胃癌患者HER2检测室内质控品制备与验证方案

胃癌患者HER2检测室内质控品制备与验证方案演讲人01胃癌患者HER2检测室内质控品制备与验证方案02质控品的选择与制备：科学性与实用性并重03质控品的特性验证：确保质控结果的可靠性04室内质控方案的建立：覆盖检测全流程的质控体系05质控品的应用与维护：确保长期有效性06持续改进与质量保证：构建全方位质控体系目录01胃癌患者HER2检测室内质控品制备与验证方案胃癌患者HER2检测室内质控品制备与验证方案1.引言：HER2检测在胃癌诊疗中的核心地位与室内质控的必要性胃癌是全球发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，其治疗已进入个体化精准医疗时代。人表皮生长因子受体2（HER2）作为胃癌重要的分子靶点，其状态直接指导曲妥珠单抗等靶向药物的使用，是影响患者预后和生存质量的关键指标。研究表明，约10%-20%的胃癌患者存在HER2蛋白过表达或基因扩增，准确检测HER2状态对治疗方案的选择具有决定性意义。然而，HER2检测涉及免疫组化（IHC）、荧光原位杂交（FISH）、银原位杂交（SISH）等多种方法，检测过程易受样本处理、试剂批间差异、仪器性能及操作人员主观判断等因素影响，导致结果假阳性或假阴性。例如，IHC染色中抗体浓度、孵育时间的变化可能影响判读结果；FISH检测中信号计数误差可能导致扩增状态误判。这些误差不仅会导致患者错失靶向治疗机会，还可能增加不必要的医疗负担。胃癌患者HER2检测室内质控品制备与验证方案室内质控（InternalQualityControl,IQC）是实验室质量保证体系的核心环节，通过使用已知特性的质控品监控检测过程的稳定性，及时发现并纠正偏差。而质控品的制备与验证是IQC的基础，其质量直接关系到质控结果的可靠性。因此，建立科学、规范的胃癌HER2检测室内质控品制备与验证方案，对提升检测准确性、保障患者诊疗安全具有重要意义。本文基于笔者多年病理科质控工作经验，结合国内外指南要求，系统阐述质控品的选择、制备、特性验证及室内质控方案建立的全流程，为实验室实践提供参考。02质控品的选择与制备：科学性与实用性并重质控品的选择与制备：科学性与实用性并重质控品的选择与制备是室内质控的第一步，需兼顾“代表性”（模拟临床样本特性）、“稳定性”（长期保存中特性不变）、“多样性”（覆盖检测临界值）及“安全性”（避免生物污染）。结合胃癌HER2检测的特点，质控品可分为组织样本类、细胞系类及人工模拟物类，需根据实验室检测方法（IHC/FISH/SISH）及需求选择。1质控品类型与选择依据1.1组织样本类质控品组织样本是HER2检测最接近临床实际的质控品，包括阳性、阴性及临界值（2+）样本，来源可为手术切除标本、内镜活检标本或组织芯片（TissueMicroarray,TMA）。-阳性样本：选择HER2IHC3+或FISHHER2/CEP17比值≥2.0的胃癌组织，需经至少2名资深病理医师独立确认，确保结果可靠。例如，选取具有完整腺管结构、HER2蛋白呈膜强阳性的胃癌石蜡包埋样本，避免肿瘤细胞坏死或间质过多干扰。-阴性样本：选择HER2IHC0/1+或FISHHER2/CEP17比值<2.0的胃癌组织，需排除HER2基因扩增的假阴性可能（如因DNA提取不足导致的扩增失败）。1231质控品类型与选择依据1.1组织样本类质控品-临界值样本（2+）：选择HER2IHC2+（不完全膜弱阳性）且FISH检测结果为不确定（HER2/CEP17比值1.8-2.2）的样本，这是质控的关键区间，可监控检测方法对临界值的判读能力。选择依据：组织样本保留了肿瘤组织的空间结构、抗原表达特性及基因状态，与临床样本高度一致，适用于IHC、FISH等检测方法。但需注意样本的伦理合规性，所有临床样本的使用需经医院伦理委员会批准，并签署知情同意书。