人体血液中叶酸的测定

ICS

CCS

团体标准

T/CNSSXXX—202X

人体血液中叶酸的测定

Determinationoffolateinhumanblood

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国营养学会  发布

T/CNSSXXX—202X

人体血液中叶酸的测定

1范围

本文件描述了人体血液中叶酸的测定方法，包括微生物法、液相色谱串联质谱法和竞争性蛋白结合

法。

本文件适用于：

a）微生物法：血清和红细胞中叶酸的测定；

b）液相色谱串联质谱法：血清中5-甲基四氢叶酸和强化叶酸的测定；

c）争性蛋白结合法：血清和红细胞中叶酸的临床筛查检验。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

WS/T225临床化学检验血液标本的收集与处理

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

叶酸folate

生物体内一组由蝶啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸结合而成的化合物的统称。

注：根据谷氨酸的个数及氧化还原状态及一碳单位的不同分为不同的组分。

3.2

强化叶酸folicacid；FA

食品中强化的氧化型蝶酰单谷氨酸。

3.3

5-甲基四氢叶酸5-methyltetrahydrofolate；5-MeTHF

血液中一种具有生物活性的还原型蝶酰单谷氨酸，占血液叶酸总量的80％以上。

4血液样品的采集与保存

按照附录A的方法进行。

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5微生物法

5.1原理

叶酸是鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）生长所必需的营养素。在一定控制条件下，将

鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有待测样品的培养基中，培养一段时间后测定吸光度值，在一定测定范围内

