人体血液中叶酸的测定（编制说明）

人体血液中叶酸的测定

编制说明

一、编制

（一）任务来源、编制单位、起草人

叶酸作为一种基础营养物质，叶酸缺乏对健康的不利影响是多方面的，包括巨幼红细胞

贫血、高同型半胱氨酸血症、孕妇先兆子痫、自然流产、胎儿宫内发育迟缓、新生儿神经管

畸形等不良健康结局。《“健康中国2030”规划纲要》和“国民营养计划（2017-2030）”明确提

出改善重点人群的营养不良状况，对孕妇的叶酸缺乏率控制在5%以下。然而对于叶酸的营

养状况评价，目前缺乏人群叶酸检测方法的标准，文献发表的叶酸检验指标和方法各不相同，

不利于正确地评价人群的叶酸营养状况，因此迫切需要规范叶酸的检测方法，以为叶酸营养

状况的评估提供依据。受中国营养学会委托，由中国疾病预防控制中心营养与健康所牵头，

会同首都儿科研究所、浙江省疾病预防控制中心、中营惠营养健康研究院、中国医学科学院

北京协和医院、北京亦泰生物技术有限公司、北京积水潭医院、民航总医院承担团体标准的

研究和编制工作，共同研制《人群血液叶酸检测方法》团体标准。

本标准主要起草人：

（二）编制过程

1.标准建立文献资料调研

在制定本标准之前，标准主要起草人承担了营养标准体系建设项目“人群血液叶酸检测

方法”标准前期研究，依托该标准前期研究，完成了叶酸检测文献调研、检测方法和检测指

标确定。

在叶酸检测的标准方面，我国和一些国际组织如AOAC、EFSA等分别制定了食品中叶

酸的检测标准，如我国的GB5009.211-2014食品安全国家标准食品中叶酸的测定、AOAC

的AOACOfficialMethod992.05TotalFolate(PteroylglutamicAcid)inInfantFormula

MicrobiologicalMethodsFirstAction1992FinalAction1995)、EFSA的Calcium

L-5-Methyltetrahydrofolate（L-5-MethyltetrahydrofolicAcid,CalciumSalt

L-Methyltetrahydrofolate,CalciumSaltL-Methylfolate,CalciumL-5-MTHF-Ca等。

在血液样本叶酸检测方面，目前国内外没有血液样本叶酸检测的标准，但WHO等国

际组织提出了人群叶酸营养状况评估的检测指标和检测方法。美国疾病预防控制中心在历次

NHANES调查中对血清和红细胞叶酸水平分别采用微生物检测法、同位素放射性免疫法、

和液相色谱质谱联用法（LC-MS/MS）检测。国内外也有许多人群血清、红细胞叶酸检测的

1

报道。叶酸检测有很多方法，根据方法学原理，通常为微生物法、竞争性蛋白结合法、液相

色谱质谱联用法。每种方法的优缺点见表1。

微生物方法是检测叶酸的经典方法。该方法能够检测所有鼠李糖乳杆菌能利用的叶酸，

也是叶酸检测的金标准方法。该方法具有灵敏度最高、价格低廉、设备简单等优点，但手工

操作较多，检测周期长。

竞争性蛋白结合法：同位素放射免疫法建立于1970年代，在过去的几十年中得到广泛

应用。该方法具有快速、简便等优点，但实验费用高、同时存在离子辐射等问题，现已较少

应用。化学发光法和电化学发光法，则应用了化学发光技术/电化学发光技术和竞争性免疫

结合原理，具有操作自动化程度高、重现性好、精确度高的优点，在临床中具有广泛的应用。

液相色谱质谱联用方法：可以检测不同形式叶酸的峰面积，通过标准曲线计算样本中

叶酸含量。LC-MS/MS法准确度较高，能检测不同形式的叶酸，对于分析叶酸强化食品与人

体的作用有一定意义。该方法准确度和精确度较高，但样品处理复杂，需熟练的操作人员，

并且仪器设备相对昂贵，在临床方面应用中受到限制。

在上述文献调研的基础上，本标准拟建立包括目前国际上比较公认的以上三种叶酸检测

方法的团体标准。

表1.叶酸检测方法比较表

方法原理优势缺点

灵敏性最高；

检测生物体内叶酸的手工操作多，检测周

准确度高：检测所有

经典方法，利用鼠李糖期长，需3天时间；

活性叶酸；

微生物法乳杆菌能检测单谷氨精确度相对较低；

需要本量少；

酸叶酸及其衍生物，是结果受抗生素或抗

价格低廉；

叶酸检测的金标准。叶酸物质影响。

设备简单

准确性低；

叶酸的不同形式与

采用竞争法原理，使用

灵敏度相对低；叶酸结合蛋白的吸

标记的天然叶酸结合