1质控品类型与选择依据1.2细胞系类质控品细胞系具有均一性好、可无限传代、易于标准化制备的优势，适用于需要大批量、高重复性质控的场景。-HER2阳性细胞系：如SK-BR-3（乳腺癌HER2过表达细胞系，胃癌研究中常用作阳性对照）、NCI-N87（胃癌HER2过表达细胞系），需通过Westernblot、FISH等方法验证其HER2蛋白表达及基因扩增状态。-HER2阴性细胞系：如MKN-45（胃癌HER2阴性细胞系）、AGS（胃癌HER2阴性细胞系），需确保无HER2基因扩增及蛋白表达。制备方法：将细胞系培养至对数生长期，胰酶消化后离心，制备细胞悬液，用10%中性福尔马林固定（固定时间4-24小时，避免过度固定导致抗原丢失），石蜡包埋制成细胞块（CellBlock）。细胞块可切片用于IHC/FISH检测，或提取核酸用于分子检测。1质控品类型与选择依据1.2细胞系类质控品选择依据：细胞系避免了临床样本的异质性（如肿瘤细胞比例、间质成分差异），质控结果的重复性更好，适合作为实验室日常质控的“基准品”。但需注意细胞系在体外培养过程中可能发生基因变异，需定期（每3-6个月）重新验证其HER2状态。1质控品类型与选择依据1.3人工模拟物质控品人工模拟物是通过人工制备的、模拟HER2抗原或核酸序列的物质，适用于需要定量评估检测方法灵敏度、特异性的场景。-IHC质控模拟物：将纯化的HER2蛋白包被在玻片上，制成“人工组织芯片”，模拟IHC染色中的抗原抗体结合反应；或使用HER2蛋白偶联的微球，通过免疫荧光显色评估抗体效价。-FISH/SISH质控模拟物：将HER2基因（HER2）和着丝粒17号染色体（CEP17）的DNA序列克隆至质粒载体，按一定比例混合，滴片制备成模拟玻片，模拟FISH信号（红/绿荧光信号比值）；或使用合成寡核苷酸探针标记荧光，制备成“人工染色体”。1质控品类型与选择依据1.3人工模拟物质控品选择依据：人工模拟物成分明确、稳定性高、可批量生产，适合作为“质控品质控品”（CalibratorforControlMaterials），监控不同批次试剂的检测性能。但其与临床样本的基质环境（如组织蛋白、核酸浓度）存在差异，需结合组织样本类质控品使用。2质控品制备的关键步骤与质量控制2.1组织样本类质控品制备流程1.样本筛选与确认：选取经病理诊断明确、HER2状态已知的新鲜或存档胃癌石蜡包埋样本，要求肿瘤细胞比例≥70%（HE染色确认），无坏死或自溶。2.样本处理：将样本切成4μm厚切片（用于HE染色确认肿瘤区域），剩余组织修整为5mm×5mm×3mm小块，标记后备用。3.固定与包埋：样本用10%中性福尔马林固定24小时（避免延长固定时间），梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。包埋时需确保组织块方向一致（如腺管腔面垂直于包埋面），便于后续切片。4.切片与储存：将包埋块制成4μm厚切片，裱片于防脱玻片，60℃烘烤1小时（防止脱片）。切片于4℃避光保存，有效期不超过6个月（需定期验证稳定性）。2质控品制备的关键步骤与质量控制2.2细胞系类质控品制备流程1.细胞培养与扩增：细胞系用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（37℃、5%CO2）培养，至细胞密度达80%-90%时传代。传代次数控制在20代以内，避免基因突变。2.细胞收获与固定：胰酶消化细胞（0.25%胰蛋白酶，37℃、3分钟），终止消化后离心（1000rpm、5分钟），弃上清，加入PBS洗涤2次。细胞沉淀用10%中性福尔马林固定（固定液体积为细胞沉淀体积的5倍），固定时间4小时。3.细胞块制备：固定后的细胞离心（1500rpm、10分钟），弃上清，加入适量琼脂糖（终浓度2%）混匀，倒入模具中冷却凝固。