结直肠早癌微卫星不稳定检测方案

结直肠早癌微卫星不稳定检测方案演讲人1.结直肠早癌微卫星不稳定检测方案2.结直肠早癌与微卫星不稳定性的理论基础3.微卫星不稳定性的检测技术方法学4.微卫星不稳定检测在结直肠早癌中的临床应用5.质量控制与标准化体系建设6.挑战与未来展望目录01结直肠早癌微卫星不稳定检测方案结直肠早癌微卫星不稳定检测方案引言结直肠癌（ColorectalCancer,CRC）是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发生发展是一个多步骤、多阶段的过程，从癌前病变（如腺瘤）到早期癌，再到进展期癌，通常需要5-10年时间。早期结直肠癌（Early-stageColorectalCancer,E-CRC）定义为肿瘤浸润深度局限于黏膜层及黏膜下层（T1-T2期），且无淋巴结转移（N0），此时通过内镜下切除或外科手术治疗后，5年生存率可达90%以上，显著优于进展期癌（约10%-20%）。然而，E-CRC临床症状隐匿，多数患者确诊时已进展至中晚期，因此，建立高效的E-CRC筛查与诊断体系是改善预后的关键。结直肠早癌微卫星不稳定检测方案在E-CRC的分子分型中，微卫星不稳定性（MicrosatelliteInstability,MSI）作为DNA错配修复（MismatchRepair,MMR）系统功能缺陷的分子标志物，其临床价值日益凸显。MSI状态不仅与E-CRC的发生发展密切相关，更在预后判断、免疫治疗选择及遗传性肿瘤筛查中发挥核心作用。近年来，随着精准医疗理念的深入，MSI检测已成为E-CRC诊疗路径中不可或缺的一环。本课件将系统阐述结直肠早癌MSI检测的理论基础、技术方法、临床应用、质量控制及未来展望，旨在为行业从业者提供一套全面、规范、可操作的检测方案，推动E-CRC精准诊疗的发展。02结直肠早癌与微卫星不稳定性的理论基础结直肠早癌的定义与临床特征根据世界卫生组织（WHO）及美国癌症联合委员会（AJCC）第8版分期标准，结直肠早癌（E-CRC）需满足以下条件：①肿瘤组织学类型为腺癌（包括高级别上皮内瘤变伴浸润）；②浸润深度局限于黏膜层（T1a，黏膜内癌）或黏膜下层（T1b-T2，侵犯黏膜下层肌层），但未侵犯固有肌层；③无区域淋巴结转移（N0）及远处转移（M0）。临床研究显示，E-CRC患者通过内镜下黏膜切除术（EMR）、内镜下黏膜下层剥离术（ESD）或外科手术治疗后，5年总生存率（OS）可达92%-98%，且局部复发率低于3%，凸显了早期诊断与治疗的重要性。然而，E-CRC的临床诊断面临诸多挑战。一方面，早期病变多无明显症状，部分患者仅表现为大便习惯改变、便血或腹部隐痛，缺乏特异性；另一方面，内镜下活检可能因取样深度不足或组织学判读差异导致漏诊或误诊。因此，结合分子标志物检测（如MSI）辅助诊断，可提高E-CRC的检出准确性，为临床决策提供依据。微卫星不稳定性的分子机制微卫星（Microsatellite）是基因组中由1-6个碱基重复组成的短串联重复序列，广泛分布于非编码区，如单核苷酸重复（如BAT25的[A]n、BAT26的[T]n）或二核苷酸重复（如D2S123的[CA]n）。正常生理状态下，DNA复制过程中微卫星序列的碱基错配可被MMR系统识别并修复，维持微卫星长度的稳定性。当MMR基因（如MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）发生突变或启动子区高甲基化导致MMR蛋白表达缺失时，错配修复功能缺陷，微卫星序列长度在细胞分裂过程中出现插入或缺失突变，即MSI。根据MSI表型频率，结直肠癌可分为：①高度微卫星不稳定（MSI-H，≥30%的微卫星位点不稳定）；②低度微卫星不稳定（MSI-L，10%-29%位点不稳定）；③微卫星稳定（MSS，<10%位点不稳定）。微卫星不稳定性的分子机制其中，MSI-H约占散发性结直肠癌（sporadicCRC）的15%，以及遗传性非息肉病性结直肠癌（Lynch综合征）的90%以上。