min)44单抗洗脱pH值与等电点的线性曲线45pH梯度条件下分析热卖的单抗谱图PlatformmethodformAbchargevariantanalysis46线性pH梯度优势:优化方法简单•方法优化简单•通过一个缓的pＨ梯度可以得到更高的分辨率。(如.50-100%,而不是0-100%B)470–100%B梯度条件下分析单抗电荷变异体0%B100%B40.010.50(a)pHtrace30.020.010.09.008.007.006.005.00-5.00510152025303540RetentionTime[min]*ThepHtraceatelutionwasobtainedwiththeThermoScientific™Dionex™UltiMate™3000pHandConductivityMonitoringModule(PCM-3000)4825–50%B梯度条件下分析单抗电荷变异体25%B50%B16.08.007.757.507.257.00(c)pHtrace10.05.0-2.06.604005101520253035RetentionTime[min]49线性pH梯度的优势:快速分析•通过以下措施可以实现快速分析•更小的粒径(5µm而不是10µm)•更短的阳离子交换柱(4×50mm)20分钟内可以实现单抗电荷变异体的快速分析。50快速pH梯度条件下单抗电荷变异体的分析0%B100%B25010.50pHtrace200150100509.008.007.006.005.000-500.02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.0RetentionTime(min)5110分钟内的超快速pH梯度洗脱0%B100%B14011.0010.009.008.007.006.0012010080pHtrace60402010-205.0010.00.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0RetentionTime(min)52快速分析方法开发5mingradient10mingradient3步进行方法优化0.8mingradient1.0100%B10分钟线性梯度2.2040%B5分钟线性梯度3.1827%B0.8分钟线性梯度0.8分钟pH梯度条件下电荷变异体的数目和分辨率53盐梯度与pH梯度分离单抗对比谱图15.010.05.030.0Saltgradient0.0%B:10.0min0.05.010.015.020.025.030.015.010.05.050.025.0pHgradient0.0%B:25.00.0min5.010.015.020.025.030.030mingradient,ThermoScientific™MabPac™SCX-10,10µm,4×250mmcolumn54分析核糖核酸酶A的300次进样重现性6010.50pHtrace259.008.007.006.005.00Run#3000-25Run#200-50Run#100-75Run#5-1000.02.55.07.510.012.515.017.520.0RetentionTime[min]保留时间重现性<0.8%RSD55CX-1pHGradientBufferKit(10X):使用简单110Lot1(130523/130528)Lot2(130524/130529)Lot3(130531/130530)80604020-100.05.010.015.020.025.030.035.040.0RetentionTime(min)56离子交换色谱分析的一些建议•用于MAbPacSCX-10色谱柱的缓冲液要含有少量的电解质，禁止使用纯水清洗柱子。•尽量避免在流动相中使用有机溶剂，如果要使用，请保持有机溶剂含量稳定。•HPLC系统避免金属污染。•如果您想尝试pH梯度条件，请先使用MAbPacSCX-10,10µm,4×250mm•进标准蛋白(LentilLectin,RiboA,Trypsinogen,andCytC)来确认系统是正常的。如果可以同时检测pH值和电导率，那将会更好。•如果要快速分析，可以选择更短的柱子(如MAbPacSCX-10,10µm,4×150mm)或者更小粒径的柱子(如5µm).•如果您的样品挂不到柱子上或者不能洗脱出来，请确认蛋白的等电点和缓冲液的ｐＨ值。57ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilySCX-10(强阳离子交换色谱）•色谱柱的清洗1.对于轻度污染，使用1-2M高盐溶液在分析完成后进行清洗就可以了2.对于比较严重的污染，进样100-500uL或者更多进样体积的0.1-1MNaOH进行清洗（在进行此步操作时，请在缓冲液A体系下进行，完成进样NaOH后，进样缓冲液A500ul)3.如有必要，可以使用1M的盐酸以1ml/min的流速清洗5-30分钟，然后使用0.1MNaOH清洗柱子，不要超过20个柱体积，然后立即使用分析流动相A相平衡柱子。4.如果有保护柱，请将保护柱和分析柱分开独立清洗5.如果上述清洗方法无效，且有柱压上升的现象，可以将柱子反接在系统上清洗，但是不要超过该柱子能耐受的最大压力值。58ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilyHIC色谱柱•分离原理：样品的疏水性差异，采用高盐上样，低盐洗脱的温和方式进行分离。•柱子特色：1键和了三种不同的官能团，为蛋白的分离提供了不同的选择性.2.