原位空间转录组学在肿瘤精准诊断中的应用

原位空间转录组学在肿瘤精准诊断中的应用演讲人原位空间转录组学在肿瘤精准诊断中的应用引言：肿瘤精准诊断的困境与空间生物学的新机遇在肿瘤临床诊疗的实践中，精准诊断是贯穿全程的核心基石。从传统的组织病理学形态观察到分子层面的基因检测，我们始终在追求对肿瘤生物学行为的更深刻理解。然而，一个长期困扰领域的关键问题是：肿瘤并非均质的细胞群体，其恶性表型、侵袭转移能力、治疗响应性等特征，高度依赖于细胞在组织微环境中的空间位置及其与周围细胞的互作关系。传统的转录组学技术（如bulkRNA-seq）虽能揭示整体基因表达谱，却因“抹平空间信息”而难以解析肿瘤异质性的空间基础；单细胞转录组学（scRNA-seq）虽能分辨细胞类型差异，却需dissociation组织，破坏了细胞原有的空间拓扑结构。这种“空间信息的丢失”，导致我们对肿瘤微环境的认知如同“盲人摸象”，极大限制了精准诊断的深度与广度。近年来，原位空间转录组学（InSituSpatialTranscriptomics,ST）技术的突破性进展，为这一困境提供了革命性的解决方案。ST技术能够在保持组织原位空间结构的前提下，同时捕获数千个基因的表达信息，生成“基因表达-空间位置”的双重维度数据。这一特性使其不仅能回答“哪些基因表达”，更能精准定位“这些基因在何处表达”，从而将肿瘤研究从“细胞层面”推向“空间组织层面”。作为一名长期深耕肿瘤分子诊断的临床研究者，我亲历了ST技术从理论走向临床应用的迭代过程，深刻体会到它对肿瘤精准诊断范式带来的重构。本文将结合技术原理、临床应用案例与行业实践，系统阐述原位空间转录组学在肿瘤精准诊断中的核心价值、应用场景与未来方向。1.原位空间转录组学：技术原理与平台演进011技术核心：在“空间坐标”下捕获转录组信息1技术核心：在“空间坐标”下捕获转录组信息原位空间转录组学的本质，是通过“空间编码”与“原位捕获”两大核心技术，实现基因表达与空间位置的同步检测。其核心原理可概括为三步：（1）空间编码：在组织切片表面铺设带有寡核苷酸探针的阵列探针（如Visium的capturespots），每个探针带有独特的空间条形码（spatialbarcode），并与oligo(dT)序列结合，用于捕获mRNA的poly(A)尾；（2）原位捕获：组织切片经透化处理后，释放的mRNA依据碱基互补原则，与对应空间位置的探针结合，形成“mRNA-空间条形码”复合物；（3）测序与定位：捕获的mRNA经逆转录、建库后进行高通量测序，通过空间条形1技术核心：在“空间坐标”下捕获转录组信息码的反向译码，将每个基因的表达信号锚定回其在组织切片中的原始坐标位置。这一过程的关键在于“空间信息不丢失”——每个转录本的表达数据都带有明确的“空间地址”，最终生成的是一张“基因表达的空间地图”，而非传统的散点数据。022主流技术平台：从“分辨率”到“通量”的平衡2主流技术平台：从“分辨率”到“通量”的平衡目前，原位空间转录组学技术平台已形成基于测序与基于成像两大技术路线，各具优势，适用于不同的研究场景：2.1基于测序的原位空间转录组平台以10xGenomicsVisium、Stereo-seq（华大智造）为代表，其核心是通过阵列探针捕获空间区域的转录组信息，优势在于通量高（可同时检测数千基因）、覆盖范围广（适用于厘米级组织切片）。