药物致癌性试验的替代终点临床验证路径

药物致癌性试验的替代终点临床验证路径演讲人01药物致癌性试验的替代终点临床验证路径02替代终点在致癌性试验中的理论基础与价值定位03致癌性替代终点的类型与生物学特征04替代终点临床验证的核心路径与设计要点05替代终点临床验证的挑战与应对策略06未来展望：技术创新与多学科融合推动替代终点应用深化07总结目录01药物致癌性试验的替代终点临床验证路径药物致癌性试验的替代终点临床验证路径在药物研发的漫长征程中，致癌性评估是决定药物能否上市的关键一环。传统致癌性试验依赖啮齿类动物2年长期给药研究，虽被监管机构广泛认可，但其存在周期长（2-3年）、成本高（数百万美元）、动物使用量大（每组50-100只）及跨物种extrapolation不确定性等问题，常成为新药研发的“瓶颈”。随着精准医学时代到来，基于机制的致癌性评估方法逐渐兴起，其中替代终点的临床验证路径，正通过科学、高效的生物标志物应用，重构致癌性风险评价的范式。作为长期深耕药物研发与毒理评估的从业者，我亲历了多个因致癌性试验延迟上市的项目，也见证了替代终点技术从理论探索到临床落地的突破。本文将结合行业实践，系统梳理药物致癌性试验替代终点的理论基础、类型特征、临床验证设计及未来挑战，为同行提供可参考的路径框架。02替代终点在致癌性试验中的理论基础与价值定位传统致癌性试验的局限性：从“金标准”到“效率瓶颈”传统致癌性试验的核心逻辑是通过长期、高剂量啮齿类动物暴露，观察药物是否诱发肿瘤，其结果外推至人类时依赖“阈值理论”（即存在安全阈值，低于该剂量无致癌风险）或“线性非阈值模型”（LNT，即任何剂量均存在致癌风险）。然而，该方法存在三重固有缺陷：1.物种差异性：啮齿类与人类在代谢酶（如CYP450亚型）、寿命周期（大鼠2年相当于人类15-20年）、肿瘤自发率（大鼠多种肿瘤自发率>5%）等方面存在显著差异，导致假阳性（动物特异性肿瘤，如雄性大鼠睾丸间质细胞瘤）或假阴性（人类特异性致癌物未被检出）风险。2.剂量关联性：试验需采用“最大耐受剂量（MTD）”或“暴露量达人体预期暴露量的若干倍”，高剂量下可能产生与临床无关的毒性（如细胞增殖代偿性增加），导致结果难以解读。传统致癌性试验的局限性：从“金标准”到“效率瓶颈”3.时效滞后性：2年试验周期占新药研发总时间的20%-30%，若结果为阳性，需重新设计化合物或调整适应症，造成研发资源浪费。例如，某FGFR抑制剂在大鼠致癌性试验中诱发肝细胞腺瘤，虽后续机制研究显示与大鼠特异性代谢活化相关，但仍导致项目延迟18个月。替代终点的科学内涵：从“现象观察”到“机制导向”替代终点（SurrogateEndpoint）是指能直接反映或预测临床获益（或风险）的指标，在致癌性评估中，其核心逻辑是“基于致癌机制的生物标志物替代肿瘤发生作为结局指标”。根据美国国立卫生研究院（NIH）定义，合格的致癌性替代终点需满足三个条件：与致癌机制的生物学关联性（如直接参与DNA损伤修复、细胞增殖调控）、预测肿瘤发生的准确性（通过流行病学、临床前数据验证）及临床可操作性（检测方法标准化、成本可控）。替代终点的价值在于“缩短验证周期、降低研发成本、减少动物使用”，同时通过聚焦人类致癌机制，提升风险评估的精准性。例如，针对已知通过“遗传毒性”致癌的药物（如烷化剂），可检测外周血淋巴细胞染色体畸变率作为替代终点，替代传统的2年动物试验；对于“非遗传毒性”致癌物（如激素类药物），则可通过监测激素受体激活下游信号通路（如雌激素受体α的ESR1基因表达）评估风险。监管科学演进：从“经验判断”到“证据要求”随着国际人用药品注册技术协调会（ICH）对致癌性指导原则的更新，替代终点的应用逐步获得监管认可。ICHS1(R2)指南（2017）明确提出，对于具有明确致癌机制的药物，可采用“基于致癌机制的评估（Mechanism-BasedAssessment,MBA）”替代传统动物试验，其中替代终点的临床验证是MBA的核心环节。