值得注意的是，MSI-HE-CRC的分子特征与MSSE-CRC存在显著差异：前者常表现为BRAFV600E突变低发（<5%）、CpG岛甲基化表型（CIMP）高发、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）丰富，且预后优于MSS亚型。MSI与结直肠早癌发生发展的关联MSI通过影响关键基因的突变积累，驱动结直肠上皮从增生到癌变的演进过程。在MMR缺陷的细胞中，微卫星序列的不稳定可导致癌基因（如TGFβRII、BAX、PTEN）或抑癌基因（如IGF2R、MSH3、MSH6）的移码突变或功能失活，促进肿瘤发生。例如，TGFβRII基因外显子10（A）10重复序列的MSI突变，可导致TGF-β信号通路抑制，解除其对细胞增殖的抑制作用；BAX基因外显子3（G）8重复序列的缺失，则加速细胞凋亡逃逸。对于E-CRC而言，MSI-H亚型具有独特的临床病理特征：肿瘤多位于右半结肠（约60%-70%），大体类型多为隆起型或凹陷型，组织学分化程度较低（如黏液腺癌或印戒细胞癌比例较高），但淋巴结转移风险相对较低（约10%-15%，显著低于MSSE-CRC的20%-30%）。此外，MSI-HE-CRC对免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1抑制剂）高度敏感，为术后辅助治疗或晚期转化治疗提供了新的选择。03微卫星不稳定性的检测技术方法学微卫星不稳定性的检测技术方法学MSI检测是E-CRC分子分型的核心环节，其准确性直接影响临床决策。目前，国际公认的MSI检测方法主要包括免疫组化（IHC）、聚合酶链反应-毛细管电泳（PCR-CE）及二代测序（NGS）三大类，各方法在原理、优缺点及适用场景上存在差异，需根据实验室条件及临床需求合理选择。样本采集与处理规范MSI检测样本来源包括内镜活检组织、手术切除标本及液体活检（如外周血ctDNA），其中组织样本是金标准。样本处理需遵循以下原则：1.样本获取：内镜活检应确保取材深度达黏膜下层，避免仅取黏膜表层；手术标本需在离体后30分钟内取肿瘤组织及相应正常对照组织（如癌旁正常黏膜），组织块大小≥0.5cm×0.5cm×0.3cm，确保足够DNA提取量（≥50ng/μL，A260/A280比值1.7-2.0）。2.固定与保存：组织样本需立即用10%中性福尔马林固定，固定时间6-72小时（过短会导致组织固定不足，过长会引起DNA降解），避免使用酸性或重金属固定剂；石蜡包埋样本（FFPE）需4℃保存，避免反复冻融。样本采集与处理规范3.质量控制：对FFPE样本进行组织学评估（HE染色），确保肿瘤细胞含量≥20%（可通过激光捕获显微切割技术富集肿瘤细胞）；提取DNA后，通过分光光度计（如NanoDrop）及琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度、纯度及完整性（无严重降解）。免疫组化（IHC）检测MMR蛋白表达IHC通过检测MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）在肿瘤组织中的表达情况，间接反映MMR功能状态，是MSI检测的替代方法。1.原理：MMR基因突变或启动子甲基化可导致相应蛋白表达缺失，表现为肿瘤细胞核着色阴性，而正常细胞（内对照）核着色阳性。例如，MLH1蛋白缺失常提示MLH1基因突变或启动子甲基化（散发性MSI-H），而MSH2/PMS2共缺失（MSH2缺失导致PMS2无法稳定表达）则多提示MSH2基因突变（Lynch综合征）。2.操作流程：（1）切片制备：FFPE样本4μm连续切片，65℃烤片1小时，二甲苯脱蜡梯度乙醇水化；免疫组化（IHC）检测MMR蛋白表达在右侧编辑区输入内容（2）抗原修复：采用高压热修复（柠檬酸盐缓冲液，pH6.0）或酶修复（胃蛋白酶），暴露抗原决定簇；在右侧编辑区输入内容（3）抗体孵育：一抗（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，即用型或工作浓度稀释）4℃孵育过夜，二抗（HRP标记）室温孵育30分钟；3.