可以根据叶酸含量与吸光度值的标准曲线计算出受试样品中叶酸的含量。

5.2试剂或材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水，电阻率＞18MΩ.cm。

5.2.1试剂

5.2.1.1氢氧化钠（NaOH）。

5.2.1.2抗坏血酸（C6H8O6）。

5.2.1.3抗坏血酸钠（C6H7O6Na）。

5.2.1.4甘油（C3H8O3）。

5.2.1.5氯霉素（C11H12Cl2N2O5）。

5.2.2试剂配制

5.2.2.1氢氧化钠溶液（0.01mol/L）：称取0.4g氢氧化钠加水溶解并稀释至1L，于2℃～8℃保

存，有效期2个月。

5.2.2.20.5％抗坏血酸钠溶液：称取0.5g抗坏血酸钠加水溶解并稀释至100mL，现用现配。

5.2.2.31％抗坏血酸溶液：称取1.0g抗坏血酸加水溶解并稀释至100mL，裂解全血标本时现用现

配。

5.2.2.480％甘油：量取80mL甘油，与20mL水混匀，121℃高压15min，冷却后4℃保存，有效

期1个月。

5.2.2.5氯霉素储备液（3mg/mL）：称取600mg氯霉素，加2mL乙醇溶解后（可温水助溶），加水

至200mL，采用0.22μm微孔滤膜于超净工作台或生物安全柜中过滤除菌，EP管分装，每管1mL，

于-70℃保存。

5.2.3培养基

5.2.3.1菌种生长培养基：按附录B中B.1的规定配制。

5.2.3.2叶酸检测培养基：按附录B中B.2的规定配制。

5.2.4叶酸标准储备液的配制

5.2.4.1叶酸标准品（C19H19N7O6,CAS：59-30-3）：纯度≥97％。或经国家认证并授予标准物质证书的

标准物质。

5.2.4.2叶酸标准储备液（20mg/L）的配制：称取叶酸标准品20mg（精确至0.01mg），用0.01mol/L

氢氧化钠溶液溶解并转移至容量瓶，定容至1L，混匀后分装，-70℃以下保存。

5.3仪器设备

5.3.1分析天平：感量1mg、0.1mg和0.01mg。

5.3.2恒温培养箱：37℃±1℃。

5.3.3压力蒸汽灭菌器。

5.3.4紫外分光光度计（含256nm波长）。

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5.3.5涡旋振荡器。

5.3.6超净工作台或生物安全柜。

5.3.7酶标仪（含590nm波长）。

5.3.8微孔滤膜（0.22μm）。

5.3.996微孔板（无菌）。

5.4菌种的活化与保存

5.4.1菌种：鼠李糖乳杆菌（LactobacillusrhamnosusATCC27773或LactobacillusrhamnosusNCIB

10463），是LactobacillusrhamnosusATCC7469经过氯霉素诱导后的菌种。

5.4.2菌种的活化制备与保存：按附录C的规定进行。

5.5分析步骤

5.5.1叶酸标准储备液的定值

准确吸取1mL20mg/L的叶酸标准储备液和4mL0.01mol/L氢氧化钠溶液至离心管中，混匀。重

复此操作共3次，得到三管标准溶液。采用紫外分光光度计测定三管标准溶液256nm波长下的吸光度值，

以0.01mol/L氢氧化钠溶液调零点，按公式（1）计算叶酸标准储备液的实际叶酸浓度，即为叶酸标准

储备液的定值。

（1）

A×M×5×1000

式中：

C=�

C——标准储备液的叶酸浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

——平均吸光度值；

E——摩尔消光系数,数值为24500；

A

5——稀释倍数；

M——叶酸相对分子质量，数值为441.42

1000——由克每升换算为毫克每升的换算系数。

5.5.2叶酸标准系列溶液配制

根据叶酸标准储备液定值的结果，采用新鲜配制的0.5％抗坏血酸钠将叶酸标准储备液稀释为1

mg/L（即1μg/mL），然后用0.5％抗坏血酸钠溶液将1μg/mL的标准品溶液稀释至1ng/mL。再依次用

0.5％抗坏血酸钠制备浓度分别为0.5ng/mL、0.4ng/mL、0.3ng/mL、0.2ng/mL、0.15ng/mL、0.1ng/mL、

0.05ng/mL、0ng/mL的标准系列溶液。

5.5.3血液样品稀释

5.5.3.1血清样品稀释：用0.5％的抗坏血酸钠稀释血清样品，建议按1：75的比例进行稀释，用涡旋

振荡器混匀。

5.5.3.2全血溶血样品稀释：用0.5％的抗坏血酸钠再次稀释全血溶血样品，建议按1：100～1：200

的比例进行稀释，用涡旋振荡器混匀。

5.5.4接种菌液的制备

取200μL活化储备菌种加至100mL的叶酸检测培养基，混匀。

5.5.5接种与培养

将100μL不同浓度的叶酸标准曲线溶液或血液样品加至96微孔板，每孔再加200μL接种菌液，用

密封膜封闭96微孔板，轻微混匀，于37℃±1℃恒温培养箱内培养45h。建议每个叶酸标准浓度或血液

样品做三个平行孔。

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5.5.6测定

培养结束，充分颠倒混匀，使微孔板内每孔聚集的菌落分散均匀，缓慢撕下密封膜，静置（等待时

间不应超过10min），待各孔没有气泡后，用酶标仪测定590nm波长下的吸光度值。

5.5.7试验数据处理

以标准曲线溶液的叶酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，进行标准曲线的拟合，选择二项式曲线