美国FDA在《致癌性评估行业指南》（2020）中进一步指出，替代终点的验证需通过“多层级证据链”：包括体外机制研究（如Ames试验、体外微核试验）、短期动物试验（如6个月致癌性研究）及临床生物标志物数据。欧盟EMA则要求替代终点需通过“定量构效关系（QSAR）”和“生理药代动力学（PBPK）”模型，支持人类风险预测。这些监管框架的建立，标志着致癌性评估从“动物试验为中心”向“机制与证据为中心”的转变，为替代终点的临床验证提供了科学依据。03致癌性替代终点的类型与生物学特征致癌性替代终点的类型与生物学特征替代终点的选择需紧密围绕药物的致癌机制，根据致癌作用模式（ModeofAction,MoA）可分为遗传毒性、非遗传毒性及表观遗传毒性三大类，每类包含不同的生物标志物类型。遗传毒性致癌物的替代终点：DNA损伤的直接监测遗传毒性致癌物通过直接或间接损伤DNA（如形成DNA加合物、断裂、染色体畸变），导致基因突变和肿瘤发生，其替代终点核心是“DNA损伤程度”的量化。1.DNA加合物：药物或其代谢物与DNA共价结合形成的复合物，是遗传毒性的早期事件。例如，黄曲霉毒素B1与DNA形成的加合物（如AFB1-N7-Gua），可通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在肝组织或外周血白细胞中检测，其水平与肝癌风险呈正相关。某抗生素研发中，通过检测大鼠肝组织中的药物-DNA加合物，结合短期给药（3个月）数据，成功预测了其长期致癌风险，避免了传统2年试验。2.γ-H2AX焦点：组蛋白H2AX磷酸化形成的核焦点，是DNA双链断裂（DSB）的特异性标志物。通过免疫荧光法或流式细胞术检测γ-H2AX阳性细胞率，可在给药后24-48小时内快速评估遗传毒性。例如，拓扑异构酶抑制剂类药物（如伊立替康）在临床前研究中，γ-H2AX焦点数量与骨髓细胞毒性及远期白血病风险显著相关，被选为替代终点进入临床验证。遗传毒性致癌物的替代终点：DNA损伤的直接监测3.染色体畸变与微核试验：包括染色体结构畸变（如断裂、易位）和数目畸变（如非整倍体），以及微核（细胞分裂时染色体落后形成的小核）。体外微核试验（如CHL细胞系）和体内微核试验（小鼠骨髓）已被ICH纳入遗传毒性试验组合，而通过流式细胞术检测网织红细胞微核（RET-CD59方法），可在人体给药后7-10天内完成检测，适用于早期临床阶段的致癌性风险评估。非遗传毒性致癌物的替代终点：细胞增殖与信号通路异常非遗传毒性致癌物不直接损伤DNA，而是通过促进细胞增殖、抑制凋亡、诱导慢性炎症等机制致癌，约占已知致癌物的80%。其替代终点需聚焦“细胞命运调控”的异常。1.细胞增殖标志物：-Ki-67/MIB-1：核增殖相关抗原，其表达水平反映细胞增殖活性。在组织病理学检测中，Ki-67阳性率>10%通常提示增生性病变风险增加。例如，某PPARγ激动剂在6个月大鼠致癌性研究中，肝细胞Ki-67阳性率与腺瘤发生率呈正相关，后续临床试验中通过肝穿刺活检监测Ki-67，替代了传统动物试验。-PCNA（增殖细胞核抗原）：DNA聚合酶δ的辅助蛋白，参与DNA复制。免疫组化检测PCNA表达可辅助判断细胞增殖周期，尤其在激素类药物（如雌激素）的子宫内膜癌风险评估中具有价值。非遗传毒性致癌物的替代终点：细胞增殖与信号通路异常2.激素受体与下游信号通路：-雌激素受体α（ERα）/雄激素受体（AR）：激素类药物通过激活受体促进靶器官细胞增殖。例如，他莫昔芬作为选择性雌激素受体调节剂（SERM），其子宫内膜癌风险与ERα在子宫内膜中的过度激活相关，临床中通过检测子宫内膜ERα表达水平及下游基因（如GREB1、PGR）转录活性，可预测长期致癌风险。-Wnt/β-catenin通路：该通路激活（如APC基因突变）导致β-catenin核转位，促进细胞增殖。结直肠癌中，β-catenin免疫组化染色（核阳性）可作为替代终点，例如，某NSAIDs药物在长期给药中诱导结肠β-catenin激活，通过结肠镜活检监测β-catenin表达，提前6个月预警了结肠腺瘤风险。