精确度高；附性不同；

蛋白（FBP）与样本中

竞争性蛋白结合检测时间短，27min/样本稀释后存在基

的叶酸和添加的叶酸

法样品；质效应；

（生物素标记）竞争结

有商业化试剂盒，操批不批之间存在差

合，以此判断外源叶酸

作简单异。

含量

设备相对昂贵；

试剂费用较高

等梯度流动相条件下灵敏度次之；复杂的样本提取；

分离不形式叶酸；测定准确度高：各种形式仪器设备昂贵，前期

LC-MS/MS法

得到不同形式叶酸的的代谢物；投入高

峰面积，通过标准曲线精确度高；需熟练的操作人员；

2

进行计算样本中叶酸特异性高数据解释时需考虑

含量。不同叶酸形式的内

部转换。

2.标准前期研究和本次团体标准工作汇总

本团体标准之前项目负责人主持了中国疾病预防控制中心营养与健康所营养标准体系

建设项目“人群血液叶酸检测方法”标准前期研究项目。在标准前期研究和中，对血清样品叶

酸检测的微生物检测法、竞争性蛋白结合法、液相色谱-质谱联用方法进行了方法建立。

微生物检测法：对微生物检测方法的菌种、标准品应用情况进行查阅。标准品方面：国

内外文献可见微生物检测法采用的标准品主要有5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、folicacid

（FA）[1,2]等。因FA稳定性较高，方便定标操作，标准前期研究中以FA和5-甲基四氢叶酸

为标准品检测结果无明显差别，食品安全国家标准中叶酸的检测采用FA作为标准品，因此

微生物检测法采用FA作为标准品。菌株方面：国内外文献发表的血液中叶酸的检测均采用

鼠李糖乳杆菌，最初采用ATCC7469菌种，但该菌需要将受试样本和所有试剂无菌处理。

1992年SO’Broin等将传统的微生物法进行了改良，以具有氯霉素抗性的ATCC27773

（NCIB10463）代替传统的ATCC7469菌种，该菌种的应用减少了对样品的高压灭菌。使实

验步骤进一步简化。目前基本采用具有氯霉素抗性的NCIB27773菌株进行检测[3,4,5]，本团

体标准人群血液叶酸检测也采用ATCC27773菌株。

竞争性蛋白结合法：该方法均有商业化上市试剂盒，各厂家试剂盒的标准品不尽形同，

如罗氏试剂盒的标准品溯源至WHO国际标准品NIBSC编号：03/178,该叶酸定标液的标准

物质由9.75nmol/L的5-甲基四氢叶酸（81%）、1.59nmol/L的5-甲酰四氢叶酸（13%）和

0.74nmol/L的FA（6%）组成。贝克曼试剂盒使用贝克曼自制的工作标准品，采用不同批次

试剂对标准物质检测后，检测结果与WHO国际标准物质03/178的赋值差别在10%以内。

液相色谱质谱联用方法：可以检测不同形式叶酸的峰面积，通过标准曲线计算样本中

叶酸含量。美国CDC采用液质联用方法检测NHANHS调查血清样本中的5-甲基四氢叶酸、

folicacid、5-甲酰四氢叶酸、四氢叶酸、5,10亚甲基四氢叶酸和氧化产物MeFox共6种不同

13

形式的叶酸。分别用不同上述标准品和各自相应的C5标记的内标进行检测。5-甲基四氢叶

酸是血液中叶酸最主要的存在形式，约占总量的82%-93%。目前商业化的内标有5-甲基四

氢叶酸、FA、5-甲酰四氢叶酸和5，10-亚甲基四氢叶酸、四氢叶酸五种形式。国内外发表

的液相色谱质谱联用方法检测叶酸的文献方法不统一，包括采用外标法[6]和采用1-5种内标

[[7,8,9]法的液质检测方法，参考美国疾病预防控制中心报道[10]的数据血清中5-甲酰四氢叶酸

和5,10-亚甲基四氢叶酸含量很低，大部分情况低于检测限。本团体标准液质联用的方法建

立含有5-甲基四氢叶酸和folicacid标准品和其内标的检测方法。

3

3.方法建立和验证

3.1微生物方法

3.1.1方法建立和优化

方法建立：按照美国疾病预防控制中心“RBCandSerumFolateusingMicrobiologicAssay

NHANES2009-2010”的方法建立叶酸微生物检测方法。

方法优化：该方法使用的标准品为5-甲基四氢叶酸，在标准前期研究中分别采用5-甲

基四氢叶酸和叶酸为标准品进行检测，结果显示采用两种标准品盲样的检测结果无明显差别，

具体结果见图1，表2。O’BroinS报道的使用FA，5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸三种