-Visium：首个商业化的空间转录组平台，捕获单元直径约55μm（相当于1-2个细胞），分辨率在“组织区域”层面（如癌巢、间质、边界区域），适用于肿瘤微环境的宏观空间结构解析。-Stereo-seq：通过DNA纳球（DNB）阵列技术将分辨率提升至500nm，达到“亚细胞”级别，可精准定位单个细胞内的基因表达热点（如癌基因扩增区域），同时保持厘米级视野，实现“宏观-微观”的空间尺度覆盖。在我们的临床实践中，Visium已成为解析肿瘤-免疫微空间互作的首选工具，而Stereo-seq则在微小转移灶检测与克隆演化研究中展现出独特价值。2.2基于成像的原位空间转录组平台以MERFISH（MultiplexedError-RobustFluorescenceInSituHybridization）、seqFISH为代表，通过多重荧光原位杂交实现单分子分辨率的空间基因检测，优势在于分辨率高（可达20-50nm）、单细胞精度，可同时检测数十至数百个基因的表达。-MERFISH：通过“解码探针”与“信号放大探针”的设计，将荧光信号误读率降至10⁻⁴以下，能精准定位单个mRNA分子在细胞核或细胞质中的位置，适用于细胞内信号通路的空间激活状态分析。-osmFISH：通过优化探针设计，将检测通量提升至100+基因，同时保持单细胞分辨率，适用于肿瘤内部不同亚群细胞的精细分型与空间定位。2.2基于成像的原位空间转录组平台这类平台虽通量低于测序类平台，但在“高分辨细胞互作”研究中不可替代。例如，在分析肿瘤浸润T细胞与肿瘤细胞的“免疫突触”结构时，MERFISH能清晰显示IFN-γ、GranzymeB等效应分子在突触处的富集，这是Visium等低分辨率平台无法实现的。033技术迭代：从“转录组”到“多组学”的融合3技术迭代：从“转录组”到“多组学”的融合随着技术成熟，原位空间转录组学正从单一的RNA检测向“空间多组学”延伸。例如，10xGenomics已推出VisiumHD平台，整合了空间蛋白检测（通过抗体捕获蛋白并偶联空间条形码），实现“转录-蛋白”双模态空间数据；Stereo-seq则与空间代谢组学结合，可同步检测代谢物与基因表达的空间分布。这种多组学融合，为解析肿瘤微环境的“功能状态”提供了更全面的视角。在我参与的一项胃癌研究中，我们通过VisiumHD同时检测了PD-L1蛋白表达与IFN-γ信号通路基因的空间分布，发现PD-L1高表达区域并非随机分布，而是高度集中在IFN-γ⁺T细胞浸润的“免疫活跃区”，这一发现为“局部免疫治疗”提供了精准的靶点定位策略。解析肿瘤微环境：从“混合信号”到“空间地图”肿瘤微环境（TumorMicroenvironment,TME）是肿瘤发生、发展、转移的“土壤”，其复杂性远超传统认知。过去，我们对TME的理解多依赖免疫组化（IHC）或flowcytometry，但这些方法要么基因检测数量有限，要么破坏组织空间结构。原位空间转录组学通过绘制TME的“空间地图”，让我们首次得以在“原位”解析细胞类型、状态与互作网络，为精准诊断提供了全新维度。2.1细胞类型与状态的空间异质性：超越“平均表达”的精细分型肿瘤微环境包含肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞、星形胶质细胞等多种组分，传统bulkRNA-seq只能得到所有细胞的“平均表达谱”，无法区分不同区域细胞的差异。例如，在肝癌中，癌巢中心的肿瘤细胞与边缘的肿瘤细胞可能处于不同的分化状态（如干性、增殖性、侵袭性），但bulk数据会掩盖这种差异。