胃癌患者HER2检测样本前处理规范操作方案

胃癌患者HER2检测样本前处理规范操作方案演讲人01胃癌患者HER2检测样本前处理规范操作方案02样本类型选择与采集规范：确保原始样本的代表性03样本固定：保存组织形态与抗原完整性的核心环节04样本运输与接收：从临床科室到病理科的“无缝衔接”05样本处理：从组织块到病理切片的标准化流程06质量控制与常见问题处理：确保检测结果可靠性的“双保险”07总结：样本前处理是HER2检测的“生命线”目录01胃癌患者HER2检测样本前处理规范操作方案胃癌患者HER2检测样本前处理规范操作方案一、引言：HER2检测在胃癌诊疗中的核心地位与样本前处理的关键作用作为胃癌分子病理诊断的重要靶点，HER2（人类表皮生长因子受体2）的状态直接关系到患者的预后评估及靶向治疗选择。研究表明，约10%-20%的胃癌患者存在HER2基因扩增或蛋白过表达，而准确的HER2检测结果是曲妥珠单抗等靶向药物有效应用的前提。然而，在日常工作中，我们常因样本前处理不规范导致检测结果偏差——如固定不足导致的抗原丢失、组织自溶造成的假阴性、切片质量不佳引发的判读困难等。这些“源头性”误差不仅影响患者个体化治疗方案的选择，更可能导致医疗资源的浪费与信任危机。基于此，本方案以“精准、规范、可重复”为原则，结合最新国际指南（如ASCO/CAP、中国临床肿瘤学会CSCO胃癌诊疗指南）及实践经验，系统梳理胃癌HER2检测样本前处理的全流程操作规范。从样本采集到最终切片制备，每一个环节均需严格把控，以确保检测结果的准确性与可靠性，为胃癌患者的精准诊疗奠定坚实基础。02样本类型选择与采集规范：确保原始样本的代表性1样本类型的选择原则HER2检测样本主要包括手术切除标本和内镜活检标本，两者在处理流程上存在差异，需根据临床需求合理选择：1样本类型的选择原则1.1手术切除标本STEP1STEP2STEP3-适用场景：适用于初次诊断、肿瘤分期明确、需进行多指标联合检测（如PD-L1、微卫星状态）的患者。-优势：组织量大，可选取肿瘤核心区域及浸润前沿，避免肿瘤异质性导致的误差；便于进行多部位取材，提高检测准确性。-要求：标本需完整包含原发灶及周围组织，避免电刀灼烧（电刀产生的高温可导致蛋白变性，影响HER2染色）。1样本类型的选择原则1.2内镜活检标本-适用场景：适用于晚期无法手术、需快速明确HER2状态以启动靶向治疗的患者，或术后复发/转移灶的再评估。01-优势：创伤小，可重复取材；能获取肿瘤活性区域（避免坏死组织）。02-局限性：组织量少，需至少取材2-3块（单块活检组织因肿瘤细胞含量不足，易导致假阴性）；取材时需避开溃疡、坏死区域。032样本采集的技术要点无论何种样本类型，采集过程均需遵循“无挤压、及时固定、标识清晰”的原则，最大限度保证样本质量：2样本采集的技术要点2.1采集工具与方法-手术标本：使用锋利的手术刀或组织剪，避免用镊子夹取组织（挤压会导致组织变形、细胞结构破坏）；取材厚度控制在0.2-0.3cm（过厚不利于固定液渗透，过薄易破碎）。-活检标本：使用活检钳时，避免在溃疡基底反复钳取（易混入坏死组织）；建议采用“一钳一管”模式，即每块活检组织单独置于固定液中，防止交叉污染。2样本采集的技术要点2.2采集部位的选择-肿瘤核心区域：选取肿瘤细胞密集、活性高的区域（肉眼观察呈灰白色、质地较硬处），避开出血、坏死区域（坏死组织中HER2抗原丢失，可能导致假阴性）。-浸润前沿：对于胃壁浸润型肿瘤，需取肿瘤与正常组织交界处（HER2表达可能存在空间异质性，交界处更能代表侵袭特性）。-淋巴结转移灶：若存在淋巴结转移，建议同时检测原发灶与转移灶（HER2状态在原发灶与转移灶中可能不一致，转移灶检测结果更具治疗指导意义）。2样本采集的技术要点2.3标识与记录-标识清晰：标本容器需粘贴条形码或标签，标注患者姓名、病历号、标本类型（如“胃窦癌手术标本”“胃体活检标本”）、采集日期及部位（如“胃窦小弯侧”）；标签需防水、防脱落，避免固定液浸泡后模糊。