拟合。根据样品的吸光度值，使用标准曲线计算血液样品中叶酸的相应浓度，即拟合计算值。红细胞叶

酸浓度按公式（2）计算。

（）（2）

�2×11−�31−HCT/100

式中：�1=���/100

C1——红细胞叶酸的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

C2——全血溶血叶酸的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）,C2=拟合计算值×稀释倍数；

C3——血清叶酸浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL），C3=拟合计算值×稀释倍数；

HCT——红细胞压积。

示例：

血清样品稀释倍数为75倍，血清叶酸拟合计算值为0.22ng/mL，则血清叶酸0.22×75=16.5ng/mL。

全血溶血样品稀释倍数为100，全血溶血叶酸拟合计算值为0.12ng/mL，则全血溶血叶酸=0.12×100=12ng/mL。

按照公式（2），红细胞叶酸（）

12×11−16.5×1−40/100

=40/100=305.25ng/mL

5.6质量控制和保证

5.6.1标准曲线拟合：R2＞0.99。

5.6.2精密度：样品板内变异系数（CV）＜15％。

6液相色谱串联质谱法

6.1原理

血清中的5-MeTHF和FA经固相萃取柱净化富集，使用液相色谱法分离，串联质谱多反应监测模式（MRM）

检测，同位素内标法定量，该方法可以测定血清叶酸中的5-MeTHF和FA。

6.2试剂或材料

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。

6.2.1试剂

6.2.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。

6.2.1.2甲酸(HCOOH)：色谱纯。

6.2.1.3半胱氨酸(C3H7NO2S)：纯度≥98.5％。

6.2.1.4抗坏血酸(C6H8O6)：优级纯。

6.2.1.5磷酸盐缓冲液：20mmol/L，pH7.2。

6.2.1.6甲酸铵(NH4HCO2)：分析纯。

6.2.1.7乙腈(CH3CN）：色谱纯。

6.2.1.8乙酸(CH3COOH)：分析纯。

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6.2.2试剂配制

6.2.2.11％甲酸铵溶液：称取5.0g甲酸铵加水溶解并稀释至500mL，混匀。2℃～8℃避光存放，有

效期7天。

6.2.2.2样品缓冲液：称取1.0g抗坏血酸用200mL1％甲酸铵溶液溶解，混匀，2℃～8℃避光存放，

有效期2天。

6.2.2.30.05％甲酸铵溶液：取10mL1％甲酸铵溶液用纯水稀释至200mL，2℃～8℃避光存放，有效

期7天。

6.2.2.4清洗液：称取0.4g抗坏血酸用0.05％甲酸铵溶液溶解并稀释至200mL，混匀，2℃～8℃避光

存放，有效期2天。

6.2.2.5洗脱液：称取1.225g抗坏血酸加水溶解并稀释至245mL，再加入甲醇200mL、乙腈50mL、

乙酸5mL，混匀。2℃～8℃避光存放，有效期2天。

6.2.2.6含0.1％半胱氨酸的磷酸盐缓冲液：称取0.1g半胱氨酸用磷酸盐缓冲液（20mmol/L，pH7.2）

溶解并稀释至100mL，混匀。2℃～8℃避光存放，有效期2天。

6.2.2.71％抗坏血酸溶液：称取1.0g抗坏血酸加水溶解并稀释至100mL，混匀。现用现配。

6.2.3标准品

6.2.3.15-甲基四氢叶酸标准品（LevomefolicAcid，5-MeTHF，CAS：134-35-0）：纯度≥97％或有

证标准物质。

6.2.3.2叶酸标准品（FolicAcid，FA，CAS：59-30-3）：纯度≥97％或有证标准物质。

6.2.3.3同位素内标5-甲基四氢叶酸标准品（LevomefolicAcid-13C,d3，5-MeTHF-13C,d3，CAS：

1356019-94-7）：纯度≥95％或有证标准物质。

6.2.3.4同位素内标叶酸标准品（FolicAcid-d4，FA-d4，CAS：171777-72-3）：纯度≥97％或有证

标准物质。

6.2.4标准品溶液配制

6.2.4.15-MeTHF标准品储备液（100μg/mL）：称取1mg5-MeTHF标准品（精确至0.01mg）和50mg

抗坏血酸用含0.1％半胱氨酸的磷酸盐缓冲液稀释并定容至5mL，再用1％抗坏血酸按照1：1进行稀释，

制备成浓度为100μg/mL的5-MeTHF标准品储备液。分装后-70℃冻存，有效期2年。

6.2.4.2FA标准品储备液（100μg/mL）：称取1mgFA标准品（精确至0.01mg），用磷酸盐缓冲液

稀释并定容至5mL，再用去离子水按照1：1进行稀释，制备成浓度为100μg/mL的FA标准品储备液。分

装后-70℃冻存，有效期2年。

6.2.4.35-MeTHF标准品中间液：移取100μL5-MeTHF标准储备液，用0.1％抗坏血酸溶液稀释并定容

至10mL，制备成浓度为1μg/mL的5-MeTHF标准品中间液。分装后-70℃冻存，有效期2个月。

6.2.4.4FA标准品中间液：移取100μLFA标准储备液，用0.1％抗坏血酸溶液稀释并定容至10mL，

制备成浓度为1μg/mL的FA标准品中间液。分装后-70℃冻存，有效期2个月。

6.2.4.55-MeTHF/FA标准品工作液（5-MeTHF/FA浓度为100/50ng/mL）：取1μg/mL的5-MeTHF标准品

中间液100μL和1μg/mL的FA标准品中间液50μL，加样品缓冲液850μL，混匀，现用现配。

6.2.4.65-MeTHF/FA标准系列溶液：将5-MeTHF/FA标准品工作液用样品缓冲液进行系列稀释，得到

5-MeTHF/FA的终浓度分别为50/25ng/mL、20/10ng/mL、10/5ng/mL、5/2.5ng/mL、1/0.5ng/mL、0.2/0.1

ng/mL的标准系列溶液。

6.2.5内标溶液配制

6.2.5.15-MeTHF-13C,d3内标储备液（100μg/mL）：称取5-MeTHF-13C,d3内标标准品1mg（精确至

0.01mg），用0.1％抗坏血酸溶液稀释并定容至10mL。分装后-70℃冻存，备用。

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6.2.5.2FA-d4内标储备液（100μg/mL）：称取FA-d4内标标准品1mg（精确至0.01mg），用0.1％