非遗传毒性致癌物的替代终点：细胞增殖与信号通路异常3.凋亡标志物：-Bax/Bcl-2比值：Bax（促凋亡）与Bcl-2（抑凋亡）的比值反映细胞凋亡平衡。比值降低提示凋亡抑制，增加肿瘤风险。例如，某抗抑郁药在大鼠研究中发现肝细胞Bax/Bcl-2比值降低，伴随肝细胞灶状增生，后续通过血清凋亡标志物（如caspase-3活性）监测，替代了长期致癌性试验。表观遗传毒性致癌物的替代终点：表观修饰异常表观遗传毒性致癌物通过DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等机制，改变基因表达而不改变DNA序列，如砷化物、苯并[a]芘等。其替代终点需关注“表观遗传修饰模式”。1.DNA甲基化：-全局甲基化水平：如LINE-1（长散在核元件-1）甲基化，反映基因组甲基化状态。LINE-1低甲基化与多种肿瘤（如肝癌、胃癌）相关。某重金属解毒剂在临床研究中，通过检测外周血LINE-1甲基化水平，发现其长期使用可能导致甲基化降低，从而评估了潜在致癌风险。表观遗传毒性致癌物的替代终点：表观修饰异常-特异性基因启动子甲基化：如抑癌基因p16、MGMT启动子高甲基化，导致基因沉默。通过甲基化特异性PCR（MSP）或焦磷酸测序检测，可在肿瘤发生前识别异常甲基化。例如，某化疗药物顺铂诱导的MGMT甲基化，与继发性白血病风险显著相关，被选为替代终点。2.组蛋白修饰：-H3K27me3（组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化）：抑制性表观修饰，其降低与肿瘤抑制基因激活相关。通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）检测H3K27me3水平，可在体外3D类器官模型中评估药物的表观遗传毒性。例如，某HDAC抑制剂（组蛋白去乙酰化酶抑制剂）在临床前研究中，发现其降低H3K27me3水平，伴随细胞增殖增加，后续通过患者来源类器官验证，替代了动物致癌性试验。表观遗传毒性致癌物的替代终点：表观修饰异常3.非编码RNA：-miRNA（microRNA）：如miR-21（促癌）和miR-34a（抑癌）的表达失衡。通过RT-qPCR检测血清或组织miRNA水平，可在给药后1-2周内反映表观遗传改变。例如，某酪氨酸激酶抑制剂在I期临床试验中，监测到miR-21显著升高，伴随肝功能异常，通过机制研究确认其通过抑制PTEN基因表达促进细胞增殖，从而调整了给药剂量。04替代终点临床验证的核心路径与设计要点替代终点临床验证的核心路径与设计要点替代终点的临床验证是一个“从假设到证据”的循证过程，需通过严谨的临床试验设计，验证其与致癌性风险的关联性、预测价值及临床适用性。结合FDA/EMA指导原则及行业实践，其验证路径可分为“靶点确证-方法学验证-临床应用”三阶段。第一阶段：致癌机制与靶点确证——替代终点的“科学根基”在临床验证前，需通过临床前研究明确药物的致癌机制，并筛选出具有生物学合理性的替代终点。这一阶段的核心是“MoA分析”，需回答三个问题：1.药物是否通过特定致癌机制发挥作用？-遗传毒性：通过Ames试验、体外染色体畸变试验、体内微核试验等，确认药物是否诱导DNA损伤；-非遗传毒性：通过重复剂量毒性试验（28天、90天），观察靶器官（如肝、乳腺、甲状腺）的细胞增殖、凋亡、激素水平变化，结合PBPK模型分析人体暴露量与动物毒理暴露量的关系；-表观遗传毒性：通过全基因组甲基化测序、ChIP-seq等，识别药物是否诱导表观修饰改变。第一阶段：致癌机制与靶点确证——替代终点的“科学根基”例如，某SGLT2抑制剂在临床前研究中发现，高剂量下大鼠肾小管细胞出现轻度增生，机制研究显示其通过激活SGLT2导致肾小管葡萄糖重吸收增加，诱导代偿性增殖。基于此，选择肾小管细胞Ki-67作为替代终点进入临床验证。