-信息记录：在病理申请单上详细记录患者临床信息（年龄、性别、肿瘤部位、分期）、标本类型、采集部位及临床需求（如“术前评估HER2状态，拟行靶向治疗”），便于病理科解读结果。03样本固定：保存组织形态与抗原完整性的核心环节样本固定：保存组织形态与抗原完整性的核心环节固定是样本前处理中最关键的一步，其目的是通过化学试剂（常用中性福尔马林）使蛋白质变性、酶失活，从而保持组织细胞的形态结构，并稳定HER2抗原表位，避免检测过程中抗原丢失。固定不当是导致HER2检测结果偏差的首要原因——固定时间不足（<6小时）会导致抗原溶出，固定时间过长（>72小时）可能导致抗原交联遮蔽，均可能造成假阴性结果。1固定液的选择与配制1.1推荐固定液：中性福尔马林（NBF）-优势：渗透性强，固定均匀；pH中性，避免酸性或碱性固定液导致的组织自溶或抗原变性；成本低廉，易于获取。-成分：10%中性福尔马林（含4%甲醛，pH7.0-7.4），由甲醛（37%-40%）磷酸缓冲液（pH7.2-7.4）蒸馏水按比例配制。-禁忌：避免使用酸性福尔马林（pH<7.0，易导致组织过度酸化，抗原破坏）或Bouin液（含苦味酸，易导致HER2抗原表达减弱）。0102031固定液的选择与配制1.2固定液的更换与维护-固定液体积要求：固定液体积需≥样本体积的10倍（如1cm³组织需至少10mL固定液），确保固定液能充分渗透组织。-定期更换：对于手术标本（固定时间>24小时），需每24小时更换一次固定液（避免甲醛氧化形成甲酸，导致固定液pH下降）；活检标本（固定时间<24小时）若固定液浑浊或出现沉淀，需及时更换。2固定时间的规范控制固定时间需根据样本类型、大小灵活调整，遵循“及时固定、避免过度”的原则：2固定时间的规范控制2.1手术标本-固定起始时间：标本离体后30分钟内完成固定（避免组织干燥或自溶）；若手术时间较长，可使用湿纱布包裹标本并置于4℃环境暂存（暂存时间<2小时），但不可直接放入冰盒（低温导致组织僵硬，不利于固定液渗透）。-固定时间：6-48小时。对于厚度≤0.3cm的小组织块，固定6-12小时即可；对于厚度>0.5cm的大组织块，需延长至24-48小时，确保中心区域固定充分。2固定时间的规范控制2.2活检标本-固定起始时间：内镜下取出后立即放入固定液（避免活检钳在体外停留时间过长导致组织干燥）。-固定时间：6-24小时。由于活检组织体积小（通常≤0.1cm³），固定6小时即可达到中心固定，但不宜超过24小时（避免过度固定导致抗原交联）。3固定过程中的常见问题与处理3.1固定不足-原因：固定液体积不足、固定时间过短、固定液pH异常。-表现：组织质地柔软、切面湿润、HE染色细胞结构模糊（如细胞核边界不清）。-处理：若固定时间<6小时，可延长固定时间至标准范围；若固定液不足，立即补充足量固定液；若固定液pH<7.0，更换新的中性福尔马林。3固定过程中的常见问题与处理3.2固定过度-原因：固定时间>72小时、固定液甲醛浓度过高（>4%）。01-处理：无法逆转，需在后续抗原修复时采用高温高压修复（如EDTA缓冲液，pH9.0，121℃高压修复20分钟）以增强抗原暴露。03-表现：组织质地坚硬、切片破碎、HE染色背景深（细胞核过度固缩）。0201020304样本运输与接收：从临床科室到病理科的“无缝衔接”样本运输与接收：从临床科室到病理科的“无缝衔接”样本运输与接收是连接临床采集与病理处理的“桥梁”，若运输不当导致样本损坏、固定液泄漏或信息丢失，将直接影响后续检测流程。1运输过程的规范操作1.1运输容器与包装-容器要求：使用密封性好、耐腐蚀的广口瓶（如玻璃瓶或塑料瓶），瓶盖需拧紧，防止固定液泄漏；容器外需粘贴“生物危害标识”及标本信息标签。-包装方式：将标本瓶置于防震泡沫盒中，周围填充吸水材料（如吸水纸），避免运输过程中碰撞破损；若需长途运输（如多中心协作），可将标本瓶置于4℃冷藏箱（非冷冻，防止组织结冰导致细胞破裂）。