高分辨率和高柱效3.稳定可靠的高端装填技术4.与有机溶剂和水相兼容•柱子特性参数：MAbPacHIC-10MAbPacHIC-20MAbPacHIC-ButylChemistryProprietarypolyamideProprietaryalkylamideButylSubstrateParticleSizePoresize*CapacitySpherical,highpuritysilicaparticlesSpherical,highpuritysilicaparticlesHydrophilicpolymer5µm5µm5µm1,000Å28mg/mL1,000Å24mg/mLNon-porous9mg/mLpHRange2.0-8.0602.0-9.02.0-12.060TemperatureLimit(°C)60OrganicCompatibilityFlowRate0-100%0-100%0.5-1.0mL/min(recommended)1.5mL/min(max)0-50%MaximumPressure6,000psi(4.6×100mm)8,000psi(4.6×250mm)6,000psi(4.6×100mm)4,000psi(4.6×100mm)8,000psi(4.6×250mm)59ThermoScientific™HICColumnSelectionGuideResindataResinTypeSilicaParticleSize5µmPoreSize1000ÅMAbPacHIC-10MAbPacHIC-20MAbPacHIC-ButylProPacHIC-10Silica5µm1000ÅPolymerSilica5µmNonporous300Å5µmApplicationguideGeneralProteinsIntactmAbsmAbAggregatesmAbFragmentsOxidizedVariantsADCCys&LysMAbPacHIC-10MAbPacHIC-20ExcellentExcellentExcellentGoodGoodGoodExcellentOKGoodGoodGoodGoodOKGoodGoodOKExcellentGoodMAbPacHIC-ButylPoorExcellentPoorProPacHIC-10PoorGoodGood60SeparationofProteins80Column:Format:MAbPacHIC-10,5µm4.6×100mm4MobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.0603Gradient:Time(min)-5.00.01.015.0%A1001001000%B000100100214020.00Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:30ºC1.0mL/min10µLUV(280nm)Proteinmixture1)Myoglobin20Peaks:2)RibonucleaseA3)Lysozyme4)α-ChymotrypsinogenA0048121620RetentionTime(min)61SeparationofAggregatesonMAbPacHIC-10220MonomerColumn:MAbPacHIC-10,5µm200150100504.6×100mmFormat:MobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.0Gradient:Time(min)%A%B404040100100-5.00.01.029.034.060606000mAbvariantsTemperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:30ºC0.5mL/min10µL(4mg/mL)UV(280nm)MonoclonalantibodyAggregate0051015202530RetentionTime(min)62SeparationofmAbFragmentsonMAbPacHIC-2040aIntactmAbColumn:Format:MAbPacHIC-20,5µm4.6×100mmMobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.0Gradient:Time(min)-5.00.01.015.0%A6060600%B404040100100020.0060FabbPapaindigestTemperature:Flowrate:Inj.volume:30ºC1.0mL/minIntactmAb:Fc5µLPapaindigest:12µLUV(280nm)a)IntactmAb(2.5mg/mL)b)Papaindigest(1mg/mL)Detection:Sample:0048121620RetentionTime(min)63Comparison–SeparationofmAbFragments40MAbPacHIC-10Format:4.6×100mmMobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.00Gradient:Time(min)-5.00.01.015.0%A6060600%B40404010010055MAbPacHIC-2020.00Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:30ºC1.0mL/min12µLUV(280nm)Papaindigest(1mg/mL)040MAbPacHIC-Butyl0048121620RetentionTime(min)64FastAnalysisofmAbFragments140aIntactmAbColumn:Format:MAbPacHIC-20,5µm4.6×100mm100MobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.080Gradient:Time(min)-5.00.02.02.1%A4545450%B5555801001000%B:55%5.0050bTemperature:Flowrate:Inj.volume:30ºC1.0mL/minIntactmAb:Papaindigest10012µLPapaindigest:12µLUV(280nm)a)IntactmAb(1mg/mL)Detection:Sample:80b)Papaindigest(1mg/mL)0%B:55%012345RetentionTime(min)65OxidizedmAbsMethionineandTryptophansareusuallyoxidized.66SeparationofOxidizedmAbonMAbPacHIC-2060NativemAbColumn:Format:MAbPacHIC-20,5µm4.6×250mmMobilephaseA:2Mammoniumsulfate,100mMsodiumphosphate,pH7.0MobilephaseB:100mMsodiumphosphate,pH7.0Gradient:50403020Time(min)-6.00.02.030.0%A5050500%B505050100100Oxidizedvariants35.00Temperature:Flowrate:30ºC0.5mL/minInj.volume:UntreatedmAb:20µL(1.25mg/mL)OxidizedmAb:20µL(1.25mg/mL)UV(280nm)Detection:Sample:UntreatedmAb100H2O2oxidizedmAb101418222630RetentionTime(min)67Antibody-DrugConjugates(ADCs)68HeterogeneityofCys-LinkedADC69Antibody-DrugConjugates(ADCs)Conjugationofdrugmimicviainterchaincysteineresidues70SeparationofCys-LinkedADConMAbPacHIC-Butyl40DAR4Column:Format:MAbPacHIC-Butyl,5µm4.6×100mmMobilephaseA:1.5Mammoniumsulfate,50mMsodiumphosphate,pH7.0/isopropanol(95:5v/v)MobilephaseB:50mMsodiumphosphate,pH7.0/isopropanol(80:20v/v)3020100Gradient:Time(min)-5.00.01.015.0%A1001001000%B000100100DAR220.00Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:25ºC1.0mL/min5µL(5mg/mL)UV(280nm)Cys-conjugatedADCmimicDAR0DAR804812RetentionTime(min)162071SeparationofLys-LinkedADConMAbPacHIC-Butyl12DAR0Column:Format:MAbPacHIC-Butyl,5µm4.6×100mmMobilephaseA:1.5Mammoniumsulfate,50mMsodiumphosphate,pH7.0/isopropanol(95:5v/v)MobilephaseB:50mMsodiumphosphate,pH7.0/isopropanol(80:20v/v)Gradient:840Time(min)-5.00.01.029.0%A1001001000%B00010010029=512212=4,09634.00Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:35ºC0.5mL/min5µL(5mg/mL)UV(280nm)Lys-conjugatedADCmimic05101520253034RetentionTime(min)72mAbanalysisusingMAbPacHICcolumnsADConMAbPacHIC-ButylOxidizedmAbonMAbPacHIC-20AggregatesonMAbPacHIC-10mAbFragmentsonMAbPacHIC-205min73ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilyHIC色谱柱•色谱柱的清洗HIC-10和HIC-201.以0.2mL/min的流速使用0.05%乙酸溶液清洗30个柱体积。2.以0.2mL/min的流速使用异丙醇清洗30个柱体积。3.再以0.2mL/min的流速使用0.05%乙酸清洗10个柱体积4.