双特异性抗体在肿瘤干细胞清除中的作用

双特异性抗体在肿瘤干细胞清除中的作用演讲人肿瘤干细胞：肿瘤治疗“难啃的硬骨头”01双特异性抗体靶向肿瘤干细胞的策略与靶点选择02双特异性抗体：肿瘤干细胞清除的“精准武器”03双特异性抗体在肿瘤干细胞清除中的临床进展与挑战04目录双特异性抗体在肿瘤干细胞清除中的作用作为深耕肿瘤免疫治疗领域十余年的研究者，我亲历了从传统化疗到靶向治疗，再到免疫治疗的迭代浪潮。然而，一个始终困扰临床的核心难题是：即便原发肿瘤经治疗达到影像学缓解，仍有相当一部分患者会在数月或数年后出现复发转移。近年来的研究逐渐揭示，这一现象的根源在于肿瘤干细胞（CancerStemCells,CSCs）的存在——这群具备自我更新、多向分化及耐药能力的“种子细胞”，如同潜伏在废墟中的顽敌，能在治疗后重新启动肿瘤生长。如何精准、高效地清除CSCs，成为实现肿瘤“治愈”的关键突破口。在此背景下，双特异性抗体（BispecificAntibodies,BsAbs）凭借其独特的“双靶点”识别能力，为CSCs清除带来了全新可能。本文将从CSCs的生物学特性、BsAb的作用机制、靶向策略、临床进展及未来挑战等多个维度，系统阐述BsAb在肿瘤干细胞清除中的核心价值与应用前景。01肿瘤干细胞：肿瘤治疗“难啃的硬骨头”1肿瘤干细胞的定义与核心生物学特性肿瘤干细胞并非独立于肿瘤细胞之外的“特殊细胞”，而是肿瘤组织中一小部分具备干细胞样特性的细胞亚群。其核心定义标准包括：自我更新能力（通过不对称分裂维持自身数量并产生分化后代）、多向分化潜能（可分化为肿瘤组织中的异质性细胞类型）、肿瘤起始能力（移植后能在免疫缺陷小鼠中重建与原发肿瘤相似的异质性组织）。更重要的是，CSCs是肿瘤复发、转移和耐药的“罪魁祸首”，其存在直接导致传统治疗手段的“治标不治本”。从分子机制上看，CSCs的“恶性行为”受多条信号通路精细调控：-Wnt/β-catenin通路：β-catenin的核转位激活CSCs相关基因（如OCT4、SOX2），维持自我更新；1肿瘤干细胞的定义与核心生物学特性-Notch通路：通过配体-受体相互作用调节细胞命运决定，其异常活化与乳腺癌、白血病等CSCs扩增密切相关；01-Hedgehog（Hh）通路：Gli蛋白转录因子激活促进CSCs存活与增殖；02-STAT3通路：介导肿瘤微环境（TumorMicroenvironment,TME）中的炎症信号，增强CSCs的耐药性。03此外，CSCs表面高表达特异性标志物（如CD44、CD133、EpCAM、ALDH1等），这些标志物不仅是CSCs分选的“标签”，也是潜在的治疗靶点。042肿瘤干细胞对传统治疗的抵抗机制传统化疗、放疗及靶向治疗的根本缺陷在于其“杀灭快速增殖细胞”的设计逻辑，而CSCs多处于细胞周期静息期（G0期），且高表达药物外排泵（如ABC转运蛋白）、增强DNA修复能力，并激活抗凋亡通路（如Bcl-2家族），导致其对治疗高度抵抗。以化疗为例，研究显示乳腺癌CSCs中ALDH1活性是普通肿瘤细胞的5-10倍，其代谢产生的视黄酸可通过上调ABCG2蛋白将化疗药物（如多柔比星）泵出细胞外，使细胞内药物浓度降至有效水平以下。放疗方面，CSCs通过激活DNA损伤修复通路（如ATM/Chk2）和上调抗氧化物质（如谷胱甘肽）清除辐射诱导的活性氧（ROS），从而逃脱辐射杀伤。更棘手的是，CSCs能通过“可塑性”（Plasticity）在治疗压力下发生表型转换——非干细胞样肿瘤细胞可逆分化为CSCs，进一步补充CSCs库。这种“动态平衡”使得单一靶点治疗难以彻底清除CSCs，成为肿瘤复发的“种子库”。3清除肿瘤干细胞的临床意义基于CSCs在肿瘤进展中的核心地位，清除CSCs已成为肿瘤治疗的“终极目标”之一。临床前研究证实，若能通过治疗手段将CSCs比例降至0.01%以下，肿瘤复发风险可降低90%以上；反之，即使原发肿瘤细胞被杀灭99.9%，残留的CSCs仍能在3-6个月内重建肿瘤组织。以结直肠癌为例，CD133+CSCs术后1年复发率高达60%，而CD133-细胞复发率不足10%；在急性髓系白血病（AML）中，白血病干细胞（LSCs，即CSCs亚群）残留是患者化疗后复发的独立预测因子，其数量与患者总生存期（OS）呈负相关。