1运输过程的规范操作1.2运输时间与温度-运输时间：标本离体后需在24小时内送达病理科（活检标本需在6小时内送达，避免组织自溶）。-温度控制：常温运输（15-25℃）即可，避免冷冻（-20℃以下会导致组织蛋白变性，抗原不可逆破坏）；若夏季运输温度过高，可在冷藏箱中放置冰袋（保持4-10℃），但需确保标本瓶不直接接触冰袋（防止局部低温损伤）。2病理科接收与验收流程2.1信息核对-核对内容：接收标本时，需对照病理申请单与标本标签，逐一核对患者姓名、病历号、标本类型、采集日期、部位及数量；确保信息一致，避免“张冠李戴”。-异常处理：若信息不符（如标签模糊、申请单与标本信息不一致），需立即联系临床科室核实，确认无误后方可接收；若无法核实，拒绝接收并记录原因。2病理科接收与验收流程2.2样本状态检查-固定状态：观察固定液是否清澈（浑浊提示组织坏死或细菌污染）、组织是否完全浸泡于固定液中（漂浮于液面提示固定液不足）；轻触组织质地，判断固定是否充分（固定充分的组织质地略硬，固定不足则柔软）。-样本完整性：检查标本是否有挤压、干燥、破碎（如活检标本被镊子夹变形）；若存在上述情况，需记录并通知临床重新采集。2病理科接收与验收流程2.3验收记录与签收-登记备案：在病理科标本登记系统中详细记录标本信息（包括接收时间、标本状态、送检科室、接收人员），并由双方（病理科与临床科室）签字确认。-不合格标本处理：对于固定不足、信息不符、样本损坏的标本，需在24小时内反馈至临床科室，说明原因并要求重新采集；对于无法重新采集的珍贵标本（如晚期患者仅有的活检组织），需与临床沟通，在充分告知风险后，尝试按“固定不足”流程处理（如延长固定时间、优化抗原修复）。05样本处理：从组织块到病理切片的标准化流程样本处理：从组织块到病理切片的标准化流程接收合格的标本需经过取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤，制成用于HE染色及免疫组化（IHC）检测的病理切片。每一步骤均需标准化操作，确保切片质量满足HER2检测要求。1取材与组织修整1.1取材原则-代表性：选取肿瘤细胞密集区域（HE染色镜下确认，肿瘤细胞含量>50%），避免坏死、纤维化区域；对于肿瘤异质性明显的病例，需选取不同部位（如中心、边缘）分别取材。-方向性：组织块需与胃壁垂直切取（便于观察肿瘤浸润深度）；对于黏膜下浸润型肿瘤，需包含黏膜层、黏膜下层及肌层。-尺寸控制：组织块大小为1.5cm×1.5cm×0.3cm（过厚不利于脱水，过薄易破碎）；若组织块过大（如>2cm），可分割为多个小组织块。1取材与组织修整1.2组织修整-去除多余组织：剔除脂肪、结缔组织（这些组织不含肿瘤细胞，会稀释HER2阳性信号）；修剪破碎组织，确保组织块边缘整齐。-标记方向：对于手术标本，可在组织块一端做标记（如用刀尖切一小角），便于后续包埋时确定组织方向（确保切片中肿瘤细胞最大面积暴露）。2脱水与透明2.1脱水流程-目的：去除组织中的水分，为后续透明、浸蜡做准备。-步骤：组织块依次置于梯度乙醇中（70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ），每级乙醇处理1-2小时（具体时间根据组织块大小调整）。-注意事项：-乙醇浓度需准确（使用无水乙醇配制，避免因乙醇吸潮导致浓度下降）；-更换乙醇时需彻底（避免前一级乙醇残留，影响脱水效果）；-70%乙醇可用于短期保存（若当天无法完成脱水，可置于70%乙醇中4℃保存，不超过24小时）。2脱水与透明2.2透明流程-目的：用透明剂（二甲苯）置换乙醇，使组织呈现透明状态，便于石蜡渗透。-步骤：组织块依次置于二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，各30-60分钟（至组织完全透明，呈无色透明状）。