标准品的检测结果也无明显差别[2]。另外FA稳定性较好，方便定标操作，因此微生物检测

法采用FA作为标准品，检测前对FA进行定标，以确定FA的浓度。

A:

B:

图1.A以叶酸为标准品的拟合曲线B以5-甲基四氢叶酸为标准品的拟合曲线

按照上述标准曲线分别进行待测血清检测，两份血清检测结果分别如下：

表2以5-甲基四氢叶酸和FA为标品进行的待测血清检测结果表

4

样品5-甲基四氢叶酸为标品（ng/mL）FA为标品（ng/mL）

待测血清118.6718.52

待测血清212.1811.69

待测血清315.3015.41

3.1.2方法验证：根据团体标准中微生物检测方法步骤，进行改良微生物法线性范围、精密

度、准确度测试。

（1）线性范围：0.05-0.5ng/ml

（2）各单位检出限：0.011-0.025ng/ml。

（3）精密度：实验室质控血清样品在一张96孔板连续测定10次，计算板内变异系数

在2.47%-4.44%，均小于10%。将血清或溶血液样品在不同96孔板测定至少3次，计算得

板间变异系数在0.35%-8.78%，均小于10%。

（4）准确度：检测SRM1950，将测定值与参考值进行比较，计算测定值与参考值的绝

对误差和相对误差。相对误差（RE）=(测定值-参考值）/参考值×100%。

表3准确度检测表：

参考物质名参考值测定值绝对误差相对误差

称（nmol/L）（nmol/L）（nmol/L）（%）

SRM195030.632.11.54.9

（5）人员培训：按照建立的改良微生物方法对来自河北省、山东省等16个省级及地方

疾病预防控制中心的检测人员进行培训和现场实验操作，检测结果见下表：

表4叶酸检测培训和考核结果表

与理论值（11.0ng/ml）的

省/市结果(ng/ml)汇总

偏差（%）

110.28-6.6

212.6815.3

312.6815.3

411.938.416个检测有两个标准曲线加样

59.6-12.7失败，共得到14个结果。其中9

610.2-7.3个检测结果与靶值结果相差

7129.110%以内，5个检测结果与靶值

812.3812.5结果相差20%以内。

911.43.6

1011.43.6

119.3-15.5

5

1210.7-2.7

1311.43.6

1410.2-7.3

3.2液相色谱串联质谱方法的建立和验证

3.2.1方法建立和优化

方法建立：参考美国疾病预防控制中心发表的“Ahigh-throughputLC-MS/MSmethod

suitableforpopulationbiomonitoringmeasuresfiveserumfolatevitamersandoneoxidation

product”、“DeterminationofFolateVitamersinHumanSerumbyStable-Isotope-DilutionTandem

MassSpectrometryandComparisonwithRadioassayandMicrobiologicAssay”文献中的方法建

立血清中的叶酸和5-甲基四氢叶酸液质联用检测方法，离子对的选择主要参考文献

“DeterminationofFolateVitamersinHumanSerumbyStable-Isotope-DilutionTandemMass

SpectrometryandComparisonwithRadioassayandMicrobiologicAssay”中所采用的参数，检

索相应化学分子数据库并结合实际实验数据（见图2和图3），选择5-甲基四氢叶酸m/z

22-Sep-202015:38:06

460.17→3F1As3tS.02030与180.07，叶酸m/z442.09→295.14和176.10，5-甲基四氢叶4:MR酸Mof5（Chan1nel3sECS+,d3）

4.294.424.46460.294>310(5mTHF)

1002.07

1.051.261.803.581.40e4

4.034.56

1.522.392.632.993.454.24

0.620.750.941.752.342.723.213.703.984.905.00

%1.97

0.130.501.323.754.72

m/z464.25→317.20，0.8叶3酸（d4）m/z446.20→299.10作为离子对。

0

0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00

FAstS0034:MRMof5ChannelsES+

1.66460.17>313.2(5mTHF)

10022-Sep-2020125.:1245e:727

FAstS0011:MRMof6ChannelsES+

%

4.49443.07>385.19(FA)

2.14

1004.048.92e4

03.533.673.904.214.53

0.501.001.502.002.502.833.003.233.504.004.505.005.506.00

%2.473.023.07

FAstS0032.052.174:MRMof5ChannelsES+

0.160.741.692.004.594.885.02

1.67460.17>194.12(5mTHF)

10005.07e6

0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00

FAstS%0011:MRMof6ChannelsES+

4.164.33443.07>368.87(FA)

1000

0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.009.44e4

4.46

FAstS0033.203.603.704.534:MRMof5ChannelsES+

%3.99

0.041.422.412.733.043.334.90

0.420.680.751.221.5111.6.7611.882.112.252.914.80460.17>180.07(5mTHF)