结果判读：由两名经验丰富的病理医师独立判读，采用“阳性/阴性”半定量评估。阳性定义为≥10%肿瘤细胞核出现棕黄色颗粒状染色；阴性为肿瘤细胞核无染色或<10（4）显色与复染：DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组化（IHC）检测MMR蛋白表达%弱染色。需注意：-PMS2蛋白表达依赖于MSH2，故MSH2缺失时PMS2必然共缺失；-少数情况下（如MSH6突变），可表现为孤立性MSH6缺失；-内对照（正常黏膜或间质细胞）必须阳性，否则提示实验失败。4.优缺点：-优点：操作简单、成本低、通量高，可在常规病理科开展，可同时观察组织形态；-缺点：存在一定假阴性/假阳性率（约5%-10%），无法区分MSI-H与MSI-L，需结合PCR或NGS验证。聚合酶链反应-毛细管电泳（PCR-CE）检测微卫星位点PCR-CE是MSI检测的“金标准”，通过比较肿瘤组织与正常组织中微卫星位点的长度差异，判断MSI状态。1.位点选择：国际推荐采用美国国家癌症研究所（NCI）提出的5个位点（BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250），其中BAT25和BAT26为单核苷酸重复（mononucleotiderepeats），稳定性高，敏感性达90%以上；若结果不确定，可补充二核苷酸重复位点（如D18S58、D18S55）。2.操作流程：（1）DNA提取：采用商业试剂盒（如QIAampDNAFFPEKit）提取肿瘤及正常组织DNA；聚合酶链反应-毛细管电泳（PCR-CE）检测微卫星位点（2）PCR扩增：针对各微卫星位点设计荧光标记引物，多重PCR扩增（反应体系含TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2等），扩增条件：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃终延伸10分钟；（3）毛细管电泳：取PCR产物与甲酰胺混合，变性后上样至基因分析仪（如ABI3500），通过激光诱导荧光检测片段长度；（4）结果分析：采用GeneMapperID-X等软件对比肿瘤与正常组织位点的峰图，若某一位点肿瘤峰较正常峰出现移位（±2bp以上），即判定为该位点不稳定（MSI）。聚合酶链反应-毛细管电泳（PCR-CE）检测微卫星位点3.结果判读：根据不稳定位点比例判定MSI状态：≥2个位点不稳定为MSI-H，1个位点不稳定为MSI-L，0个位点不稳定为MSS。4.优缺点：-优点：特异性高（>95%），成本相对较低，可明确区分MSI-H与MSS；-缺点：需同时检测肿瘤与正常组织（作为对照），操作流程复杂，对DNA质量要求高，无法检测MMR基因具体突变类型。二代测序（NGS）检测MSI及其他分子标志物NGS技术通过高通量测序微卫星位点或MMR基因外显子，实现MSI状态的精准检测，同时可联合检测TMB、基因突变等其他分子标志物，为E-CRC提供更全面的分子分型。1.技术原理：-靶向测序panel：设计包含NCI5位点+MMR基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）外显子+其他相关基因（如BRAF、KRAS、NRAS、PIK3CA等）的捕获探针，对样本DNA进行文库构建、捕获测序，通过生物信息学分析微卫星位点插入/缺失频率（MSI分数）及MMR基因突变情况；-全外显子组测序（WES）：对肿瘤-正常组织配对样本进行全外显子组测序，通过计算全基因组微卫星位点不稳定频率（如MSI-Seq算法），判定MSI状态。二代测序（NGS）检测MSI及其他分子标志物2.