抗坏血酸溶液稀释并定容至10mL。分装后-70℃冻存，备用。

6.2.5.3混合内标工作液（5-MeTHF-13C,d3/FA-d4浓度为100/50ng/mL）：取5-MeTHF-13C,d3和FA-d4

内标储备液各100μL加0.1％抗坏血酸溶液900μL，制备成浓度为10μg/mL的5-MeTHF-13C,d3和FA-d4

内标溶液。再取10μg/mL的5-MeTHF-13C,d3内标溶液10μL和FA-d4内标溶液5μL，加0.1％抗坏血酸

溶液985μL，制备成混合内标工作液，混匀，现用现配。

6.3仪器设备

6.3.1超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用系统：配电喷雾离子源（ESI）。

6.3.2分析天平：感量0.1mg、0.01mg。

6.3.3生物样品前处理仪：配备固相萃取装置，可输出0.01psi～5.0psi的正压压力。

6.3.4旋涡混合器。

6.3.5含非极性键合硅胶基材料的固相萃取柱（SPE）的96孔板。

6.4分析步骤

6.4.1样品处理

6.4.1.1样品预处理

取血清150μL血，加入样品缓冲液370μL加、混合内标溶液30μL，混匀。将混匀后样品放置2℃～

8℃冰箱孵育20min。

6.4.1.2固相萃取柱（SPE）处理

取含SPE柱的96孔板放置于生物样品前处理仪中，配套使用96孔收集板，使用乙腈、甲醇及缓冲液

依次分别活化SPE柱，然后将孵育好的样品上样，用清洗液清洗SPE柱3次，清洗完成后用96孔收集板（2

mL）进行洗脱操作，收集洗脱液（见表1）。将处理过后的洗脱液14000rpm/min离心5min后，取出适

量的上清液进行超高效液相色谱串联质谱分析。

表1SPE样品处理步骤

流程试剂次数体积（μL）压力（psi）时间（min）备注

乙腈15000.012

甲醇15000.012倒废液

活化

5500.012

缓冲液2

5500.022倒废液

10.0054

上样样品500

20.011

4500.012倒废液

清洗清洗液34500.012

4500.022

2500.0055换收集板

洗脱洗脱液2

2500.0055

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6.4.2标准曲线溶液配制

分别取6种不同浓度的5-MeTHF/FA标准系列溶液各150μL（6.2.4.6），加样品缓冲液370mL、混

合内标工作液30μL混，制成标准曲线溶液。各标准曲线溶液中5-MeTHF（13C,d3）内标浓度为5.5ng/mL，

FA（d4）内标浓度为2.75ng/mL。

6.4.3液相色谱-串联质谱联用仪参数设置

6.4.3.1液相色谱分析参考条件：

——色谱柱：WatersHSST3色谱柱（2.1mm×100mm，1.8µm）色谱柱，或等效柱；

——流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液；流动相B为甲醇；

——流速：0.3mL/min；

——进样量：5μL；

——柱温：35˚C。

液相梯度洗脱程序见表2。

表2液相梯度洗脱程序

时间（min）％A％BCurve

085.015.00

0.5070.030.06

3.5015.085.06

3.6085.015.01

5.0085.015.01

6.4.3.2质谱测定参考条件：

——电离模式：ESI+；

——毛细管电压：3.26KV；

——检测方式：多反应监测模式（MRM）；

——脱溶剂气温度：450˚C；

——脱溶剂气流量：1000L/h；

——源温度：150˚C。

MRM离子对参数见表3。

表3离子对参数

分类目标化合物MRM（m/z）锥孔电压（v）碰撞能量（eV）

460.17＞180.074038

5-MeTHF

460.17＞313.20a4022

待测物

442.09＞176.102238

FA

442.09＞295.14a2216

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表3离子对参数（续）

分类目标化合物MRM（m/z）锥孔电压（v）碰撞能量（eV）

5-MeTHF（13C,d3）464.25＞317.20a2319

内标物

FA（d4）446.20＞299.10a2414

a定量离子。

6.4.4试验数据处理

6.4.4.1工作曲线的建立

在超高效液相色谱和串联质谱分析条件下，将6.4.2得到的标准曲线溶液由低浓度到高浓度进行进

样分析，分别以5-MeTHF与5-MeTHF（13C,d3）色谱峰，FA与FA（d4）色谱峰的峰面积比值-浓度进行

线性回归，得到标准曲线溶液的直线拟合方程[见公式（3）]。其线性相关系数R2≥0.99。

(3)

�𝑠��𝑠�

式中：+�…………..

�𝐼=�×�𝐼

Astd——标准曲线溶液中5-MeTHF或FA定量离子MRM积分峰面积；

AIS——标准曲线溶液中同位素内标MRM积分峰面积；

Cstd——标准曲线溶液中5-MeTHF或FA的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

CIS——标准曲线溶液中同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

a——拟合直线的斜率；

b——拟合直线的截距。

6.4.4.2样品结果计算

在超高效液相色谱和串联质谱分析参考条件下，将得到的待测样品溶液进样分析，按内标法计算待

测试样溶液中目标物的质量浓度。根据公式（3）得到的标准曲线，可计算得到公式（4）中Ctarget值，

即待测样品中5-MeTHF或FA的浓度。

将公式（3）中拟合得到的参数a，b代入式（4），得到工作曲线。

(4)

𝑠�𝑎𝑠𝑠�𝑎𝑠

式中：

�𝐼=�×�𝐼+�…………….