如果没有解决问题，请将色谱柱反接在系统上重复上述操作HIC-Butyl1.以0.2mL/min的流速使用0.05%乙酸溶液清洗30个柱体积。2.以0.2mL/min的流速使用异丙醇清洗30个柱体积。3.再以0.2mL/min的流速使用0.05%乙酸清洗10个柱体积4.以0.2mL/min的流速使用纯水清洗30个柱体积。5.进200uL的0.1MNaOH3次。6.进200uL的20%乙酸水溶液3次。7.再以0.2mL/min的流速使用纯水清洗30个柱体积74ThermoFisher在蛋白药物中的解决方案-MAbPacFamilyRP色谱柱•分离原理：样品的疏水性差异，采用提供有机溶剂比例，洗脱样品从而进行分离。•柱子特色：1.是一款专用于高分辨率分析单抗和片断(包括LC,HC,Fc,Fab,scFc,andF(ab)2)的反相色谱柱.2.可以满足高分辨率质谱检测单抗变异体,单抗偶联药物和蛋白3.宽的pH范围0-144.色谱柱最高使用温度可以达到110度5.色谱柱可以使用100mmol/LNaOH：ACN=1:9清洗•柱子特性参数：官能团基质粒径孔径规格苯基球形聚合物基质，宽孔径范围(1,500Å)4µm1,500Å100mm:3.0+2.1mmID50mm:3.0+2.1mmID10mmGuardCartridges:3.0+2.1mmID75RP色谱柱分析单抗是很重要的•由于降解作用,单抗存在高度不均一性•糖基化•末端修饰•氧化•脱酰胺化•异构化•二硫键的还原•聚体•LC/MS分析单抗和单抗片断可以不需要完全降解成肽段得到这些不均一性信息.76MAbPacRP色谱柱分析蛋白的重现性数据312010080Column:Format:MobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1MAbPacRP,4µm2.1×50mmv/v/v/)2Gradient:4Time(min)-1%A808050508080%B2020505020200.02.52.72.83.01#11010#901#801Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80ºC0.6mL/min1µL-20-40-60-80#701#651#501#401UV(280nm)1.RibonucleaseA(0.5mg/mL)2.CytochromeC(0.5mg/mL)3.Lysozyme(0.5mg/mL)4.mAb(1mg/mL)#301#201#1010.000.501.001.502.002.503.00RetentionTime(min)77上样量:1000倍上样量对比结果2.50Column:Format:MAbPacRP,4µm2.1×50mm(a)0.02µgMobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1v/v/v/)1.25Gradient:Time(min)-10.02.52.7%A858550508585%B151550501515-0.50(b)0.2µg18.010.02.84.0Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80ºC0.6mL/min1µLUV(280nm)mAb(c)2µg-20900(d)20µg500-1001.001.502.002.503.003.504.00RetentionTime(min)78高pH条件下的稳定性1403Column:Format:MobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MAbPacRP,4µm2.1×50mmAfter6hrsof0.8MNaOHwashat80C125MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1113v/v/v/)Gradient:100882Time(min)-1.00.02.52.7%A858550508585%B1515505015154752.84.063150Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80ºC0.6mL/min1µL38UV(280nm)25BeforeNaOHwash1.RibonucleaseA(0.5mg/mL)2.CytochromeC(0.5mg/mL)3.Lysozyme(0.5mg/mL)4.mAb(1mg/mL)130-200.501.001.502.002.503.003.50RetentionTime(min)79分离单抗片断80单抗和单抗片断分析mAb(a)140Column:Format:MAbPacRP,4µm3×50mmMobilephaseA:H2O/FA/TFA(99.88:0.1:0.02v/v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/FA/TFA(90:9.88:0.1:0.02v/v/v/v)Gradient:-20HCTime(min)0.01.011.012.0%A808055558080%B20204545202080.0(b)(c)(d)50.0LC14.015.0FabTemperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80ºC0.5mL/min5µLUV(280nm)(a)trastuzumab(5mg/mL)Fc(b)trastuzumab+DTT(4mg/mL)(c)trastuzumab+木瓜蛋白酶(2mg/mL)(d)trastuzumab+半胱氨酸蛋白酶(2mg/mL)-10F(ab)2100scFc50-101.