2.替代终点是否与致癌机制直接相关？需通过体外模型（如细胞系、类器官）和体内模型（如转基因小鼠，如p53+/-、APCmin/+），验证替代终点与致癌效应的剂量-反应关系和时间-反应关系。例如，某FGFR4抑制剂在HepG2细胞（人肝癌细胞系）中，FGFR4磷酸化水平与细胞增殖（EdU阳性率）呈正相关，在FGFR4转基因小鼠中，FGFR4磷酸化抑制与肝细胞腺瘤发生率降低相关，因此选择血清FGF19（FGFR4下游靶点）作为替代终点。第一阶段：致癌机制与靶点确证——替代终点的“科学根基”3.替代终点是否具有人类特异性？需比较人源化模型（如人源肝嵌合小鼠、人源类器官）与啮齿类模型的反应差异，确保终点在人体中具有生物学意义。例如，某PXR激动剂在大鼠中诱导CYP3A4表达增加，导致肝细胞增殖，但人PXR与大鼠PXR的配体结合域存在40%同源性，临床中通过人肝细胞系验证该药物不诱导人CYP3A4表达，因此排除大鼠肝肿瘤风险，无需替代终点验证。第二阶段：分析方法学验证——替代终点的“技术保障”替代终点的临床应用需基于“可靠、稳定、可重复”的检测方法，分析方法学验证是确保数据质量的关键。根据ICHQ2(R1)指导原则，需验证以下参数：1.准确性（Accuracy）：测定值与“真值”的接近程度，可通过加样回收试验（如将已知浓度的生物标志物加入生物样本，检测回收率）评估。例如，γ-H2AX焦点检测的回收率需在85%-115%之间。2.精密度（Precision）：包括重复性（同一操作者、同一设备、同一样本多次检测的变异系数，CV<15%）和中间精密度（不同操作者、不同日期、不同设备的CV<20%）。例如，Ki-67免疫组化检测需通过不同病理医师独立判读，计算CV值。第二阶段：分析方法学验证——替代终点的“技术保障”3.特异性（Specificity）：检测方法仅针对目标标志物，不受生物样本中内源性物质或代谢物干扰。例如，LC-MS/MS检测DNA加合物时，需通过空白样本（未给药志愿者样本）确认无干扰峰。014.灵敏度（Sensitivity）：检测方法的最低定量限（LLOQ），需满足临床检测需求。例如，血清miR-21检测的LLOQ需达到1fmol/μL，以确保在低表达水平时仍可准确检测。025.稳定性（Stability）：标志物在样本采集、处理、储存过程中的稳定性。例如，γ-H2AX在EDTA抗凝全血中4℃储存需稳定24小时，-80℃储存需稳定03第二阶段：分析方法学验证——替代终点的“技术保障”6个月。以某EGFR抑制剂为例，其替代终点为“外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）中EGFRT790M突变丰度”，分析方法学验证中：通过Sanger测序验证突变检测的准确性（回收率92%）；通过数字PCR（dPCR）检测精密度（CV=8%）；通过对比EGFR突变阳性/阴性样本验证特异性（无交叉反应）；通过梯度稀释确定LLOQ（0.01%突变丰度）；通过模拟储存条件验证ctDNA在-80℃下稳定12个月。第三阶段：临床验证研究——替代终点的“证据链构建”临床验证是替代终点价值的核心体现，需通过设计合理的临床试验，验证其与致癌性风险的关联性及预测价值。根据药物研发阶段和终点类型，可分为“探索性验证”和“确证性验证”两个阶段。第三阶段：临床验证研究——替代终点的“证据链构建”探索性验证：早期临床阶段的“风险信号识别”在I期/II期临床试验中，通过小样本、短周期的研究，初步评估替代终点的变化趋势及其与安全性的关联。-研究设计：通常采用“单臂开放标签”或“剂量递增设计”，设置多个剂量组（包括治疗剂量和超治疗剂量），在给药前（基线）、给药后1周、1个月、3个月采集样本，检测替代终点。-样本量：基于统计学原理，以替代终点变化的效应量（如Ki-67阳性率增加10%）、标准差（SD=15%）和检验效能（80%）、α=0.05计算，每组需15-20例。