Atarget——待测样品中5-MeTHF或FA定量离子MRM积分峰面积；

AIS——待测样品中同位素内标MRM积分峰面积；

Ctarget——待测样品中5-MeTHF或FA的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

CIS——待测样品中同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

a——式3中拟合得到直线斜率；

b——式3中拟合得到截距。

计算结果表示到小数点后两位。

6.5质量保证和控制

6.5.1内部质量控制

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实验室应制定测试结果质量控制程序，明确内部质量控制的内容、方式和要求。随同样品检测需测

定质量控制样品，绘制质量控制图，观察测试工作的稳定性、系统偏差及趋势，及时发现异常现象并采

取相应的改进措施。

6.5.2外部质量控制

实验室应参加国内外实验室认可机构组织的能力验证活动，参加国际间、国内同行间的实验室比对

试验。根据外部评审、能力验证、考核、比对等结果评估检验结果的质量并采取相应的改进措施。

6.6精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的15％。

6.7检出限和定量限

本方法5-MeTHF、FA检出限分别为0.0005ng/mL、0.1ng/mL，5-MeTHF、FA定量限分别为0.00125ng/mL、

0.2ng/mL。

6.8回收率

本方法5-MeTHF的加标回收率为96.0％～110.0％，FA的加标回收率为92.0％～112.0％。

7竞争性蛋白结合法

7.1原理

样品中的叶酸和添加的标记叶酸与叶酸结合蛋白竞争性结合，依据电化学/化学发光检测体系中叶

酸浓度与体系的电化学/化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理进行叶酸含量检测。

7.2试剂和材料

7.2.1叶酸检测试剂盒（化学发光/电化学发光法）。

7.2.2叶酸检测定标品、质控品。

7.2.3仪器基础试剂和耗材。

7.3仪器设备

电化学发光仪或化学发光仪。

7.4分析步骤

7.4.1按照仪器说明书和试剂盒使用说明，准备仪器、试剂、标准品和质控品。试剂盒至少包含两水

平的质控品。

7.4.2进行仪器系统测试及叶酸含量检测试剂盒定标和质控品测定，质控品检测结果符合要求，方可

进行样品中叶酸的测定。

7.4.3应使血液样品的温度达到室温，混合均匀后进行测定，确保样品杯中无气泡。为了防止液体挥

发影响结果，所有样品、标准品、质控品上机后都应在2h内测定。

7.4.4严格按照仪器操作说明要求进行标准品、质控品及样品的测定，并读取、保存、计算检测结果。

7.5质量保证和控制

7.5.1精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的15％。

7.5.2实验室应制定测试结果质量控制程序，明确内部质控的内容、方式及要求，并参加国内外的外

部质控，根据外部审评、能力验证、考核、对比等结果评估检验结果的质量并采取相应的改进措施。

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附录A

（规范性）

血液样品的采集与保存

A.1样品采集

根据WS/T225的要求采集空腹静脉血，用于血清叶酸检测的样品使用不含抗凝剂的采血管采集血

液1mL～2mL，用于红细胞叶酸检测的样品使用含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝剂的采血管采集血液1mL～