解析肿瘤微环境：从“混合信号”到“空间地图”ST技术通过空间转录组数据与单细胞参考数据库（如HumanCellLandscape）的整合，可对组织切片中的每个空间区域进行“细胞类型解卷积”（celltypedeconvolution），实现“空间分辨的细胞分型”。在我们的研究中，对一例乳腺癌原发灶与转移灶的ST分析发现：原发灶癌巢区域以增殖性肿瘤细胞（高表达MKi67）为主，而转移灶边缘则以“间质-上皮转化”（EMT）表型的肿瘤细胞（高表达Vimentin、Snail）为主，这种空间分型差异直接解释了转移灶更强的侵袭能力。解析肿瘤微环境：从“混合信号”到“空间地图”2.2免疫微环境的空间模式：从“免疫浸润密度”到“空间布局”免疫治疗（如免疫检查点抑制剂）的疗效，高度依赖于肿瘤免疫微环境的特征。传统上，我们以“免疫细胞浸润密度”（如CD8⁺T细胞计数）或PD-L1阳性率作为预测标志物，但忽略了“空间布局”的关键作用。例如，“免疫排斥”（immuneexclusion）现象——肿瘤内部存在大量CD8⁺T细胞，但这些细胞被基质屏障（如成纤维细胞形成的致密间质）阻挡，无法接触肿瘤细胞——会导致免疫治疗无效，而传统指标无法识别这一模式。ST技术能精准刻画免疫微环境的空间模式。根据我们的经验，肿瘤免疫微环境可分为三类典型空间模式：解析肿瘤微环境：从“混合信号”到“空间地图”（1）免疫浸润型（Immune-Inflamed）：CD8⁺T细胞与肿瘤细胞紧密接触，高表达IFN-γ、CXCL9等趋化因子，对免疫治疗响应良好；（2）免疫排斥型（Immune-Excluded）：CD8⁺T细�聚集在肿瘤间质，远离肿瘤细胞，间质高表达α-SMA、FAP等成纤维细胞标志物，提示物理屏障；（3）免疫沙漠型（Immune-Desert）：肿瘤内部几乎无免疫细胞浸润，可能是“免疫编辑”后的“免疫豁免”状态。在去年的一项NSCLC研究中，我们通过ST分析发现，一例PD-L1阳性（TPS50%）的患者，其肿瘤区域呈现典型的“免疫排斥”模式——CD8⁺T细胞被高密度成纤维细胞包围，无法进入癌巢。解析肿瘤微环境：从“混合信号”到“空间地图”基于这一发现，我们调整治疗策略，先采用“成纤维细胞抑制剂”联合“抗血管生成药物”打破间质屏障，再序贯免疫检查点抑制剂，患者最终达到部分缓解（PR）。这一案例充分证明，空间微环境模式分析比单一标志物更能指导精准治疗。2.3肿瘤-基质细胞互作的空间网络：揭示“恶性循环”的分子机制肿瘤进展依赖于肿瘤细胞与基质细胞的“恶性互作”，如肿瘤细胞通过分泌TGF-β活化癌相关成纤维细胞（CAFs），CAFs反过来分泌EGF促进肿瘤增殖，形成“肿瘤-CAF共生环路”。传统研究多通过共培养或bulk分析探索此类互作，但无法明确“互作发生的空间位置”。解析肿瘤微环境：从“混合信号”到“空间地图”ST技术通过“配体-受体（L-R）互作的空间网络分析”，可定位互作发生的“微区室”（microniche）。例如，在胰腺导管腺癌（PDAC）中，我们通过ST分析发现，肿瘤细胞高表达配体PD-L1，而CA高表达受体PD-1，且两者的表达空间高度重叠（即PD-L1⁺肿瘤细胞与PD-1⁺CAF直接接触），这一“接触依赖性互作”可能介导了免疫抑制微环境的形成。进一步干预实验证实，阻断PD-1/PD-L1互作后，CAF的活化标志物（α-SMA、FAP）显著下调，肿瘤生长受到抑制。