1000.98

01.03e7

0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00

%

FAstS0011:MRMof6ChannelsES+

02.24443.07>296.03(FA)

1000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.001.44e7

FAstS0034:MRMof5ChannelsES+

%1.67460.17>152.04(5mTHF)

100

2.523.68e6

0

%0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00

FAst0S0011:MRMof6ChannelsES+

0.501.001.502.002.503.003.504.0044..45705.005.50443.07>62.7090.05(FA)

1F0A0stS0031:MRMof2ChannelsES+

4.412.09e5

TIC(FA)

2.254.154.55

100%3.393.93

1.942.262.483.003.143.243.593.795.07e5

0.250.420.701图.722.062甲.31基2.6四1氢叶酸子离子响应4.674.99

1.181.391.5825-4.45

0%2.30

2.923.383.663.834.254.54

0.5001.9.0301.501.581.782.002.25.0542.5923..90903.253.503.942.40.0074.505.005.506.00

0Time

FAstS0010.501.001.502.002.503.003.504.004.505.0015:.M50RMof6Cha6n.0n0elsES+

2.24442.086>295.139(FA)

1008.92e7

%

0

0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00

FAstS0011:MRMof6ChannelsES+

2.24442.086>176.1(FA)

1004.39e7

%

0

0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00

FAstS0011:MRMof6ChannelsES+

2.24TIC(FA)

100图3叶酸（folicacid）子离子响应1.48e8

%

0Time

方法优化：0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00

（1）前处理方法优化：分别考察了酸蛋白沉淀法、固相萃取柱(SPE)处理法和超滤法。

酸蛋白沉淀法采用偏硅酸与血清中蛋白质的正离子结合，形成不溶性的盐沉淀，沉淀血清中

的蛋白质，从而纯化血清中的叶酸和5-甲基四氢叶酸。但经过试验发现，收取到的叶酸和

5-甲基四氢叶酸含量较低，回收到的叶酸和5-甲基四氢叶酸仅为理论值的30%，与实际情况

6

不符。。超滤法用3kDa超滤管对血清进行超滤，收集下层液体，进行分析。经过试验发现，

此方法所得下层液中的叶酸和5-甲基四氢叶酸含量极低，检测响应非常低，说明此方法不

适合用于叶酸和5-甲基四氢叶酸的萃取纯化，。随后开发了固相萃取柱(SPE)处理法，通过

SPE固相小柱对血清样本进行纯化，萃取叶酸和5-甲基四氢叶酸，回收率符合分析要求，

损失少，通过方法验证数据可知，叶酸和5-甲基四氢叶酸的加标回收率均在100%±15%范围

内。综上所述，确定血清样品的前处理方法采用固相萃取柱(SPE)处理法。

（2）超高效液相分析优化：采用WatersHSST3填料色谱柱进行梯度洗脱模式分离，

在10分钟内有机相比例由5%升至85%，虽能对叶酸和5-甲基四氢叶酸分离但分析时候较

久，使用不便，不易于临床大规模样品的检测（见图4）。遂优化分离梯度，经过多次不同

梯度的摸索实验，设置初始梯度为15%有机相，0.5分钟升至30%有机相，再至3.5分钟有

机相比例至85%，进行分离，使用此梯度洗脱模式，可有效分离待测目标物质叶酸和5-甲

基四氢叶酸，两种待测目标物质达到基线分离效果，同时将原有的分析时间从10分钟减少

至5分钟，大大减少了分析时间，可满足快速大量检测需求，易于临床检测使用（见图5）。

图4液质联用检测图

图5液质联用检测图

3.2.2方法验证

（1）检出限与定量限

分别用样品缓冲液稀释5-MeTHF标准品至0.0005ng/ml和0.00125ng/ml，稀释FA

标准品至0.2ng/ml和0.1ng/ml。进样分析，使两种物质检出限浓度下S/N值约为3，定量限

7

浓度下S/N值约为10。经验证，5-MeTHF检出限为0.0005ng/ml，定量限为0.00125ng/ml；

FA检出限为0.1ng/ml，定量限为0.2ng/ml。

（2）线性范围

5-MeTHF线性范围：0.2-100ng/ml

FA线性范围：0.1-50ng/ml

（3）精密度：分别三天对低、中、高三组血清样品（各组6个）进行SPE处理，并上

机检测，对3天的的低、中、高样品的检测结果进行日内及日间精密度评价，5-甲基四氢叶

酸和叶酸的日内精密度在0.68%-13.59%，均小于15%。日间精密度在1.96%-14.21%，均小

于15%。

（4）准确度：分别取中浓度