2mL。

A.2样品制备（所有操作需避光进行）

A.2.1血清样品

按照WS/T225的要求分离制备血清样品。

A.2.2溶血样品

A.2.2.1EDTA抗凝全血需,制备成溶血样品用于红细胞叶酸的测定或保存：

a）微生物法：EDTA抗凝管采集血样后反复颠倒5次～8次，使抗凝全血充分混匀。取100μL抗

凝全血和1000μL新鲜配制的1％抗坏血酸于EP管中，混匀后迅速于-20C冰箱冷冻，制备溶

血样品。

b）竞争性蛋白结合法：按照红细胞叶酸试剂盒说明书的方法制备溶血样品。

A.2.2.2全血宜在血液采集当天立即裂解溶血；如果不能当天操作，则将EDTA抗凝全血于2℃～8℃

避光保存，48h内完成溶血样品的制备。

A.2.3样品保存

制备好的血清样品可立即开展叶酸测定，也可适当稳定保存后测定，2℃～8℃冰箱冷藏保存不应超

过48h，-20℃冷冻保存不应超过28d。-70℃以下可长期存放，避免反复冻融。

溶血样品宜-20℃过夜冻存后测定叶酸，直至28d。若样品不能及时检测，应于-70℃以下冰箱

存放，避免反复冻融。

12

T/CNSSXXX—202X

附录B

（规范性）

培养基配置

B.1菌种生长培养基

B.1.1试剂

B.1.1.1叶酸酪蛋白培养基。

B.1.1.2抗坏血酸钠（C6H7O6Na）。

B.1.1.3吐温80（Tween80）。

B.1.2叶酸标准品工作液（100ng/mL）配制

准确移取20mg/L的叶酸标准品储备液0.5mL于100mL容量瓶中，用新鲜配制的0.5％抗坏血酸

钠稀释并定容至刻度。

B.1.3菌种生长培养基配制

称取4.7g叶酸酪蛋白培养基,量取100mL水溶解，加入50mg抗坏血酸、20μL吐温80，混

匀，121℃高压5min，冷却至室温后，无菌操作加入20mg氯霉素（6.67mL滤膜过滤后的氯霉素储

备液）、15ng叶酸（加入150μL酸滤膜过滤后的100ng/mL的叶酸标准品工作液），混匀，用50mL

离心管分装后-20℃保存备用，有效期2个月。

B.2叶酸检测培养基

B.2.1试剂

B.2.1.1叶酸酪蛋白培养基。

B.2.1.2吐温80（Tween80）。

B.2.1.3抗坏血酸（C6H8O6）。

B.2.1.4硫酸锰（MnSO4）。

B.2.2试剂配制

称取7.05g叶酸酪蛋白培养基，量取100mL水溶解，加入3mg氯霉素（1mL氯霉素储备液）、

30μL吐温80，混匀，加热煮沸。冷却至室温后，加75mg抗坏血酸、15mg硫酸锰，混匀，备用，

或-20℃保存，有效期2个月。

13

T/CNSSXXX—202X

附录C

（规范性）

菌种的活化制备与保存

C.1接种培养

将1mL鼠李糖乳杆菌菌种接种于20mL菌种生长培养基，充分摇匀后，于37℃±1℃恒温培养箱

内，旋紧离心管瓶盖密闭培养24h。

C.2活化培养

取100μL～300μL培养24h的菌液接种于另一支20mL菌种生长培养基，充分摇匀后，于37℃

±1℃恒温培养箱内密闭培养24h（该步骤重复进行3次）。

C.3保存

取C.2操作后的菌液2mL至20mL菌种生长培养基，于37℃±1℃恒温培养箱内密闭培养20h

后与无菌的80％甘油1：1混合，即为活化的储备菌种，EP管分装，每管500μL，-70℃以下保存。

_________________________________

14

人体血液中叶酸的测定

编制说明

一、编制

（一）任务来源、编制单位、起草人

叶酸作为一种基础营养物质，叶酸缺乏对健康的不利影响是多方面的，包括巨幼红细胞

贫血、高同型半胱氨酸血症、孕妇先兆子痫、自然流产、胎儿宫内发育迟缓、新生儿神经管

畸形等不良健康结局。《“健康中国2030”规划纲要》和“国民营养计划（2017-2030）”明确提

出改善重点人群的营养不良状况，对孕妇的叶酸缺乏率控制在5%以下。然而对于叶酸的营

养状况评价，目前缺乏人群叶酸检测方法的标准，文献发表的叶酸检验指标和方法各不相同，

不利于正确地评价人群的叶酸营养状况，因此迫切需要规范叶酸的检测方法，以为叶酸营养

状况的评估提供依据。受中国营养学会委托，由中国疾病预防控制中心营养与健康所牵头，

会同首都儿科研究所、浙江省疾病预防控制中心、中营惠营养健康研究院、中国医学科学院

北京协和医院、北京亦泰生物技术有限公司、北京积水潭医院、民航总医院承担团体标准的

研究和编制工作，共同研制《人群血液叶酸检测方法》团体标准。

本标准主要起草人：

（二）编制过程

1.标准建立文献资料调研

