安捷伦液相操作规程

安捷伦液相操作规程演讲人（创作者）：省院刀客特万目录01.开机前准备07.日常维护与注意事项03.方法编辑与参数设置05.进样分析与过程监控02.系统启动与初始化04.样品前处理与进样准备06.实验结束与系统关机08.常见故障分析与解决01开机前准备开机前准备实验室的清晨总带着仪器特有的冷金属味，我习惯性地套上白大褂，先绕着液相色谱仪（以安捷伦1260为例）转了一圈——这是三年来养成的习惯，开机前的检查容不得半点马虎。环境与电源确认首先检查实验室温湿度：空调显示25℃，湿度50%，符合仪器要求（15-30℃，30%-85%无冷凝）。电源方面，主机、检测器、柱温箱的电源线均插紧，稳压电源指示灯绿色常亮——上周因电压波动导致泵头报错的教训还在眼前，这一步必须仔细。流动相准备与过滤打开试剂柜，取出当天实验用的甲醇（HPLC级）和超纯水。流动相瓶先用纯水冲洗3遍，再用待装流动相润洗2次。量取甲醇时特意平视量筒刻度线，确保与方法要求的50%比例一致。超纯水需提前超声脱气30分钟，此时液面已无明显气泡——未脱气的流动相容易在泵内产生气穴，去年有次基线疯狂波动，最后发现就是流动相脱气不彻底。色谱柱与系统连接检查从柱温箱中取出C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），检查两端接口是否有漏液痕迹。用记号笔在柱身上标注“第127次使用”——每根柱子的寿命需要详细记录。连接时先拧松泵出口的PEEK接头，将色谱柱入口端（标有“IN”）对准，顺时针旋紧至手紧后再用扳手补半圈，出口端同理连接检测器入口。这一步若拧太松会漏液，拧太紧可能压坏接口，力度全靠手感。仪器状态初步排查按下主机电源键前，先检查废液瓶：昨天的实验结束后已清空，瓶内残留的甲醇味很淡，说明清洗过。泵头的密封圈位置没有液体渗出，柱塞杆表面光滑无划痕——上个月刚换过密封圈，当时泵压不稳了整整一周，教训深刻。检测器的流通池窗口用擦镜纸轻轻擦拭，确保无指纹或灰尘，这直接影响基线噪声。02系统启动与初始化系统启动与初始化确认所有准备无误后，双手按下主机电源键，熟悉的“滴”声响起，屏幕开始自检。脱气机与泵的启动首先启动在线脱气机：点击“SystemControl”界面，勾选“Degasser”，流速设为5mL/min（默认冲洗流速）。约2分钟后，脱气机的真空表稳定在-0.08MPa，说明管路内空气已基本排出。接着启动四元泵：点击“Pump”模块，选择“Purge”模式，分别打开A、B通道（对应甲醇和水）的排液阀，设置流速5mL/min，冲洗5分钟——能看到排液管流出的液体从最初的断断续续变得连续，这是气泡被排出的标志。检测器与柱温箱预热泵冲洗完成后，关闭排液阀，将流速降至0.5mL/min（低流速保护色谱柱）。同时启动DAD检测器：点击“Detector”模块，设置检测波长为254nm（本次实验目标物的最大吸收波长），灯源选择氘灯（UV检测常用）。检测器需要预热30分钟，期间能听到氘灯启动时的“咔嗒”声，3分钟后能量值稳定在1800mAU以上（正常范围≥1500mAU）。柱温箱同步设置为30℃（方法要求），温度传感器显示当前23℃，升温速率约2℃/min，预计10分钟后达标。系统压力校准与平衡柱温稳定后，将泵流速升至1.0mL/min（方法设定流速），观察压力变化。初始压力波动较大（从50bar升至120bar），这是流动相置换柱内残留溶剂的正常现象。