将凝固的琼脂糖-细胞块取出，石蜡包埋。4.质量鉴定：将细胞块切片，行HE染色（观察细胞形态）、IHC染色（验证HER2表达），确保细胞形态清晰、HER2状态符合预期。2质控品制备的关键步骤与质量控制2.3人工模拟物制备流程以FISH质控模拟物为例：1.探针设计：设计HER2基因（SpectrumRed标记）和CEP17（SpectrumGreen标记）的DNA探针，探针长度约为150-200bp，特异性通过BLAST验证。2.探针标记与纯化：通过PCR标记探针，使用纯化试剂盒去除未标记的dNTPs，检测探针浓度（OD260）及标记效率（荧光强度）。3.模拟玻片制备：将纯化的探针按HER2/CEP17=1.5、2.0、3.0的比例混合，滴片于预处理（0.1NHCl、72℃）的玻片上，老化（37℃、2小时），封片保存。4.性能验证：用已知FISH结果的临床样本与模拟玻片同步检测，比较信号比值的偏差（要求偏差≤15%），确保模拟物能准确反映检测系统的性能。3质控品的分装与储存质控品的分装需考虑“最小使用量”原则，避免反复冻融导致特性改变。例如：-组织切片：每张切片含肿瘤组织面积≥5mm²，分装于密封玻片盒，内含干燥剂，4℃避光保存。-细胞块：将包埋块切割为2mm×2mm小块，分装至1.5mLEP管，每管1块，-80℃保存。-人工模拟物：探针分装为10μL/管，-20℃避光保存，避免反复冻融（冻融次数≤3次）。储存条件验证：对不同储存条件（如4℃、-20℃、-80℃）下的质控品进行定期检测（每月1次，连续3个月），评估其稳定性。例如，组织切片在4℃保存3个月后，IHC染色强度下降≤10%，可判定为稳定。03质控品的特性验证：确保质控结果的可靠性质控品的特性验证：确保质控结果的可靠性质控品制备完成后，需通过系统的特性验证，确认其均一性、稳定性、特异性及适用性，确保其能真实反映检测过程的性能。特性验证需依据《临床实验室质量保证—ISO15189》及《HER2检测临床实践指南》要求，采用统计学方法分析数据。1均一性验证均一性是指同一批次质控品在分装后不同单元间特性的一致性，是质控品可重复使用的前提。1均一性验证1.1验证方法-组织切片类：随机抽取10张切片，由3名经验丰富的病理医师独立行IHC染色（采用相同抗体、孵育时间等条件），采用HER2评分标准（0:无染色；1+:膜弱阳性、≤10%肿瘤细胞染色；2+:不完全膜弱阳性、>10%肿瘤细胞染色；3+:膜强阳性、>30%肿瘤细胞染色），计算评分的变异系数（CV）。-细胞块/人工模拟物类：随机抽取10个单元，分别行FISH检测，计数50个细胞的HER2/CEP17比值，计算比值的CV及95%置信区间（CI）。1均一性验证1.2判断标准-IHC评分：CV≤15%（0/1+）、CV≤20%（2+/3+），不同医师评分的Kappa系数≥0.8（一致性良好）。-FISH比值：CV≤10%，95%CI与预期值（如2.0）的偏差≤15%。案例：笔者实验室在制备HER22+临界值质控品时，初期因组织块肿瘤细胞比例不均（50%-80%），导致IHC评分CV达25%，后通过修整组织块（确保肿瘤细胞比例≥70%），CV降至18%，符合均一性要求。2稳定性验证稳定性是指质控品在规定储存条件下，特性随时间保持不变的能力，是确定质控品有效期的关键。2稳定性验证2.1验证方法-长期稳定性：将质控品于常规储存条件下（如组织切片4℃、细胞块-80℃）保存，分别在第0、1、3、6个月进行检测，每次检测3个重复单元，记录检测结果（IHC评分、FISH比值）。-加速稳定性：将质控品于37℃（模拟高温环境）或反复冻融（-80℃→室温→-80℃，10个循环）条件下保存，检测第1、3、5天的检测结果，评估极端条件下的稳定性。2稳定性验证2.2数据分析采用线性回归分析检测结果随时间的变化趋势，计算斜率及截距。