在制定本标准之前，标准主要起草人承担了营养标准体系建设项目“人群血液叶酸检测

方法”标准前期研究，依托该标准前期研究，完成了叶酸检测文献调研、检测方法和检测指

标确定。

在叶酸检测的标准方面，我国和一些国际组织如AOAC、EFSA等分别制定了食品中叶

酸的检测标准，如我国的GB5009.211-2014食品安全国家标准食品中叶酸的测定、AOAC

的AOACOfficialMethod992.05TotalFolate(PteroylglutamicAcid)inInfantFormula

MicrobiologicalMethodsFirstAction1992FinalAction1995)、EFSA的Calcium

L-5-Methyltetrahydrofolate（L-5-MethyltetrahydrofolicAcid,CalciumSalt

L-Methyltetrahydrofolate,CalciumSaltL-Methylfolate,CalciumL-5-MTHF-Ca等。

在血液样本叶酸检测方面，目前国内外没有血液样本叶酸检测的标准，但WHO等国

际组织提出了人群叶酸营养状况评估的检测指标和检测方法。美国疾病预防控制中心在历次

NHANES调查中对血清和红细胞叶酸水平分别采用微生物检测法、同位素放射性免疫法、

和液相色谱质谱联用法（LC-MS/MS）检测。国内外也有许多人群血清、红细胞叶酸检测的

1

报道。叶酸检测有很多方法，根据方法学原理，通常为微生物法、竞争性蛋白结合法、液相

色谱质谱联用法。每种方法的优缺点见表1。

微生物方法是检测叶酸的经典方法。该方法能够检测所有鼠李糖乳杆菌能利用的叶酸，

也是叶酸检测的金标准方法。该方法具有灵敏度最高、价格低廉、设备简单等优点，但手工

操作较多，检测周期长。

竞争性蛋白结合法：同位素放射免疫法建立于1970年代，在过去的几十年中得到广泛

应用。该方法具有快速、简便等优点，但实验费用高、同时存在离子辐射等问题，现已较少

应用。化学发光法和电化学发光法，则应用了化学发光技术/电化学发光技术和竞争性免疫

结合原理，具有操作自动化程度高、重现性好、精确度高的优点，在临床中具有广泛的应用。

液相色谱质谱联用方法：可以检测不同形式叶酸的峰面积，通过标准曲线计算样本中

叶酸含量。LC-MS/MS法准确度较高，能检测不同形式的叶酸，对于分析叶酸强化食品与人

体的作用有一定意义。该方法准确度和精确度较高，但样品处理复杂，需熟练的操作人员，

并且仪器设备相对昂贵，在临床方面应用中受到限制。

在上述文献调研的基础上，本标准拟建立包括目前国际上比较公认的以上三种叶酸检测

方法的团体标准。

表1.叶酸检测方法比较表

方法原理优势缺点

灵敏性最高；

检测生物体内叶酸的手工操作多，检测周

准确度高：检测所有

经典方法，利用鼠李糖期长，需3天时间；

活性叶酸；

微生物法乳杆菌能检测单谷氨精确度相对较低；

需要本量少；

酸叶酸及其衍生物，是结果受抗生素或抗

价格低廉；

叶酸检测的金标准。叶酸物质影响。

设备简单

准确性低；

叶酸的不同形式与

采用竞争法原理，使用

灵敏度相对低；叶酸结合蛋白的吸

标记的天然叶酸结合

精确度高；附性不同；

蛋白（FBP）与样本中

竞争性蛋白结合检测时间短，27min/样本稀释后存在基

的叶酸和添加的叶酸

法样品；质效应；

（生物素标记）竞争结

有商业化试剂盒，操批不批之间存在差

合，以此判断外源叶酸

作简单异。

含量

设备相对昂贵；

试剂费用较高

等梯度流动相条件下灵敏度次之；复杂的样本提取；

分离不形式叶酸；测定准确度高：各种形式仪器设备昂贵，前期

LC-MS/MS法

得到不同形式叶酸的的代谢物；投入高

峰面积，通过标准曲线精确度高；需熟练的操作人员；

2

进行计算样本中叶酸特异性高数据解释时需考虑

含量。不同叶酸形式的内

部转换。

2.标准前期研究和本次团体标准工作汇总

本团体标准之前项目负责人主持了中国疾病预防控制中心营养与健康所营养标准体系

建设项目“人群血液叶酸检测方法”标准前期研究项目。在标准前期研究和中，对血清样品叶

酸检测的微生物检测法、竞争性蛋白结合法、液相色谱-质谱联用方法进行了方法建立。

微生物检测法：对微生物检测方法的菌种、标准品应用情况进行查阅。标准品方面：国

内外文献可见微生物检测法采用的标准品主要有5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、folicacid