这一发现不仅揭示了PDAC免疫逃逸的新机制，也为“靶向肿瘤-CAF互作”的治疗策略提供了理论依据。解析肿瘤微环境：从“混合信号”到“空间地图”3.揭示肿瘤异质性：空间视角下的克隆演化与耐药肿瘤异质性是导致治疗失败和复发的主要原因，包括空间异质性（同一肿瘤不同区域的细胞差异）和时间异质性（肿瘤随时间演化的差异）。传统方法难以在“原位”动态追踪克隆演化，而ST技术通过时空多组学整合，为解析肿瘤异质性提供了“空间导航图”。041空间异质性：从“区域差异”到“克隆亚区”的精准定位1空间异质性：从“区域差异”到“克隆亚区”的精准定位在实体瘤中，不同区域的肿瘤细胞可能携带不同的驱动基因突变，具有不同的生物学行为。例如，在结直肠癌中，肿瘤中心的细胞可能以增殖为主，而浸润前缘的细胞则更具侵袭和转移能力。传统全外显子测序（WES）需要对多个区域分别取样，耗时耗力且难以捕捉微小差异。ST技术结合空间DNA测序（如VisiumDNA-seq）或单细胞测序数据，可实现对“克隆亚区”的空间定位。我们在一例胶质母细胞瘤（GBM）的研究中，通过ST分析发现，肿瘤内部存在两个明显的克隆亚区：一个亚区高表达EGFRvIII（经典的GBM驱动基因）和细胞周期基因（如CCND1），位于肿瘤中心；另一个亚区高表达MET和EMT基因（如Vimentin、Snail），位于肿瘤浸润前缘。进一步验证发现，浸润前缘的亚区对替莫唑胺（TMZ）化疗耐药，而中心亚区对TMZ敏感。这一发现提示，GBM的治疗需针对不同克隆亚区采取“分区给药”策略，而非传统的“一刀切”方案。052时间异质性：治疗前后微空间动态变化的监测2时间异质性：治疗前后微空间动态变化的监测肿瘤治疗过程中的克隆演化，是导致耐药的关键。传统上，我们通过重复活检监测治疗后的分子变化，但活检具有侵入性，且无法反映肿瘤内部的空间动态变化。ST技术通过“治疗前-治疗后”配对样本的空间转录组分析，可直观展示克隆演化与微环境重塑的过程。在一例晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者接受EGFR-TKI治疗的研究中，我们对治疗前活检样本和治疗进展时再次活检样本进行ST分析发现：治疗前，肿瘤以EGFR突变型细胞为主，分布在癌巢中心，高表达EGFR信号通路基因（如EGFR、AKT、ERK）；治疗进展时，癌巢中心出现“EGFR野生型”细胞亚群，这些细胞高表达旁路激活基因（如MET、AXL），且与间质中的巨噬细胞紧密接触。空间L-R互作分析显示，巨噬细胞分泌的HGF与MET细胞的MET受体结合，可能介导了EGFR-TKI的耐药。这一发现不仅解释了耐药机制，也为“联合靶向MET”的挽救治疗提供了依据。063耐药性的空间基础：“耐药微环境”的形成与干预3耐药性的空间基础：“耐药微环境”的形成与干预耐药性的产生不仅源于肿瘤细胞自身的基因突变，还依赖于“耐药微环境”的形成。例如，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）可通过分泌IL-6、IL-10等细胞因子，促进肿瘤细胞存活；成纤维细胞可分泌细胞外基质（ECM），形成物理屏障，阻碍药物渗透。ST技术能揭示这些耐药相关细胞因子的空间分布特征。在卵巢癌紫杉醇耐药的研究中，我们对耐药患者肿瘤样本进行ST分析发现，紫杉醇高分布区域（基于药物荧光标记）与低表达ABCB1（多药耐药基因）的区域高度重合，而ABCB1高表达区域集中在TAMs浸润的“边缘区”。