约20分钟后，压力稳定在118±2bar（该色谱柱在甲醇-水50:50、1mL/min下的典型压力），基线噪声＜1mAU，漂移＜5mAU/h——这意味着系统已达到平衡状态，可以进样。03方法编辑与参数设置方法编辑与参数设置平衡系统的同时，我打开“OpenLABCDS”软件，开始编辑本次实验的仪器方法。泵参数设置在“Pump”选项卡中，设置流速为1.0mL/min（等度洗脱），流动相比例A（水）50%、B（甲醇）50%。勾选“PostTime”（后运行时间）10分钟，用于冲洗色谱柱残留。这里特别注意，若使用梯度洗脱，需在“GradientTable”中逐段设置时间点和比例，且相邻比例变化不超过20%/min，避免压力突变损伤色谱柱。检测器参数设置切换到“Detector”选项卡，设置检测波长为254nm（主波长），参比波长设为360nm（无吸收区域，用于扣除背景干扰）。采样频率设为20Hz（兼顾分离度和数据精度），信号范围选择“Auto”（自动调节量程）。流通池类型选择“Standard”（10mm光程，适合常规分析），若检测低浓度样品则需换“Micro”池（3mm光程，提高灵敏度）。柱温箱与进样器设置柱温箱温度保持30℃（已提前稳定），进样器设置为“PartialLoop”模式（部分进样，适用于小体积进样），进样体积10μL（方法要求）。清洗程序设置为“NeedleWash”（进样针外壁清洗）和“SyringeWash”（进样针内壁清洗）各3次，清洗液选择50%甲醇水（与流动相兼容，避免交叉污染）。04样品前处理与进样准备样品前处理与进样准备系统平衡完成后，实验的核心环节——样品处理开始了。样品过滤与离心从冰箱取出待测样品（5℃保存，防止降解），室温放置30分钟至温度平衡。取1mL样品于1.5mL离心管，12000rpm离心10分钟——这一步是为了去除蛋白质、细胞碎片等颗粒，避免堵塞色谱柱。离心后上清液用0.22μm有机系滤膜过滤（甲醇体系需用有机系滤膜，水系滤膜会溶解），过滤时保持针筒与滤器垂直，避免滤膜破损。样品瓶装填与标记过滤后的样品转移至2mL进样瓶，液面距离瓶口约3mm（避免进样针够不到或溢出）。用油性笔在瓶身标注样品编号（S1-S10）、进样顺序（1-10），并在软件“Sequence”表中对应填写，确保顺序一致——上个月因编号错误导致数据错乱，重新进样浪费了大半天时间。进样针与定量环检查进样前用50%甲醇水冲洗进样针3次，每次抽取20μL后推出，观察针内是否有气泡。将进样针垂直插入定量环（10μL），缓慢推至刻度线，停留2秒再拔出——推速过快会导致液体溢出，太慢可能吸入空气。05进样分析与过程监控进样分析与过程监控一切就绪，点击软件“StartRun”，第一针样品开始进样。进样操作规范进样器机械臂平稳移动，进样针准确插入进样口，“咔嗒”一声完成进样。此时密切观察泵压力：正常压力118bar，若突然升至150bar以上，可能是色谱柱堵塞；若降至90bar以下，可能是管路漏液。检测器基线在进样后3分钟出现第一个色谱峰，保留时间5.2min（理论值5.0-5.5min），峰形对称（拖尾因子0.9-1.1），说明分离效果良好。数据采集与实时监控软件实时显示色谱图，每10秒自动保存数据。重点监控基线噪声（应＜1mAU）、漂移（＜5mAU/h）、理论塔板数（≥5000）和分离度（≥1.5）。第3针样品出峰时，基线突然出现一个尖刺，立即暂停实验，检查进样针发现外壁有残留样品——这是清洗次数不足导致的，临时将清洗次数增加至5次，后续峰形恢复正常。异常情况应急处理第7针进样后，泵压力突然降至80bar，伴随漏液报警。