（FA）[1,2]等。因FA稳定性较高，方便定标操作，标准前期研究中以FA和5-甲基四氢叶酸

为标准品检测结果无明显差别，食品安全国家标准中叶酸的检测采用FA作为标准品，因此

微生物检测法采用FA作为标准品。菌株方面：国内外文献发表的血液中叶酸的检测均采用

鼠李糖乳杆菌，最初采用ATCC7469菌种，但该菌需要将受试样本和所有试剂无菌处理。

1992年SO’Broin等将传统的微生物法进行了改良，以具有氯霉素抗性的ATCC27773

（NCIB10463）代替传统的ATCC7469菌种，该菌种的应用减少了对样品的高压灭菌。使实

验步骤进一步简化。目前基本采用具有氯霉素抗性的NCIB27773菌株进行检测[3,4,5]，本团

体标准人群血液叶酸检测也采用ATCC27773菌株。

竞争性蛋白结合法：该方法均有商业化上市试剂盒，各厂家试剂盒的标准品不尽形同，

如罗氏试剂盒的标准品溯源至WHO国际标准品NIBSC编号：03/178,该叶酸定标液的标准

物质由9.75nmol/L的5-甲基四氢叶酸（81%）、1.59nmol/L的5-甲酰四氢叶酸（13%）和

0.74nmol/L的FA（6%）组成。贝克曼试剂盒使用贝克曼自制的工作标准品，采用不同批次

试剂对标准物质检测后，检测结果与WHO国际标准物质03/178的赋值差别在10%以内。

液相色谱质谱联用方法：可以检测不同形式叶酸的峰面积，通过标准曲线计算样本中

叶酸含量。美国CDC采用液质联用方法检测NHANHS调查血清样本中的5-甲基四氢叶酸、

folicacid、5-甲酰四氢叶酸、四氢叶酸、5,10亚甲基四氢叶酸和氧化产物MeFox共6种不同

13

形式的叶酸。分别用不同上述标准品和各自相应的C5标记的内标进行检测。5-甲基四氢叶

酸是血液中叶酸最主要的存在形式，约占总量的82%-93%。目前商业化的内标有5-甲基四

氢叶酸、FA、5-甲酰四氢叶酸和5，10-亚甲基四氢叶酸、四氢叶酸五种形式。国内外发表

的液相色谱质谱联用方法检测叶酸的文献方法不统一，包括采用外标法[6]和采用1-5种内标

[[7,8,9]法的液质检测方法，参考美国疾病预防控制中心报道[10]的数据血清中5-甲酰四氢叶酸

和5,10-亚甲基四氢叶酸含量很低，大部分情况低于检测限。本团体标准液质联用的方法建

立含有5-甲基四氢叶酸和folicacid标准品和其内标的检测方法。

3

3.方法建立和验证

3.1微生物方法

3.1.1方法建立和优化

方法建立：按照美国疾病预防控制中心“RBCandSerumFolateusingMicrobiologicAssay

NHANES2009-2010”的方法建立叶酸微生物检测方法。

方法优化：该方法使用的标准品为5-甲基四氢叶酸，在标准前期研究中分别采用5-甲

基四氢叶酸和叶酸为标准品进行检测，结果显示采用两种标准品盲样的检测结果无明显差别，

具体结果见图1，表2。O’BroinS报道的使用FA，5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸三种

标准品的检测结果也无明显差别[2]。另外FA稳定性较好，方便定标操作，因此微生物检测

法采用FA作为标准品，检测前对FA进行定标，以确定FA的浓度。

A:

B:

图1.A以叶酸为标准品的拟合曲线B以5-甲基四氢叶酸为标准品的拟合曲线

按照上述标准曲线分别进行待测血清检测，两份血清检测结果分别如下：

表2以5-甲基四氢叶酸和FA为标品进行的待测血清检测结果表

4

样品5-甲基四氢叶酸为标品（ng/mL）FA为标品（ng/mL）

待测血清118.6718.52

待测血清212.1811.69

待测血清315.3015.41

3.1.2方法验证：根据团体标准中微生物检测方法步骤，进行改良微生物法线性范围、精密

度、准确度测试。

（1）线性范围：0.05-0.5ng/ml

（2）各单位检出限：0.011-0.025ng/ml。

（3）精密度：实验室质控血清样品在一张96孔板连续测定10次，计算板内变异系数

在2.47%-4.44%，均小于10%。将血清或溶血液样品在不同96孔板测定至少3次，计算得

板间变异系数在0.35%-8.78%，均小于10%。

（4）准确度：检测SRM1950，将测定值与参考值进行比较，计算测定值与参考值的绝

对误差和相对误差。相对误差（RE）=(测定值-参考值）/参考值×100%。

表3准确度检测表：

参考物质名参考值测定值绝对误差相对误差

称（nmol/L）（nmol/L）（nmol/L）（%）

SRM195030.632.11.54.9

（5）人员培训：按照建立的改良微生物方法对来自河北省、山东省等16个省级及地方

疾病预防控制中心的检测人员进行培训和现场实验操作，检测结果见下表：

表4叶酸检测培训和考核结果表

与理论值（11.0ng/ml）的

省/市结果(ng/ml)汇总

偏差（%）

110.28-6.6

212.6815.3

312.6815.3

411.938.416个检测有两个标准曲线加样

59.6-12.7失败，共得到14个结果。其中9

610.2-7.3个检测结果与靶值结果相差

7129.110%以内，5个检测结果与靶值

812.3812.5结果相差20%以内。

911.43.6

1011.43.6

119.3-15.5

5

1210.7-2.7

1311.43.6

1410.2-7.3

3.2液相色谱串联质谱方法的建立和验证

3.2.1方法建立和优化

方法建立：参考美国疾病预防控制中心发表的“Ahigh-throughputLC-MS/MSmethod

suitableforpopulationbiomonitoringmeasuresfiveserumfolatevitamersandoneoxidation

product”、“DeterminationofFolateVitamersinHumanSerumbyStable-Isotope-DilutionTandem

MassSpectrometryandComparison