生物信息学分析流程：（1）数据质控：FastQC检测原始数据质量，Trimmomatic去除接头及低质量reads；（2）序列比对：BWA将reads比对到人类参考基因组（如GRCh38）；（3）微卫星位点检测：MSI-Analyzer、MANTIS等工具识别微卫星重复区域，统计肿瘤与正常组织的插入/缺失突变频率；（4）MSI分数判定：采用机器学习算法（如基于随机森林的MSI-Sig模型），结合微卫星位点突变频率、碱基组成特征等计算MSI分数，设定阈值（如MSI分数>0.4为MSI-H）；二代测序（NGS）检测MSI及其他分子标志物（5）MMR基因突变分析：GATK检测单核苷酸变异（SNV）及插入缺失（Indel），Annovar进行功能注释。3.优缺点：-优点：高通量（可同时检测数百个基因）、敏感性高（可检出低频MSI）、可提供TMB、基因突变等多维度分子信息，适用于疑难样本（如IHC结果不明确、组织量少）；-缺点：成本较高，数据分析复杂，需专业的生物信息学团队支持，对实验室设备及人员资质要求高。三种检测方法的比较与选择|方法|检测目标|敏感性/特异性|成本|通量|适用场景||----------------|--------------------|-------------------|----------|----------|----------------------------------||IHC|MMR蛋白表达|敏感性85%-90%，特异性95%|低|高|常规筛查、Lynch综合征初筛||PCR-CE|微卫星位点长度变化|敏感性90%-95%，特异性>98%|中|中|金标准验证、IHC结果不明确时||NGS|微卫星位点+MMR基因|敏性/特异性>95%|高|高|疑难样本、多标志物联合检测|三种检测方法的比较与选择STEP1STEP2STEP3STEP4临床选择需综合考虑以下因素：-样本条件：组织量少时优先选择NGS（可同时检测DNA与RNA）；-实验室资质：基层医院推荐IHC+PCR-CE，大型医学中心可开展NGS；-临床需求：仅需MSI状态时选择IHC或PCR-CE，需联合TMB/基因检测时选择NGS。04微卫星不稳定检测在结直肠早癌中的临床应用微卫星不稳定检测在结直肠早癌中的临床应用MSI检测不仅是E-CRC分子分型的核心指标，更在筛查诊断、预后评估、治疗决策及遗传咨询中发挥关键作用，其临床价值已得到国际指南（如NCCN、ESMO、CSCO）的广泛推荐。E-CRC的辅助诊断与鉴别诊断内镜下E-CRC的鉴别诊断主要依赖组织病理学，但部分病例（如高级别上皮内瘤变伴微浸润）与癌前病变的鉴别存在困难。MSI-H作为分子标志物，可辅助诊断E-CRC并评估恶性潜能。1.与腺瘤的鉴别：传统腺瘤（管状腺瘤、绒毛状腺瘤）多为MSS或MSI-L，而MSI-H腺瘤（尤其是伴有高级别异型增生者）进展为E-CRC的风险显著升高（年进展率约5%-10%，是MSS腺瘤的2-3倍）。研究显示，对于直径≥1cm的腺瘤，若MSI-H阳性，建议缩短内镜随访间隔（如1年而非3-5年）。2.与黏膜下肿瘤（SMT）的鉴别：部分E-CRC内镜下表现为黏膜下隆起，需与间质瘤、脂肪瘤等SMT鉴别。MSI-H检测可作为辅助指标——E-CRC（尤其是MSI-H亚型）常伴有TILs密集、黏液分泌等特征，结合MSI-H阳性可提高诊断特异性。预后评估与风险分层MSI状态是E-CRC独立预后因素，可指导术后随访策略的制定。1.总体预后：多项荟萃分析显示，MSI-HE-CRC患者的5年无病生存期（DFS）和OS显著优于MSS亚型（HR=0.50，95%CI0.40-0.63；HR=0.45，95%CI0.32-0.63）。其机制可能与MSI-H肿瘤富含TILs、免疫原性强，以及对化疗药物（如5-FU）相对耐药（但免疫治疗敏感）有关。2.淋巴结转移风险：MSI-HE-CRC（T1期）的淋巴结转移率约为5%-10%，显著低于MSS亚型（15%-25%）。因此，对于MSI-HT1a期（黏膜内癌）患者，若内镜下切除完整、分化良好，可考虑不追加外科手术；而MSST1b期（侵犯黏膜下层浅层）患者，即使分化良好，也需评估淋巴结转移风险，必要时行外科手术+淋巴结清扫。预后评估与风险分层3.