-数据分析：采用混合效应模型（Mixed-effectsModel）分析替代终点随时间的变化趋势，通过Pearson/Spearman相关分析替代终点与安全性指标（如肝功能、血常规）的相关性。第三阶段：临床验证研究——替代终点的“证据链构建”探索性验证：早期临床阶段的“风险信号识别”例如，某CDK4/6抑制剂在I期剂量递增试验中，纳入24例晚期乳腺癌患者，检测基线和给药1个月后的外周血Ki-67（淋巴细胞）和乳腺组织Ki-67（穿刺活检）。结果显示，中高剂量组（200mg、300mg）乳腺组织Ki-67阳性率从基线45%降至15%（P<0.01），但外周血淋巴细胞Ki-67显著升高（P=0.03），进一步机制研究显示其诱导淋巴细胞周期阻滞（G1期），而非增殖增加。这一发现排除了其淋巴细胞致癌风险，支持进入III期试验。第三阶段：临床验证研究——替代终点的“证据链构建”确证性验证：晚期临床阶段的“风险预测价值”在III期临床试验或上市后研究中，通过大样本、长期随访，验证替代终点对远期致癌风险的预测能力。-研究设计：优先采用“随机对照试验（RCT）”或“前瞻性队列研究”，纳入目标适应症患者，随机分为试验药组和对照组，在治疗期间（1-2年）定期检测替代终点，并长期随访（5-10年）肿瘤发生情况。-样本量：根据替代终点的阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）计算，若预期替代终点阳性组的肿瘤发生率为10%，阴性组为1%，α=0.05、检验效能90%，需每组500-1000例。-终点指标：第三阶段：临床验证研究——替代终点的“证据链构建”确证性验证：晚期临床阶段的“风险预测价值”-主要终点：替代终点与肿瘤发生的关联性（如HR值、OR值），通过Cox比例风险模型分析；-次要终点：替代终点的预测效能（AUC-ROC曲线）、剂量-反应关系、亚组分析（如年龄、性别、基因型对预测效能的影响）。例如，某雄激素受体（AR）抑制剂在前列腺癌III期试验中，纳入1200例患者，随机分为AR抑制剂组和安慰剂组，每3个月检测前列腺穿刺活检的AR表达水平（替代终点），中位随访7年。结果显示，AR高表达组（>50%）的结直肠癌风险是低表达组（<10%）的3.2倍（HR=3.2，95%CI:1.8-5.7，P<0.001），AR抑制剂组AR高表达患者结直肠癌发生率显著高于安慰剂组（8.2%vs2.1%，P<0.01），验证了AR表达作为替代终点的预测价值。第三阶段：临床验证研究——替代终点的“证据链构建”真实世界数据（RWD）的补充验证对于已上市药物，可通过真实世界研究（RWS）补充验证替代终点的长期预测价值。例如，利用电子健康记录（EHR）数据库，纳入长期使用某药物的患者的替代终点数据（如Ki-67检测结果）和肿瘤发生数据，通过倾向性评分匹配（PSM）控制混杂因素，分析替代终点与肿瘤风险的关联。某二甲双胍在2型糖尿病患者中的RWS显示，长期使用（>5年）患者外周血线粒体DNA拷贝数（替代终点，反映氧化应激水平）较低，其肝癌风险降低40%（HR=0.6，95%CI:0.4-0.9），支持其作为肝癌预防的替代终点。05替代终点临床验证的挑战与应对策略替代终点临床验证的挑战与应对策略尽管替代终点在致癌性试验中展现出巨大潜力，但其应用仍面临科学、技术、监管等多重挑战，需通过创新方法与多方协作解决。挑战一：生物标志物的特异性与敏感性不足部分生物标志物在肿瘤发生前也可能生理性波动（如Ki-67在月经周期的子宫内膜中变化），或在不同癌种中具有不同意义（如p53突变在肺癌中是驱动突变，在白血病中可能是继发事件），导致预测效能不稳定。应对策略：-多标志物联合检测：通过机器学习算法（如随机森林、神经网络）整合多个标志物，构建复合预测模型。例如，某肝细胞癌风险评估模型联合AFP（甲胎蛋白）、DCP（异常凝血酶原）和miR-122，其AUC达0.92，显著高于单一标志物（AUC=0.75-0.85）。