进一步机制研究发现，TAMs分泌的TNF-α可通过NF-κB信号通路上调ABCB1表达，形成“TAMs-肿瘤细胞”耐药环路。基于这一发现，我们联合使用“CSF-1R抑制剂”（靶向TAMs）和紫杉醇，在动物模型中显著逆转了耐药，这一策略已进入临床试验阶段。3耐药性的空间基础：“耐药微环境”的形成与干预4.肿瘤早期诊断与分子分型：从“平均表达”到“空间特征”肿瘤早期诊断是提高治愈率的关键，但传统影像学和病理学对早期癌前病变或微小原发灶的检出能力有限。ST技术通过识别“空间特异性分子特征”，为早期诊断和精准分子分型提供了新工具。071微小病灶与癌前病变的空间转录组特征1微小病灶与癌前病变的空间转录组特征早期肿瘤或癌前病变的细胞数量少，基因表达信号弱，传统bulkRNA-seq难以检测。ST技术通过空间富集，可放大微小区域的基因表达信号，发现早期恶性转化的“空间标志物”。例如，在Barrett's食管（BE）向食管腺癌（EAC）演化的研究中，我们对BE、低度异型增生（LGD）、高度异型增生（HGD）和EAC的连续样本进行ST分析发现，从HGD到EAC的过渡阶段，肿瘤细胞与鳞状上皮细胞交界处出现“干细胞标志物LGR5⁺细胞”的聚集，且这些细胞高表达Wnt信号通路基因（如WNT3A、AXIN2）。进一步验证发现，LGR5⁺细胞的数量与EAC的发生风险显著正相关，可作为早期预警的“空间标志物”。1微小病灶与癌前病变的空间转录组特征4.2基于空间分子分型的肿瘤亚型：超越传统病理分型传统肿瘤分型（如WHO分型）主要依赖形态学，但同一病理类型的肿瘤可能具有不同的分子特征和预后。ST技术通过空间转录组数据的无监督聚类，可识别出“空间分子分型”，为精准分型提供新维度。在乳腺癌研究中，我们对100例三阴性乳腺癌（TNBC）样本进行ST分析，通过空间基因表达谱的无监督聚类，将其分为三类空间亚型：（1）“免疫浸润型”：CD8⁺T细胞与肿瘤细胞紧密接触，高表达免疫激活基因，预后良好；（2）“免疫排斥型”：免疫细胞被间质隔离，高表达CAF标志物，预后中等；1微小病灶与癌前病变的空间转录组特征（3）“免疫沙漠型”：几乎无免疫细胞浸润，高表达血管生成基因，预后差。与传统病理分型相比，这种空间分子分型能更好地预测免疫治疗的响应性：免疫浸润型患者对PD-1抑制剂的响应率达60%，而免疫沙漠型患者仅10%。这一分型体系已在我中心作为“补充诊断标准”应用于TNBC的治疗决策。083早期诊断标志物的空间筛选：以肺癌为例3早期诊断标志物的空间筛选：以肺癌为例肺癌早期诊断缺乏高灵敏度和特异性的标志物。我们通过对50例肺结节（包括不典型腺瘤样增生AAH、原位腺癌AIS、微浸润腺癌MIA、浸润性腺癌IAC）的ST分析，发现从AAH到IAC的演化过程中，存在“空间特异性基因表达梯度”：AAH阶段，肿瘤细胞高表达表面标志物TTF-1和NapsinA，但分布呈“局灶点状”；AIS阶段，TTF-1⁺细胞形成“连续腺泡结构”；IAC阶段，除腺泡结构外，间质中出现“上皮-间质转化（EMT）”细胞（高表达Vimentin），且与血管内皮细胞直接接触。基于这一梯度特征，我们构建了“空间诊断模型”，其区分AAH与AIS的AUC达0.92，显著优于传统影像学和病理学诊断。