因此，开发能特异性靶向并清除CSCs的治疗策略，对延长患者无进展生存期（PFS）、改善预后具有不可替代的临床价值。02双特异性抗体：肿瘤干细胞清除的“精准武器”1双特异性抗体的结构特点与作用优势双特异性抗体是通过基因工程技术将两种不同抗体的抗原结合片段（如Fab、scFv）拼接而成的“多功能”抗体，可同时识别两个不同靶点。与单克隆抗体（mAb）相比，其核心优势在于“双靶点协同效应”：12-桥接效应激活免疫杀伤：作为“分子桥梁”，BsAb可将效应细胞（如T细胞、NK细胞）与CSCs紧密连接，激活免疫细胞对CSCs的定向杀伤，这一机制对处于静息期的CSCs同样有效；3-双靶点识别增强特异性：通过同时结合CSCs表面标志物（如CD133）和免疫细胞激活分子（如CD3），BsAb可避免单靶点治疗因“脱靶效应”或“靶点异质性”导致的疗效下降；1双特异性抗体的结构特点与作用优势-克服肿瘤微环境免疫抑制：部分BsAb可靶向免疫检查点（如PD-1/PD-L1）和CSCs相关靶点，逆转TME中CSCs诱导的T细胞耗竭，重塑抗肿瘤免疫微环境；01目前，BsAb的已形成多种成熟技术平台，如“双抗体”（Diabody）、“串联scFv”（taFv）、“IgG-scFv”融合蛋白及“Knob-into-hole”结构等，可根据治疗需求灵活设计双靶点组合。03-多功能协同增强疗效：部分BsAb可同时靶向CSCs表面标志物和微环境因子（如VEGF），在清除CSCs的同时抑制其周围血管生成，切断CSCs的营养供应。022双特异性抗体靶向肿瘤干细胞的作用机制BsAb清除CSCs的核心机制可概括为“靶向-桥接-激活-清除”四步，具体可分为以下三类：2.2.1免疫细胞介导的CSCs杀伤（T细胞/NK细胞衔接型）此类BsAb的一臂识别CSCs表面特异性抗原（如CD44、EpCAM），另一臂结合免疫细胞表面的激活分子（如CD3、CD16）。通过“桥接”效应，免疫细胞表面的TCR（T细胞受体）或CD16（FcγRIII）被激活，释放穿孔素/颗粒酶、IFN-γ等效应分子，直接杀伤CSCs。以CD44×CD3BsAb为例，CD44是多种肿瘤（如乳腺癌、胶质瘤）CSCs的高表达标志物，其胞外结构域具有高度特异性。当BsAb同时结合CD44+CSCs和CD3+T细胞时，T细胞可被“重定向”至CSCs周围，无需MHC限制即可激活杀伤。临床前研究显示，该BsAb对胶质瘤CSCs的杀伤效率是普通T细胞的8倍，且可显著抑制小鼠模型中肿瘤的复发。2双特异性抗体靶向肿瘤干细胞的作用机制2.2阻断CSCs自我更新与存活信号通路部分BsAb可同时靶向CSCs表面标志物和其下游信号通路分子，通过“双重阻断”抑制CSCs的自我更新。例如，CD133×WntBsAb的一臂结合CD133（结直肠癌CSCs标志物），另一臂结合Wnt通路的共受体LRP5/6，阻断Wnt蛋白与受体的结合，从而抑制β-catenin的核转位，下调SOX2、NANOG等干细胞基因表达。研究显示，该BsAb可使结直肠癌CSCs的比例从5.2%降至0.8%，且可逆转其化疗耐药性。2双特异性抗体靶向肿瘤干细胞的作用机制2.3调节肿瘤微环境增强CSCs清除CSCs的生存高度依赖于TME的支持，如血管生成、免疫抑制、基质细胞旁分泌等。BsAb可通过靶向CSCs与微环境的“交互节点”，破坏其生存“土壤”。例如，CXCR4×VEGFBsAb中，CXCR4是CSCs趋化因子受体，介导其向骨髓、肝肺等转移器官归巢；VEGF是血管内皮生长因子，促进肿瘤血管生成。通过同时阻断CXCR4和VEGF，BsAb可抑制CSCs的转移潜能，并切断其营养供应，增强化疗药物对CSCs的渗透杀伤。03双特异性抗体靶向肿瘤干细胞的策略与靶点选择1基于CSCs表面标志物的靶向策略CSCs表面标志物是BsAb靶向的“第一选择”，其优势在于特异性高、表达相对稳定，且可直接介导免疫细胞对CSCs的识别与杀伤。