若斜率的95%CI包含0（即无显著变化趋势），且各时间点检测结果与基线的偏差≤允许总误差（TEa，IHC评分偏差≤1级，FISH比值偏差≤15%），则判定为稳定。案例：某实验室制备的HER2阳性细胞块，在-80℃保存6个月后，FISH比值从2.5±0.2降至2.3±0.3（偏差8%），仍在TEa范围内，有效期定为6个月；而加速稳定性试验中，37℃保存5天后，IHC评分从3+降至2+，提示高温下稳定性下降，需严格避免室温长时间存放。3特异性验证特异性是指质控品仅与目标检测物（HER2蛋白/基因）反应，不受非目标物质干扰的能力，避免假阳性或假阴性结果。3特异性验证3.1验证方法-交叉反应检测：用质控品分别检测非目标生物标志物（如EGFR、HER3、Ki-67），判断是否存在交叉反应。例如，HER2IHC质控品染色后，需通过Westernblot验证是否仅与HER2蛋白结合，不与其他HER家族蛋白结合。-干扰物质检测：在质控品中加入常见干扰物质（如血液、坏死组织、黏液），检测其对检测结果的影响。例如，将含10%血液的胃癌组织切片与无血液切片同步行IHC染色，比较染色强度差异（要求偏差≤10%）。3特异性验证3.2判断标准非目标生物标志物的检测结果应为阴性（如EGFRIHC评分≤1+），干扰物质存在下的检测结果与无干扰时的偏差≤TEa。4适用性验证适用性是指质控品适用于实验室所有检测方法（IHC/FISH/SISH）及不同操作人员的能力，确保质控覆盖检测全过程。4适用性验证4.1验证方法-方法适用性：分别用IHC、FISH、SISH三种方法检测同一批质控品，比较检测结果的一致性。例如，10例HER22+质控样本，IHC2+与FISHHER2/CEP17比值1.8-2.2的一致率应≥90%。-人员适用性：由初级、中级、初级3个职称的各2名操作人员，独立对质控品进行检测，计算操作者内（重复性）及操作者间（再现性）的CV。4适用性验证4.2判断标准不同方法检测结果的一致率≥90%，操作者内CV≤10%，操作者间CV≤15%（FISH比值）。若不满足要求，需重新培训操作人员或优化检测流程。04室内质控方案的建立：覆盖检测全流程的质控体系室内质控方案的建立：覆盖检测全流程的质控体系室内质控方案需基于质控品的特性，结合检测方法（IHC/FISH）的薄弱环节，设计质控频率、质控规则及失控处理流程，确保检测结果从样本接收到报告发出的全过程可控。1质控品的选择与组合根据“关键节点”原则，质控品需覆盖检测的每个关键步骤：-IHC检测：每批次检测需包含阴性（0/1+）、临界值（2+）、阳性（3+）3种质控品，各1例，模拟临床常见样本类型。-FISH检测：每批次检测需包含阴性（HER2/CEP17<2.0）、临界值（1.8-2.2）、阳性（≥2.0）3种质控品，各2例（重复性验证）。组合逻辑：阴性质控监控抗体特异性、染色背景等；临界值质控监控检测方法的灵敏度及临界值判读能力；阳性质控监控抗体效价、信号放大系统等。2质控频率的设定质控频率需根据检测样本量、方法稳定性及风险等级设定，确保及时发现偶然误差和系统误差：-每日质控：每次检测样本时（无论样本量多少），需同时检测质控品，监控当次检测的稳定性。例如，早晨开机后，先检测质控品，确认仪器（显微镜、图像分析系统）性能正常后再检测临床样本。-每周质控：每周选取1天，增加质控品重复次数（各3例），评估周内检测的稳定性，监控试剂批内差异。-每月质控：每月对质控数据进行汇总分析，评估月内检测趋势，如均值连续偏移，需排查试剂、仪器等系统性原因。3质控规则的设计质控规则是判断检测结果是否“在控”或“失控”的标准，需结合Westgard多规则，兼顾灵敏度与特异性：3质控规则的设计3.1IHC检测质控规则-1-3s规则：1个质控结果超过均值±3s，提示失控，立即停止检测，排查原因。-R-4s规则：同批2个质控结果差值超过4s，提示随机误差（如染色时间不一致）。