迅速停止泵运行，检查管路接口：发现色谱柱出口端的PEEK接头松动，液体正从缝隙渗出。关闭系统，重新拧紧接头（手紧后补半圈），用纯水冲洗漏液区域，重新平衡系统30分钟后继续实验——处理异常时必须先停泵，避免溶剂浪费和仪器损伤。06实验结束与系统关机实验结束与系统关机最后一针样品出峰完毕，软件自动积分计算结果，实验进入收尾阶段。色谱柱冲洗与保存首先将流动相切换为100%纯水（甲醇体系需过渡），流速0.5mL/min冲洗30分钟，去除柱内残留的盐类或强保留物质（本次实验流动相不含盐，可直接用甲醇冲洗）。随后切换为100%甲醇，冲洗60分钟（色谱柱体积约4.6×250×0.6=680μL，10倍柱体积约6.8mL，1mL/min需7分钟，但为确保彻底，通常冲洗1小时）。冲洗完成后，记录色谱柱状态：“柱压118bar（初始120bar），塔板数6200（初始6500），性能良好”。仪器部件清洗与复位关闭检测器氘灯（延长寿命），用纯水擦拭进样器针座和样品盘，避免残留样品结晶。泵头柱塞杆用湿润的软布擦拭，去除盐渍（若流动相含盐）。废液瓶倒空后用纯水冲洗3次，晾干备用。柱温箱温度降至室温（25℃），避免长期高温加速色谱柱老化。电源关闭与记录填写确认所有部件复位后，依次关闭柱温箱、检测器、泵和主机电源。最后填写《仪器使用记录》，内容包括：日期、操作人员、样品数量、色谱柱型号（AgilentZORBAXEclipseXDB-C18）、流动相组成（甲醇-水50:50）、压力范围（115-120bar）、异常情况（第7针漏液，已处理）。07日常维护与注意事项日常维护与注意事项液相色谱的稳定运行，70%靠日常维护。三年来我总结了一套“三查三忌”原则。日常检查要点11.每日开机前查流动相（纯度、脱气、体积）、查色谱柱（接口、柱压）、查废液瓶（容量、清洁度）；22.每周检查泵密封垫（磨损情况，每2000小时更换）、检测器流通池（是否污染，用10%硝酸冲洗）、进样针（针尖是否弯曲，用显微镜观察）；33.每月检查系统管路（PEEK管老化开裂，不锈钢管是否堵塞，用10%硝酸冲洗）、柱温箱温度精度（用温度计校准）、灯能量（氘灯＜1000mAU需更换）。操作禁忌事项1.忌流动相混用：水系流动相（含缓冲盐）与有机相切换时，必须用50%甲醇水过渡，避免盐类结晶堵塞管路；2.忌色谱柱干柱：长期不用时，柱内必须充满甲醇（或乙腈），避免固定相收缩；3.忌检测器长时间开灯：氘灯寿命约2000小时，不使用时及时关闭，关灯后需冷却30分钟再重启；4.忌样品未过滤：颗粒杂质会划伤泵柱塞杆、堵塞色谱柱，过滤是“最低成本的保护”。0201030408常见故障分析与解决常见故障分析与解决实验室的液相色谱就像老伙计，偶尔也会“闹脾气”，掌握常见故障的排查方法能节省大量时间。压力异常1.压力过高（＞150bar）：可能原因包括色谱柱堵塞（用甲醇-异丙醇1:1冲洗）、管路堵塞（分段排查，用10%硝酸冲洗）、流动相粘度高（降低有机相比例或升高柱温）；2.压力过低（＜80bar）：可能原因包括管路漏液（检查接头、泵密封垫）、单向阀污染（用异丙醇超声清洗）、流动相不足（补充流动相，排气泡）。基线异常1.基线漂移（＞5mAU/h）：可能原因是柱温未稳定（延长平衡时间）、流动相挥发（密封流动相瓶）、检测器灯能量不足（更换氘灯）；2.基线噪声大（＞1mAU）：可能原因是流动相脱气不彻底（重新超声或开在线脱气机）、流通池污染（用10%硝酸冲洗）、色谱柱流失（老化色谱柱或更换新柱）。峰形异常1.峰拖尾：可能原因是色谱柱过载（减少进样量）、样品与