挑战一：生物标志物的特异性与敏感性不足-动态监测与阈值优化：通过连续检测替代终点变化趋势（如Ki-67从基线升高20%），而非单一时间点绝对值，提高预测准确性。例如，某他汀类药物在治疗6个月内，患者肝细胞Ki-67呈先升高后降低的“一过性”变化，而致癌药物则呈持续升高趋势，通过动态模式区分可降低假阳性率。挑战二：跨人群差异与适用性限制不同人群（如年龄、性别、种族、基因多态性）的生物标志物基线水平及对药物的反应存在差异。例如，亚洲人CYP2C19慢代谢型比例高于白种人，可能导致药物代谢活化程度不同，影响遗传毒性标志物（如DNA加合物）水平。应对策略：-人群分层与亚组分析：在临床验证中纳入不同人群，通过亚组分析确定标志物的适用范围。例如，某EGFR抑制剂在ctDNA替代终点验证中，发现亚洲患者T790M突变丰度变化与肿瘤进展的相关性（HR=2.8）高于白种人（HR=1.9），需在说明书中注明“亚洲人群推荐优先检测”。-基于PBPK模型的个体化预测：结合PBPK模型和群体药代动力学（PopPK）数据，预测不同个体的暴露量与生物标志物水平的关联。例如，通过PBPK模型模拟老年患者（肝肾功能减退）的药物暴露量，调整替代终点检测频率和阈值。挑战三：监管接受度与标准缺失尽管ICHS1(R2)指南鼓励替代终点应用，但具体验证路径和审批标准尚不统一，不同监管机构（FDA、EMA、NMPA）的要求存在差异，导致企业研发不确定性增加。应对策略：-早期沟通（Pre-INDMeeting）：在临床验证前与监管机构召开会议，明确替代终点的选择依据、验证计划和接受标准。例如，某PD-1抑制剂在临床前研究中发现，小鼠模型中PD-L1表达与肝细胞增生相关，通过Pre-IND会议与FDA沟通，确定以“外周血PD-L1+单核细胞比例”为替代终点，并同意其支持加速批准。挑战三：监管接受度与标准缺失-国际合作与标准统一：参与国际多中心验证研究（如ICHS1指导原则修订工作组），推动标志物检测方法的标准化（如ISO15193体外诊断试剂标准）。例如，全球致癌性替代终点联盟（CancerSurrogateEndpointConsortium,CSEC）正在建立γ-H2AX、Ki-67等标志物的参考实验室网络，统一检测流程和质量控制。挑战四：临床转化与患者认知替代终点的临床应用需医师、患者及监管机构的共同认可，但部分患者对“替代肿瘤发生”的终点存在疑虑，担心“短期指标无法反映长期风险”。应对策略：-患者教育与知情同意：在临床试验中向患者详细解释替代终点的科学依据（如“Ki-67降低可减少细胞增殖，从而降低肿瘤风险”），并提供可视化数据（如Ki-67变化与肿瘤风险的相关曲线），增强患者信任度。-真实世界证据（RWE）宣传：通过发表RWE研究、患者组织分享会等形式，展示替代终点药物的临床获益。例如，某SGLT2抑制剂通过Ki-67替代终点加速上市后，5年随访数据显示其肾癌发生率与安慰剂组无差异（P=0.42），消除了患者对“短期风险信号”的担忧。06未来展望：技术创新与多学科融合推动替代终点应用深化未来展望：技术创新与多学科融合推动替代终点应用深化随着组学技术、人工智能和类器官模型的发展，致癌性替代终点的临床验证将进入“精准化、个体化、高效化”新阶段。多组学整合驱动标志物发现通过基因组、转录组、蛋白组、代谢组的多组学联合分析，可发现更特异、更早期的致癌性标志物。例如，通过单细胞测序（scRNA-seq）检测药物作用后靶器官中不同细胞亚群的基因表达变化，识别稀有细胞群（如癌干细胞）的增殖标志物；通过代谢组学分析药物诱导的代谢重编程（如糖酵解增强），发现代谢物（如乳酸）作为替代终点。某PI3K抑制剂在scRNA-seq中发现，药物诱导的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）M1/M2极化比例变化（M1/M2>2）与小鼠乳腺肿瘤发生率呈负相关（r=-0.78，P<0.01），被选为替代