-注意事项：-二甲苯需无水（避免水分残留导致透明不彻底）；-通风橱内操作（二甲苯有毒性，避免吸入）；-若组织透明不彻底（呈浑浊状），可延长二甲苯处理时间或更换新鲜二甲苯。3浸蜡与包埋3.1浸蜡流程-目的：用石蜡（熔点54-60℃）置换二甲苯，使组织石蜡化，便于包埋。-步骤：组织块依次置于石蜡Ⅰ（54℃）→石蜡Ⅱ（60℃），各1-2小时（至组织内无气泡，石蜡完全渗透）。-注意事项：-石蜡需新鲜（避免重复使用，因石蜡中可能残留水分或杂质）；-浸蜡温度不宜过高（>60℃会导致组织变硬，切片困难）。3浸蜡与包埋3.2包埋操作-目的：将浸蜡后的组织块包埋在石蜡中，形成蜡块，便于切片。-步骤：1.将熔化的石蜡倒入包埋模具中；2.用镊子将组织块放入模具中，调整方向（标记端朝上或朝下，确保切片时组织方向正确）；3.室温冷却至石蜡凝固（约10-15分钟），取出蜡块，修整边缘（使蜡块平整，便于夹持）。-注意事项：-避免产生气泡（组织块放入石蜡时需缓慢，轻震模具排出气泡）；-包埋模具需清洁（避免残留石蜡导致蜡块粘连）。4切片与展片4.1切片要求-切片厚度：3-4μm（过厚（>5μm）会导致抗原暴露不充分，过薄（<2μm）易造成切片破损，影响染色效果）。-切片工具：使用一次性刀片（避免重复使用导致刀刃不锋利，产生切片皱褶）；切片时需调整切片机参数（如切片速度、防脱片装置）。-切片方向：沿组织块最大面切片（确保肿瘤细胞充分暴露）；若组织块较小，可采用连续切片（3-5张）用于HE染色及后续IHC检测。4切片与展片4.2展片与捞片-展片：将切片置于40-45℃的温水展片槽中（水温不宜过高，导致组织收缩），用镊子轻展切片，去除皱褶；-捞片：将洁净的载玻片以45角浸入水中，捞取切片（避免产生气泡）；捞片后立即标记（如用铅笔在载玻片一端标注患者信息）。4切片与展片4.3切片干燥与保存-干燥：将载玻片置于60℃烤箱中干燥1-2小时（使切片牢固附着于载玻片，避免染色时脱落）；-保存：干燥后的切片可在室温下保存（需防潮、避光），但建议在1周内完成染色（长时间存放可能导致抗原降解）。06质量控制与常见问题处理：确保检测结果可靠性的“双保险”质量控制与常见问题处理：确保检测结果可靠性的“双保险”质量控制贯穿样本前处理全流程，通过室内质控与室间质控相结合，及时发现并纠正操作偏差；同时，针对常见问题制定处理方案，最大限度减少误差。1室内质量控制1.1试剂与设备质控-试剂质控：定期检查固定液、乙醇、二甲苯、石蜡等试剂的浓度、有效期及质量（如固定液pH需每周检测一次，保持在7.0-7.4）；免疫组化抗体（HER2抗体）需在有效期内使用，每次实验设置阳性对照（已知HER2阳性胃癌组织）与阴性对照（已知HER2阴性胃癌组织）。-设备质控：切片机需定期校准（确保切片厚度准确）；脱水机、包埋机需每日检查运行参数（如温度、时间）；烤箱需定期校准温度（确保干燥效果）。1室内质量控制1.2操作过程质控-标准化操作流程（SOP）：制定详细的样本前处理SOP，明确每个步骤的操作参数（如固定时间、脱水时间、切片厚度），并定期对技术人员进行培训与考核。-切片质量评估：每日抽取10%的切片进行质量评估，包括切片厚度（显微镜下测量）、完整性（无皱褶、无破损）、染色效果（HE染色细胞结构清晰）。2室间质量评价-参加外部质评：每年至少参加2次国家级或省级病理质评（如国家卫健委病理质控中心组织的HER2检测质评），与其他实验室对比检测结果，及时发现系统性误差。-结果反馈与改进：对质评不合格结果进行原因分析（如固定不足、切片过厚），制定改进措施（如延长固定时间、调整切片机参数），并跟踪改进效果。3常见问题与处理方案3.1切片皱褶或破碎-原因：切片刀不锋利、切片速度过快、展片水温过高。-处理：更换新的切片刀，调整切片速度至3-5mm/s；展片水温控制在40-45℃，避免高温导致组织收缩。3常见问题与处理方