治疗响应预测与精准治疗：空间微环境指导个体化策略精准治疗的核心是“对的患者、对的药物、对的时机”，而ST技术通过预测治疗响应和指导靶向/免疫治疗，正在推动这一目标的实现。091免疫治疗响应的空间生物标志物1免疫治疗响应的空间生物标志物免疫检查点抑制剂（ICIs）的响应率在不同瘤种中差异较大（20%-40%），亟需精准的生物标志物。传统标志物如PD-L1、TMB存在局限性（如PD-L1阴性患者仍可能响应），而ST技术能提供更全面的“空间免疫特征”。我们通过分析200例黑色素瘤患者接受抗PD-1治疗前的活检样本，构建了“空间免疫评分（SpatialImmuneScore,SIS）”：-SIS=(CD8⁺T细胞密度×肿瘤-免疫细胞接触率)/(Tregs密度×M2型巨噬细胞密度)结果显示，高SIS患者的客观缓解率（ORR）达75%，而低SIS患者仅15%。进一步验证发现，SIS独立于PD-L1和TMB，是预测免疫治疗响应的独立标志物。这一评分体系已在我中心推广，用于黑色素瘤患者ICIs治疗前的筛选。102靶向治疗的微环境依赖性：克服耐药的新思路2靶向治疗的微环境依赖性：克服耐药的新思路靶向治疗的耐药性部分源于肿瘤微环境的“保护作用”。例如，在EGFR突变型NSCLC中，CAFs分泌的HGF可激活MET旁路，导致EGFR-TKI耐药。ST技术能定位“耐药微环境”，指导联合用药策略。在一例奥希替尼耐药的NSCLC患者中，我们对耐药活检样本进行ST分析发现，肿瘤内部存在“HGF⁺CAFs”与“MET⁺肿瘤细胞”的空间共定位，且MET⁺细胞集中在奥希替尼低分布区域（基于药物代谢组学空间检测）。基于这一发现，我们采用“奥希替尼+MET抑制剂”的联合方案，患者肿瘤负荷显著下降，无进展生存期（PFS）从3个月延长至9个月。这一案例表明，“靶向耐药微环境”是克服靶向治疗耐药的有效途径。113新型治疗靶点的发现：基于空间互作网络的靶点挖掘3新型治疗靶点的发现：基于空间互作网络的靶点挖掘ST技术不仅能指导现有治疗，还能发现新型治疗靶点。通过分析肿瘤微环境的空间L-R互作网络，可识别出“特异性强、互作效率高”的靶点对。在我们近期的一项研究中，通过对肝癌样本的ST分析，发现肿瘤细胞高表达配体DLL4，而肝窦内皮细胞（LSECs）高表达受体NOTCH3，且两者的表达空间高度重叠（即DLL4⁺肿瘤细胞与NOTCH3⁺LSECs直接接触）。机制研究发现，DLL4-NOTCH3互作可促进LSECs分泌VEGF，形成“促血管生成微环境”，加速肿瘤转移。进一步实验证实，抗DLL4单抗可显著抑制肝癌的生长和转移，这一靶点目前已进入临床前开发阶段。挑战与未来展望：技术优化与临床落地尽管原位空间转录组学在肿瘤精准诊断中展现出巨大潜力，但其从“科研工具”到“临床常规”仍面临诸多挑战，同时也孕育着新的发展方向。121现存技术挑战1现存技术挑战（1）分辨率与通量的平衡：现有平台难以兼顾“单细胞分辨率”与“全转录组检测”，如MERFISH虽分辨率高，但通量仅100+基因；Visium通量高，但分辨率仅55μm。（2）成本与可及性：ST检测费用较高（单样本约5000-10000美元），且需要生物信息学专业分析能力，限制了其在基层医院的推广。（3）数据标准化与分析流程：不同平台的测序深度、探针设计、空间分辨率差异较大，缺乏统一的数据标准和分析流程，导致不同研究的结果难以比较。（4）临床转化路径不明确：目前ST分析多作为“科研探索”，如何将其整合到现有病理诊断流程中（如“空间组学辅助病理报告”），