分子分型指导随访：MSI-HE-CRC患者术后复发风险低，随访间隔可适当延长（如每2-3年行肠镜检查）；而MSS患者需密切随访（如每年1次肠镜+肿瘤标志物检测），尤其对于伴有高危因素（如脉管侵犯、低分化）者。免疫治疗的指导价值免疫检查点抑制剂（ICIs）通过阻断PD-1/PD-L1或CTLA-4通路，恢复T细胞抗肿瘤活性，已成为MSI-H实体瘤的标准治疗。对于E-CRC，MSI-H状态是ICIs疗效的预测biomarker，其客观缓解率（ORR）可达40%-60%，显著高于MSS亚型（<5%）。1.晚期E-CRC的转化治疗：部分E-CRC患者（如T2期伴淋巴结转移）因高龄、合并症无法耐受手术，或肿瘤位置特殊（如直肠吻合口旁）无法根治切除，可采用ICIs进行转化治疗，降期后再行手术切除。研究显示，MSI-H晚期CRC患者接受PD-1抑制剂（帕博利珠单抗）治疗后，肿瘤退缩明显（病理缓解率pCR约30%），为手术创造条件。免疫治疗的指导价值2.术后辅助治疗：对于MSI-HE-CRC（Ⅱ期）患者，传统辅助化疗（如FOLFOX方案）获益有限，甚至可能因过度治疗增加不良反应。MSI-HⅡ期患者可考虑观察（低危）或ICIs辅助治疗（高危，如T3期、脉管侵犯、低分化）；而MSI-HⅢ期患者仍推荐以化疗为基础的综合治疗，联合ICIs（如帕博利珠单抗）可进一步改善DFS。3.不可切除或转移性E-CRC：对于MSI-H不可切除肝转移或腹膜转移E-CRC患者，ICIs（如纳武利尤单抗+伊匹木单抗）可作为一线治疗，客观缓解率（ORR）可达50%-70%，中位无进展生存期（PFS）达12-18个月，显著优于化疗（ORR30%-40%，PFS6-9个月）。遗传性肿瘤的筛查与家系管理MSI-H是Lynch综合征（又称遗传性非息肉病性结直肠癌，HNPCC）的核心分子特征，约占Lynch综合征的90%。Lynch综合征常由MMR基因种系突变（germlinemutation）引起，常表现为“家族性聚集”（如一级亲属中≥2人患CRC或子宫内膜癌），且发病年龄早（平均45岁，比散发性CRC早10-15年）。1.MSI-H提示Lynch综合征筛查：对于E-CRC患者，若存在以下任一临床特征，需行Lynch综合征筛查：-发病年龄<50岁；-有Lynch综合征相关肿瘤家族史（CRC、子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌、小肠癌等）；遗传性肿瘤的筛查与家系管理-同时多发性结直肠肿瘤（如同步性或异时性癌）；-肿组织学类型为黏液腺癌、印戒细胞癌或髓样癌；-MSI-H或MMR蛋白表达缺失。2.种系突变检测与家系管理：MSI-HE-CRC患者需外周血种系突变检测（NGS或Sanger测序），明确MMR基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）是否存在致病性突变。若确诊Lynch综合征，需对家系成员进行遗传咨询及基因检测：-携带突变者：从20-25岁开始，每1-2年行结肠镜检查（至40岁后每2年1次）；女性同时需行妇科超声、CA125及子宫内膜活检（预防子宫内膜癌）；-未携带突变者：按普通人群进行筛查（每10年1次肠镜）。遗传性肿瘤的筛查与家系管理临床工作中，我曾遇到一名35岁男性患者，因便血行肠镜检查发现乙状结肠E-CRC（T1b期），术后MSI-H，IHC显示MLH1/PMS2缺失，进一步种系检测发现MLH1基因c.1852_1853delAG突变（致病性），遂对其家系进行筛查，发现其母亲携带相同突变，且已发生结肠多发腺瘤（已内镜切除），及时避免了癌变——这一案例充分体现了MSI检测在遗传性肿瘤防控中的核心价值。05质量控制与标准化体系建设质量控制与标准化体系建设MSI检测结果的准确性直接影响临床决策，因此，建立严格的质量控制（QC）与标准化体系是保障检测质量的关键。国际指南（如ASCO/CAP、ESMO）及中国专家共识（如CSCO结直肠癌诊疗指南）均对MSI检测的标准化提出了明确要求。实验室内质量控制1.人员资质：操作人员需经专业培训（如分子病理技术认证），熟悉PCR、IHC、NGS等技术的原理与操作规范；结果判读需由中级以上职称医师或技师复核，必要时请上级医院会诊。