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.013.014.015.0RetentionTime(min)81LC/MS分析完整单抗和糖化信息Column:Format:MobilephaseA:H2O/FA/TFA(99.88:0.1:0.02v/v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/FA/TFA(90:9.88:0.1:0.02v/v/v/v)MAbPacRP,4µm3×50mmTICGradient:Time(min)0.01.011.012.0%A808055558080%B202045452020MSspectrum14.015.0Temperature:Flowrate:Inj.volume:MSDetection:MassSpec:Sample:80ºC0.5mL/min1µLpositive-ionmodeQExactive™Plustrastuzumab(5mg/mL)m/zat50+82LC/MS分析还原的单抗LCHCColumn:Format:MobilephaseA:H2O/FA/TFA(99.88:0.1:0.02v/v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/FA/TFA(90:9.88:0.1:0.02v/v/v/v)MAbPacRP,4µm3×50mmTICGradient:Time(min)0.0%A808055558080%B202045452020UV1.011.012.014.015.0Temperature:Flowrate:80ºC0.5mL/min1µL280nmpositive-ionmodeQExactive™PlusLCInj.volume:UVDetection:MSDetection:MassSpec:Sample:reducedtrastuzumab(4mg/mL)HC31+83分离单抗电荷变异体84DTT还原和IdeS酶解：scFc,LC和Fd85分离含有赖氨酸变异体的单抗片断20.0Fd´Column:Format:MobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MAbPacRP,4µm3.0×50mm18.016.0MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1v/v/v/)LCGradient:14.0Time(min)0.01.011.012.0%A707060607070%B303040403030scFc,0Lys12.010.08.0scFc,1Lys14.015.0Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80ºC0.5mL/min2µLUV(280nm)Infliximab+IdeS+DTT(2mg/mL)6.04.02.00.0-2.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.0RetentionTime(min)86分析单抗氧化变异体87分析含有氧化变异体的单抗片断12.0Column:Format:MobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MAbPacRP,4µm3×50mm(a)OxidizedHCHCLCMobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.17.55.02.5v/v/v)Gradient:Time(min)0.01.011.012.0%A707060607070%B30304040303014.015.0Fd(b)Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80ºC0.5mL/min2µL6.04.02.0LCUV(280nm)(a)trastuzumab+DTT(2mg/mL)(b)trastuzumab+DTT+IdeS(1mg/mL)scFcOxidizedscFc-1.01.02.53.85.06.37.58.810.011.312.513.815.0RetentionTime(min)88LC/MS分析氧化的scFcFdLCColumn:Format:MobilephaseA:H2O/FA/TFA(99.88:0.1:0.02MAbPacRP,4µm3×50mmscFc(a)TICOxidiziedscFcv/v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/FA/TFA(90:9.88:0.1:0.02v/v/v/v)Gradient:Time(min)0.01.011.012.0%A757563637575%B2525373725252525.6014.015.0+10(b)OxidizedscFcTemperature:Flowrate:Inj.volume:MSDetection:Massspec:Sample:80ºC0.5mL/min2µLpositive-ionmodeQExactive™PlusOxidizedtrastuzumab,reducedbyDTTanddigestedbyIdeS(1mg/mL)2524.08(c)scFc89分离ADC药物的DAR90PEG化蛋白分析9.0(a)Column:Format:MAbPacRP,4µm3.0×50mmMobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1v/v/v/)Gradient:6.04.02.0Time(min)0.0%A555525255555%B4545757545451.011.012.014.015.0Temperature:Flowrate:Inj.volume:Detection:Sample:80ºC0.5mL/min10µLUV(280nm)(a)PEGylatedprotein(11mg/mL)14.0(b)10.0(b)de-PEGylatedprotein(1.24mg/mL)5.0-2.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.0RetentionTime(min)91示意图DAR1DAR2DAR3DAR492WCBP图112.0(a)Column:Format:MAbPacRP,4µm2.1×50mmMobilephaseA:H2O/TFA(99.9:0.1v/v)MobilephaseB:MeCN/H2O/TFA(90:9.9:0.1v/v/v)Gradient:5.0Time(min)0.00.54.55.0%A656545456565%B3535555535355.56.0-2.025.0(b)Flowrate:Temperature:Inj.volume:Detection:Sample:0.6mL/min80ºC2µLUV(280nm)a.Trastuzumabb.Trastuzumab-MMAE10.0-5.00.501.002.003.004.004.50RetentionTime(min)93分离PEG化蛋白94RPLC/UV和LC/MS分析建议和清洗方法分析建议：•系统评估混标:核糖核酸酶A,细胞色素C,溶菌酶，牛血清白蛋白•大多数单抗在70C到80C进行分析.•清100mMNaOH添加在高比例有机溶剂中（如90%乙腈）.•可以在流动相中添加0.1%TFA提高分辨率.•质谱分析时可以在流动相中添加0.1%甲酸和0.02%TFA色谱柱的清洗•100mmol/LNH4Ac清洗10个柱体积•100mmol/L焦磷酸钠清洗100个柱体积•100mmol/LNH4Ac清洗10个柱体积•ACN:100mmol/LNH4Ac=9:1清洗20个柱体积•ACN:H2O=1:1清洗10个柱体积95糖•糖在细胞活动中起着基本作用•糖结构复杂•支链•电荷•翻译过程中的修饰•糖分析的方法•HILIC(广泛使用),RP,IEX•糖分析的挑战•带有不同电荷的糖在分析过程中峰形重叠在一起•解决方案•GlycanPacAXH-1(HILIC/WAX)或者GlycanPacAXR-1(RP/WAX)混合模式色谱柱专用于糖的分析•独一无二的选择性•高分辨率•高柱效(亚-2µm粒径)•MS兼容96什么是糖?糖包括单糖，低聚糖和多糖•糖常常结合在蛋白上形成糖蛋白，结合在脂上形成糖脂)•一般的糖指的是包括10个单糖单元的有分支的和没有分支的糖。97我们可以在哪里找到糖和糖蛋白•蛋白表面糖像指纹标签一样结合在蛋白表面，其在细胞活动中起着基本作用，因此影响细胞活性。•抗体•糖基转移酶(在糖蛋白合成中，连接了一个寡糖的酶)•糖苷酶(打破糖苷键的酶)98糖的复杂性•3个己糖(所有可能的糖)=1056to27648可能的三糖•6个己糖可以产生<10组合!!1299糖的类型•N-糖苷键型•糖链与Asn-AAx-Ser/Thr肽链的天冬酰胺的氨基结合。Asparagine(Asn)C(O)NH•O-糖苷键型•糖链与丝氨酸或苏氨酸的羟基相连•其他已知的形式(很少研究）-Asn–AAx-Ser/Thr-N-Linked•酯-糖苷键型•连接在蛋白的C末端•色氨酸的C末端糖•S-糖苷键型SerineThreonineO•与半胱氨酸和甲硫氨酸的S相连(Ser)(Thr)O-Linked-Ser/Thr-100为什么研究糖链?治疗性蛋白的需求•糖基化是生物药物中最常见的翻译后修饰物.•70%的临床前和临床阶段的蛋白药物候选药物都经过了糖基化•糖基化在治疗性蛋白药物中的作用:•生物活性•药代动力学•稳定性•免疫原性101糖基化分析的重要参数§每个寡糖中单糖的组成§糖的定量§链接位点分析§每个寡糖的分析§分析连接的唾液酸的数目(电荷差异)§分离结构异构体§触角的类型GalactoseFucoseGlcNAc§岩藻糖基化§高甘露糖类型NeuAc(sialicacid)§半乳糖基化重复性mannose102HILIC色谱法是最常用的糖链分析方法•HILIC通过氢键的作用(结构不同)分离糖链•常见的HILIC色谱柱：•TSKgelAmide-80(HPLC)•BEHGlycan(UHPLC)•Accucore150-Amide-HILIC(在HPLC系统上发挥UHPLC的效果)•常用的方法是使用2-AB标记糖链，但是......•带有不同电荷的糖链在相同的时间洗脱出来。103ThermoFisher可以提供的糖链分析的柱子•AccucoreAmideHILIC–分析中性糖的理想选择•跟WatersBEHGlycan色谱柱比有着相似的选择性和分