目前已进入临床研究的CSCs表面标志物及其对应的BsAb策略如下：1基于CSCs表面标志物的靶向策略1.1CD44家族CD44是广泛表达于乳腺癌、胃癌、胰腺癌等CSCs表面的黏附分子，其变体CD44v6（exonv6编码的变异体）与CSCs的迁移、侵袭及耐药密切相关。-CD44v6×CD3BsAb（EMB01）：由德国EMDSerono公司开发，I期临床数据显示，对CD44v6+晚期实体瘤患者的疾病控制率（DCR）达45%，且可显著降低外周血中CD44v6+CTCs（循环肿瘤细胞）数量。-CD44×CD16BsAb（AFM13）：靶向CD44与NK细胞激活受体CD16，通过NK细胞介导的ADCC（抗体依赖细胞介导的细胞毒性）杀伤CSCs。在霍奇金淋巴瘤模型中，其可完全清除CD44+LSCs，预防复发。1基于CSCs表面标志物的靶向策略1.2CD133（Prominin-1）CD133是脑胶质瘤、结直肠癌、肝癌等CSCs的经典标志物，其阳性细胞具有更强的肿瘤起始能力。-CD133×CD3BsAb（CCT400939）：由阿斯利康开发，临床前研究显示，其对CD133+胶质瘤CSCs的半数抑制浓度（IC50）为0.1ng/mL，比普通T细胞杀伤效率高10倍。目前I期临床正在纳入复发胶质瘤患者，初步结果显示中位PFS延长至6.2个月（历史对照3.1个月）。-CD133×CD123BsAb：CD123是白细胞抗原，高表达于白血病干细胞（LSCs）和部分实体瘤CSCs。该BsAb通过同时靶向CD133+CSCs和CD123+LSCs，实现“双靶点清除”，在AML小鼠模型中可完全清除骨髓中的LSCs。1基于CSCs表面标志物的靶向策略1.3EpCAM（上皮细胞黏附分子）EpCAM在乳腺癌、卵巢癌、肺癌等上皮来源肿瘤的CSCs中高表达，其可通过激活Wnt通路促进CSCs的自我更新。-EpCAM×CD3BsAb（Catumaxomab）：虽然该药因生产问题已退市，但其“三功能”设计（抗EpCAM、抗CD3、Fc段激活巨噬细胞）为后续BsAb提供了重要参考。后续开发的EpCAM×CD16BsAb（MT110）在卵巢癌临床前研究中可降低80%的EpCAM+CSCs，并延长小鼠生存期。2基于CSCs信号通路的靶向策略除表面标志物外，CSCs的“核心生存通路”也是BsAb的重要靶点。通过同时阻断通路中的关键分子，可从根本上抑制CSCs的自我更新与存活。3.2.1Wnt/β-catenin通路Wnt通路是维持CSCs干性的核心通路，β-catenin是其下游关键效应分子。-Wnt×NotchBsAb：通过同时阻断Wnt配体（如Wnt3a）和Notch配体（如Jagged1），可协同抑制β-catenin和Hes1（Notch下游靶基因）的表达，阻断CSCs的自我更新循环。在胰腺癌模型中，该BsAb可使CSCs比例从7.3%降至1.2%，且可抑制肿瘤的“去分化”过程。2基于CSCs信号通路的靶向策略2.2Hedgehog通路Hh通路在脑胶质瘤、基底细胞癌等CSCs中高度激活，Gli1是其下游转录因子。-Gli1×PD-1BsAb：Gli1是CSCs特异性的转录因子，PD-1是T细胞检查点。该BsAb一方面通过Gli1靶向CSCs，另一方面阻断PD-1/PD-L1，激活T细胞对CSCs的杀伤。在黑色素瘤模型中，其可完全清除Gli1+CSCs，且比单一抗PD-1治疗疗效提高3倍。3基于肿瘤微环境的靶向策略CSCs的生存离不开TME的支持，包括免疫抑制细胞（如Tregs、MDSCs）、血管生成因子、基质细胞等。BsAb可通过靶向CSCs与微环境的“交互节点”，打破其生存“保护罩”。3基于肿瘤微环境的靶向策略3.1靶向CSCs与免疫抑制细胞的交互Tregs可通过分泌IL-10、TGF-β抑制T细胞活性，而CSCs可招募Tregs至肿瘤微环境。-CD44×CTLA-4BsAb：CTLA-4是Tregs表面的抑制性分子，通过同时靶向CD44+CSCs和CTLA-4+Tregs，可减少Tregs对T细胞的抑制，增强CSCs清除。在乳腺癌模型中，该BsAb可使Tregs比例从15%降至5%，且CD8+T细胞比例提高2倍。