-1-2s规则：1个质控结果超过均值±2s，提示警告，需复查样本。-2-2s规则：2个连续质控结果同侧超过均值±2s，提示系统误差（如抗体浓度变化）。3质控规则的设计3.2FISH检测质控规则-均值±2s范围：质控比值需在预期值±2s内，如阳性质控预期值为2.5±0.3，比值>2.8或<2.2为警告。-临界值质控双份一致率：2份临界值质控的FISH比值差值≤0.2，如分别为1.9和2.1，判为在控；差值>0.2，需复查。规则选择依据：IHC判读存在主观性，需采用多规则降低假失控；FISH为定量检测，需严格控制比值的波动范围。4失控处理流程与记录失控是质控过程中不可避免的环节，关键在于“及时发现原因、快速纠正、记录完整”。4失控处理流程与记录4.1失控处理步骤在右侧编辑区输入内容1.立即停止检测：发现失控后，暂停所有临床样本检测，避免发出错误报告。-人：操作人员是否经过培训？判读标准是否一致？-机：显微镜光源是否稳定？图像分析软件校准是否过期？-料：抗体/探针批次是否更换？染色液是否配制正确？-法：孵育时间/温度是否偏离标准操作规程（SOP）？-环：实验室温度/湿度是否异常？切片是否污染？2.排查可能原因：按“人、机、料、法、环”5个维度系统排查：在右侧编辑区输入内容3.纠正与验证：找到原因后，纠正错误（如更换试剂、重新校准仪器），用同一质控品重复检测2次，结果在控后方可恢复检测。在右侧编辑区输入内容4.记录与报告：填写《失控处理记录表》，记录失控时间、原因、纠正措施及验证结果，由科室负责人审核。4失控处理流程与记录4.2常见失控案例与处理-案例1：IHC阳性质控染色强度减弱，排查发现抗体储存不当（反复冻融），更换新批次抗体后，染色强度恢复，质控结果在控。-案例2：FISH临界值质控比值波动大（1.8-2.5），排查发现显微镜光源不稳定，校准光源后，比值稳定在2.0±0.2。05质控品的应用与维护：确保长期有效性质控品的应用与维护：确保长期有效性质控品制备与验证后，需在日常检测中规范应用，并通过定期维护、数据回顾等方式，确保其长期有效性，持续为实验室质量保驾护航。1日常应用注意事项-避免污染：组织切片操作时需戴手套，避免交叉污染；细胞块使用后剩余部分需丢弃，不可反复使用。-标准化操作：质控品检测需与临床样本采用相同的SOP（如IHC染色时间、FISH杂交温度），确保条件一致。-结果判读：IHC质控结果需由2名医师独立判读，分歧时由第三名医师仲裁；FISH质控需使用图像分析系统计数，避免主观误差。2数据记录与趋势分析1实验室信息管理系统（LIS）需具备质控数据记录功能，自动绘制质控图（如Levey-Jennings图），实时监控检测结果趋势。每月需对数据进行回顾分析：2-趋势分析：若连续3天质控均值向同一方向偏移（如IHC阳性评分从3+降至2+），提示系统误差（如抗体效价下降），需提前干预。3-周期性分析：若质控结果呈现规律性波动（如每周一偏低），可能与周末仪器维护有关，需优化维护流程。3质控品的更新与淘汰质控品并非无限期使用，需根据稳定性验证结果及时更新：-有效期到期：如组织切片保存6个月后，IHC染色强度下降超过TEa（10%），需更换新批次质控品。-检测方法更新：实验室若引入新的检测平台（如数字化病理IHC），需重新验证质控品的适用性，必要时制备新的质控品。-性能下降：若质控品出现污染（如细菌滋生）、特性改变（如细胞系基因突变），需立即停用并更新。06持续改进与质量保证：构建全方位质控体系持续改进与质量保证：构建全方位质控体系室内质控是质量保证的“基础工程”，需与室间质评（EQA）、人员培训、仪器维护相结合，形成“预防-监控-改进”的闭环管理，持续提升检测质量。1与室间质评的协同室间质评是由外部机构组织的实验室间比对，可客观评估实验室检测的准确性。室内质控与室间质评