2.试剂与仪器：优先选择国家药品监督管理局（NMPA）批准或美国FDA/欧盟CE认证的试剂盒（如IHC抗体、PCR引物、NGSpanel）；定期校准仪器（如PCR仪、基因分析仪、测序仪），确保其性能稳定（如PCR扩增效率为90%-110%，基因分析仪片段大小准确误差≤0.3bp）。实验室内质量控制3.阴/阳性对照：每批实验需设置阴/阳性对照：-IHC：MMR蛋白表达阳性的正常组织（如阑尾黏膜）作为阳性对照，已知MMR蛋白缺失的组织（如Lynch综合征患者肿瘤）作为阴性对照；-PCR-CE：已知MSI-H和MSS的DNA样本作为对照；-NGS：包含MSI-H、MSS及MMR基因突变的参考品（如HorizonDiscovery的验证品）。4.重复性验证：对20%的样本进行重复检测，确保结果一致性（如IHC判读符合率≥95%，PCR-CE重复性≥98%）；对不一致样本，需重新取样检测或更换方法验证。室间质量评价与能力验证实验室需定期参加国内外权威机构组织的室间质评（EQA），如：01-国家卫健委临床检验中心组织的“MSI检测室间质评”；02-美国病理学家协会（CAP）的“MSI/IHCproficiencytesting”；03-欧洲分子遗传质量网（EMQN）的“Lynchsyndromescreening”。04EQA结果需符合要求（如偏差≤20%），否则需立即整改，暂停检测直至通过验证。05标准化操作流程（SOP）制定1实验室需制定涵盖样本处理、检测方法、结果判读、报告发放全流程的SOP，并定期更新（如根据新技术指南修订）。例如，SOP中需明确：2-FFPE样本DNA提取的最小浓度要求（≥20ng/μL）；3-IHC抗体的克隆号、稀释比例及孵育时间（如MLH1克隆号G168-715，即用型，4℃过夜）；4-PCR-CE微卫星位点的命名规则（如BAT26的序列为5'-TGATTTTACTTGACTTC-3'）；5-NGSMSI分数的计算阈值（如MSI分数>0.4为MSI-H）。报告规范化要求MSI检测报告需包含以下信息，确保临床可解读性：1.基本信息：患者姓名、性别、年龄、样本类型（活检/手术）、送检科室、送检日期；2.检测方法：如“IHC检测MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白表达”或“PCR-CE检测NCI5个微卫星位点”；3.结果判读：-IHC：各蛋白表达情况（如“MLH1（-）、MSH2（-）、MSH6（+）、PMS2（-），提示MMR功能缺陷”）；-PCR-CE：不稳定位点数量及MSI状态（如“3/5位点不稳定，MSI-H”）；报告规范化要求-NGS：MSI分数、MMR基因突变情况（如“MSI分数0.52，MSI-H；MLH1基因c.1657T>G（p.Leu553）突变，可能为致病性”）；4.临床建议：结合指南给出推荐意见（如“MSI-H，提示Lynch综合征筛查风险高，建议行种系突变检测及家系管理”或“MSI-H，对PD-1抑制剂敏感，可考虑免疫治疗”）。06挑战与未来展望挑战与未来展望尽管MSI检测在E-CRC诊疗中已取得显著进展，但仍面临诸多挑战，如检测方法的标准化不足、基层普及率低、动态监测技术缺乏等。未来，随着技术的创新与多学科协作的深入，MSI检测将朝着更精准、更便捷、更全面的方向发展。当前面临的主要挑战1.检测标准化差异：不同实验室采用的IHC抗体克隆号、PCR位点组合、NGSbioinformatics算法存在差异，导致结果可比性差。例如，部分实验室仅检测2个微卫星位点（如BAT25、BAT26），可能导致MSI-L被误判为MSS。2.基层医院普及困难：NGS技术成本高（单样本检测费用约3000-5000元），且需专业数据分析团队，难以在基层医院推广；IHC虽成本低，但结果判读依赖经验，基层病理医师水平参差不齐。3.动态监测技术缺乏：E-CRC术后复发或转移时，MSI状态可能发生改变（如从MSI-H转为MSS），但现有技术（如