DB41∕T 1728-2018 饲料添加剂丁酸梭菌的测定 微生物法

ICS65.120DB41河南省质量技术监督局发布DB41/T1728—2018本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位:河南海瑞正检测技术有限公司、河南省兽药饲料监察所、河南省种牛遗传性能测定中心。本标准主要起草人:朱慧慧、陆静、方忠意、李灵平、周永亮、黄好强、麻晓燕、王洋洋、范晓燕、魏金销。DB41/T1728—20181饲料添加剂丁酸梭菌的测定微生物法本标准规定了饲料添加剂丁酸梭菌的检测方法微生物法。本标准适用于饲料及饲料添加剂中丁酸梭菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定3培养基或材料3.1亚硫酸铁琼脂培养基:见附录A中A.1。3.20.85%生理盐水:见附录A中A.2。3.3产酸指示培养基:见附录B中B.1。3.4明胶培养基。3.5淀粉水解培养基。3.6革兰氏染色配套试剂:见附录A中A.3。3.7胰蛋白胨大豆琼脂(TSW)。注：除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。水应符合4仪器设备4.1天平:感量0.01g。4.2粉碎机。4.3高压灭菌器。4.4恒温培养箱。4.5电热鼓风干燥箱。4.6拍击式匀质器。4.7厌氧罐（配厌氧产气袋）。4.8超净工作台。4.9移液器:100μL～1000μL。4.10显微镜。4.11酒精灯。4.12试管架。4.13灭菌试管:15mL。4.14灭菌平皿:直径90mm。DB41/T1728—201825测定步骤5.1试样稀释及培养5.1.1无菌条件下称取试样25g(mL)样品，加入装有225mL0.85%灭菌生理盐水的匀质袋中，然后用匀质器拍打2min～3min，制成1:10的均匀稀释液。5.1.2用移液器移取1:10稀释液1mL，注入含有9mL0.85%灭菌生理盐水的试管中，充分混匀后，5.1.3按上述操作方法，10倍递增稀释，如此每递增稀释一次。5.1.4选择2～3个适宜稀释度，用移液器移取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿，同时用1mL无菌生理盐水作对照。然后将凉至50℃左右的培养基注入平皿中，小心转动培养基使试样与培养基充分混匀。5.1.5待培养基凝固后迅速将平皿倒置于培养箱中，37℃厌氧培养18h～24h，观察菌落形态。5.2菌落特征亚硫酸铁琼脂培养基上，菌落圆形，较小、规则、实心，刚开始为黑色，放置1d～2d时间黑色褪为白色。5.3确证试验从平皿中选出5个特征菌落进行确证试验，在胰蛋白胨大豆琼脂平皿上进行纯化。挑选纯化的菌落做革兰氏染色和生化试验，生化试验项目如表1。确证结果:革兰氏染色为阳性菌，菌体呈杆状，能形成圆形或椭圆形芽孢，菌体中部膨大呈梭形。生化试验不水解明胶，水解淀粉，可以利用蜜二糖和葡萄糖产酸，不利用松三糖，鼠李糖和山梨醇，即可判定为丁酸梭菌。表1生化鉴定项目淀粉水解蜜二糖松三糖葡萄糖结果-++---+6结果计算与报告6.1计算每块平板上的丁酸梭菌菌落数a，使用式（1）计算:a=×C…………（1）式中:a----计算每块平板上的丁酸梭菌菌落数；b----挑选后经证实为丁酸梭菌的菌落数；A----挑选平板上用于验证的菌落数；C----平板上的所有特征菌落数。最终结果按照GB/T8170数值修约规则修约至整数。DB41/T1728—201836.2样品中丁酸梭菌数的计算方法与报告选择两个连续稀释度平板（每个稀释度至少有一块平板），其上经确证后的丁酸梭菌数介于30~300之间，通过式（2）计算，即为1mL或1g样品中的丁酸梭菌菌数N:式中:N——样品中丁酸梭菌菌数；Σa——所有平板经确证后的丁酸梭菌菌数的总和；n1第一个稀释的平均数；n2第二个稀释的平均数；d——第一个稀释度的稀释因子（未经稀释的液体样品的d值为1）。按照GB/T8170数值修约规则将计算出的结果保留两位有效数字，也可将样品的丁酸梭菌菌落数记DB41/T1728—20184培养基和试剂A.1硫酸亚铁培养基A.1.1成分胰蛋白胨15.0g大豆蛋白胨5.0g酵母粉5.0g偏重亚硫酸钠1.0g柠檬酸铁铵1.0g琼脂20.0g蒸馏水1000mLA.1.2制法将上述成分置于烧杯中加热溶解，分装于三角瓶中；121℃高压灭菌15min。A.20.85%生理盐水称取氯化钠（分析纯）8.5g，溶于1000mL蒸馏瓶中。分装于三角瓶中，121℃高压灭菌15min。A.3革兰氏染色A.3.1结晶紫染色液A.3.1.1成分结晶紫95%乙醇20mL1%草酸氨溶液80mLA.3.1.2制法将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.3.2革兰氏碘液A.3.2.1成分碘碘化钾2.0g蒸馏水300mLA.3.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。DB41/T1728—20185A.3.3沙黄复染液A.3.3.1成分沙黄95%乙醇蒸馏水90mLA.3.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中，用蒸馏水稀释。DB41/T1728—20186培养基和试剂B.1产酸指示培养基B.1.1成分磷酸氢二铵氯化钾0.2g硫酸镁0.2g酵母膏0.2g0.04%溴甲酚紫琼脂蒸馏水B.