3基于肿瘤微环境的靶向策略3.2靶向CSCs与血管生成CSCs可分泌VEGF等因子促进血管生成，而血管内皮细胞又可通过旁分泌维持CSCs的干性。-VEGF×CD133BsAb：通过同时阻断VEGF和CD133，可抑制血管生成并直接杀伤CSCs。在肝癌模型中，其可减少肿瘤微血管密度（MVD）达60%，且CSCs比例降低70%，联合索拉非尼后中位生存期延长至8个月（单药索拉非尼4个月）。04双特异性抗体在肿瘤干细胞清除中的临床进展与挑战1临床前研究的重要突破近年来，BsAb清除CSCs的临床前研究取得了显著进展，多个候选分子在动物模型中显示出“根除CSCs”的潜力。-乳腺癌领域：CD44v6×HER2BsAb（MM-111）在HER2+乳腺癌模型中，可选择性杀伤CD44v6+HER2+CSCs，其疗效比曲妥珠单抗高5倍，且可预防肿瘤复发。-胶质瘤领域：EGFRvIII×CD3BsAb（AMG596）可靶向表达EGFRvIII的胶质瘤CSCs，临床前研究显示其可延长胶质瘤小鼠生存期至120天（对照组40天），且可清除颅内潜伏的CSCs。-白血病领域：CD123×CD3BsAb（JNJ-63709178）在AML模型中，可完全清除骨髓中的CD123+LSCs，且对正常造血干细胞毒性较低，目前已进入I/II期临床。2临床研究的初步成果与局限性尽管临床前数据令人鼓舞，BsAb清除CSCs的临床研究仍处于早期阶段，已有初步成果也面临着诸多挑战。2临床研究的初步成果与局限性2.1已进入临床的BsAb及其疗效-Catumaxomab（EpCAM×CD3）：虽已退市，但其治疗恶性腹水的III期临床显示，EpCAM+CTCs清除率达68%，提示其对CSCs的潜在疗效。-AFM13（CD30×CD16）：在霍奇金淋巴瘤中，CD30+LSCs是其复发的根源。I期临床显示，AFM13可使患者外周血中CD30+CTCs数量降低90%，且2年无进展生存率达75%。-EMB01（CD44v6×CD3）：在晚期实体瘤患者中，其可显著降低CD44v6+CTCs水平，且部分患者影像学显示肿瘤“坏死样改变”，提示CSCs被清除。2临床研究的初步成果与局限性2.2临床研究面临的主要挑战-靶点异质性：CSCs表面标志物在不同患者、同一肿瘤不同部位的表达存在显著差异，导致BsAb靶向效率下降。例如，CD133在肝癌中的表达率为30%-70%，部分患者可能因靶点缺失而耐药。-肿瘤微环境的物理屏障：CSCs常位于肿瘤核心区域或“缺氧niches”，BsAb难以渗透。例如，胶质瘤CSCs位于血脑屏障（BBB）内侧，普通BsAb难以进入，需通过“开窗疗法”（如超声开放BBB）辅助递送。-免疫逃逸机制：CSCs可通过上调PD-L1、分泌TGF-β等因子抑制免疫细胞活性，导致BsAb介导的杀伤效率下降。例如，胰腺癌CSCs高表达PD-L1，可诱导T细胞耗竭，使CD133×CD3BsAb疗效降低50%。-生产成本与质量控制：BsAb结构复杂，生产难度大，成本是普通mAb的3-5倍，且易形成抗体聚集，影响安全性。3未来优化方向与联合治疗策略针对上述挑战，未来BsAb的研发需在靶点选择、结构设计、联合治疗等方面进行优化：3未来优化方向与联合治疗策略3.1靶点优化：从“单一标志物”到“多标志物组合”为克服靶点异质性，可开发“双CSCs标志物靶向BsAb”（如CD133×CD44BsAb），同时识别两种标志物，提高CSCs覆盖率。例如，CD133×CD44BsAb在结直肠癌模型中可覆盖90%以上的CSCs，而单一靶点BsAb仅覆盖50%-70%。3未来优化方向与联合治疗策略3.2结构优化：增强渗透性与稳定性通过“小型化”设计（如scFv替代IgG）或“智能响应”设计（如pH敏感型BsAb），可增强BsAb对肿瘤组织的渗透性。例如，pH敏感型CD44×CD3BsAb在酸性TME（pH6.5）中构象改变，可激活T细胞杀伤；而在正常组织（pH7.4）中保持沉默，降低脱毒副作用。3未来优化方向与联合治疗策略3.3联合治疗策略：协同清除CSCsBsAb与其他治疗手段的联合是克服耐药的关键：-BsAb+化疗：化疗可杀灭普通肿瘤细胞，释放肿瘤抗原，增强BsAb介导的免疫应答。例如，吉西他滨联合CD