DB45∕T 1665-2018 药用植物繁殖体超低温保存技术指南

ICS65.020.20药用植物繁殖体超低温保存技术指南Techinicalguideofmedicinalplantspropagulecryop广西壮族自治区质量技术监督局发布I前言 II 12规范性引用文件 13术语和定义 14基本原则 2 26材料准备 2 冷冻前处理 冷冻 生活力检测 前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区卫生和计划生育委员会提出。本标准由广西卫生标准化技术委员会归口。本标准起草单位：广西壮族自治区药用植物园。本标准主要起草人：缪剑华、韦坤华、朱艳霞、李翠、林杨、黄燕芬、李林轩、谷筱玉、董扬。1药用植物繁殖体超低温保存技术指南本标准规定了药用植物繁殖体超低温保存技术的术语和定义、基本原则、基本程序、材料准备、冷冻前处理、冷冻和生活力检测。本标准适用于广西境内药用植物繁殖体的超低温保存。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1药用植物繁殖体vegetativeformofmedicinalplants能通过有性繁殖或无性繁殖方式能繁衍产生药用植物后代的材料，包括有性繁殖体种子、孢子体、花粉等，无性繁殖体根、休眠芽、茎尖分生组织、悬浮细胞、愈伤组织、原生质体等。3.2超低温保存cryopreservation在液氮液相（-196℃)或液氮雾相（-150℃)中对生物器官、组织或细胞等材料进行长期保存。在适宜条件下解冻可恢复活力，繁殖、再生出新的植株，并保持原遗传特性。3.3冷冻保护剂cryoprotectant可以保护生物器官、组织或细胞等材料免受冷冻损伤的物质，常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜、蔗糖、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、甘油、聚乙二醇等。3.4玻璃化法vitrification在超低温保存过程中，利用高浓度的冷冻保护剂处理生物器官、组织或细胞，使液态材料在降温过程中逐渐变成高度粘滞状的、似玻璃状的、非晶体固体状态的方法。23.5生活力viability繁殖体潜在的繁殖能力和其所具有的生命力，即一批繁殖体中具有生命力的（即活的）繁殖体数目占总数的百分率。4基本原则4.1本标准为药用植物繁殖体超低温保存通用技术，具体的某一种药用植物或某一类繁殖体材料在进行超低温保存之前，都应进行试验研究，并制定出相应的操作处理程序手册。4.2超低温保存过程中液氮的质量检验按GJB2253A的规定执行。4.3超低温保存过程中液氮生物容器的技术要求和检验规格按GB/T5458的规定执行。5基本程序5.1可直接冷冻的繁殖体超低温保存时应遵循的操作流程参见图1。5.2需包埋预处理的繁殖体超低温保存时应遵循的操作流程参见图2。图1药用植物繁殖体直接超低温保存技术流程图图2药用植物繁殖体包埋法超低温保存技术流程图6材料准备6.1采集宜在晴天上午9～10点，选择健壮、无病虫危害的繁殖体。36.2记录每份繁殖体材料记录品种、采集编号、采集地点、采集时间、采集人等，建立信息档案。6.3预处理将采回的繁殖体清水清洗去除表面污垢，装进1.8mL聚乙烯冷冻管中，冰水浴条件下加入预冷至0℃的冷冻保护剂，保护剂的量以淹没繁殖体为宜，在0℃冰浴中处理60min。7冷冻前处理7.1干燥7.1.1直接干燥方法主要应用于种子、合子胚、顽拗型种子和中间型种子离体胚轴等繁殖体的超低温保存。一般放置在15℃、相对湿度15％的干燥环境中脱水，或与变色硅胶、无水氯化钙混合快速脱水。正常型种子可以脱水至含水量510耐超干种子含水量可低于5％。7.1.2包埋干燥法主要应用于珠芽、茎尖、悬浮细胞和体细胞胚等繁殖体的超低温保存。将繁殖体用海藻酸盐包埋成球后，在加有冷冻保护剂的营养培养基中预培养一定时间，再置于流动的无菌空气流或硅胶中进行脱水，使含水量降至20％左右（以鲜重为基础）。7.1.3预培养干燥法主要应用于根茎、鳞茎、块茎、珠芽、枝条、愈伤组织等繁殖体的超低温保存。将繁殖体在加有冷冻保护剂的营养培养基中预培养一定时间，然后在无菌空气流或硅胶中进行干燥脱水，使含水量降至20％左右（以鲜重为基础）。7.2玻璃化法7.2.1直接玻璃化法将繁殖体材料用高浓度冷冻保护剂进行脱水处理后直接投入液氮，使材料连同保护剂发生玻璃化转变，进入玻璃态。7.2.2包埋玻璃化法将包埋脱水法和直接玻璃化法相结合。繁殖体首先用藻酸盐包埋成球，然后用玻璃化溶液进行脱水处理。8.1降温冷冻用移液管吸去经过冷冻前处理的繁殖体中的冷冻保护剂，将材料置于冻存管中，加入新的冷冻保护剂，拧紧盖子，将冷冻管装入程序降温盒（降温速度约为1℃/min放置在-80℃超低温冰箱内，过夜后取出冷冻管并迅速投入液氮中进行冷冻。48.2超低温冷冻将经过降温冷冻处理后的材料投入液氮蒸汽相(-150℃~-180℃)或液态氮(-196℃)中。一般种子贮藏在液氮蒸汽相中，其他繁殖材料贮藏在液态氮中。9生活力检测9.1初始生活力检测9.1.1检测时间超低温保存1d～7d，解冻一个管，检测其初始生活力，以估计保存样品的预期恢复率并确定保存数量。如果初始活力高于30则可进行液氮超低温长期保存，否则需重新选择材料保存。9.1.2解冻方法在38℃~40℃水浴条件下快速解冻