【《PET的生物降解技术研究国内外文献综述》4800字】

PET的生物降解技术研究国内外文献综述目录TOC\o"1-3"\h\u21300PET的生物降解技术研究国内外文献综述 1103431.1PET水解酶的概述 1276571.2PET水解酶的研究进展 242551.3PET水解产物的分析方法 6268461.4PET水解酶的活性测定方法 71.1PET水解酶的概述聚对苯二甲酸乙二酯（PET）是世界上生产最多的聚酯塑料之一。我们生活中的大多数产品均由PET制造，如一次性饮料瓶，衣服，包装和地毯。由于PET中酯键的可接近性有限，PET难以被生物解聚ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[8]。过去几年报道了多种可催化PET水解的酶，这些酶是有望替代传统化学回收手段的生物催化剂ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wei</Author><Year>2017</Year><RecNum>418</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[9]</style></DisplayText><record><rec-number>418</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rffpp522x55v2vesfz5xpwt8z92xvdzzze2d"timestamp="1543388840">418</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wei,R.</author><author>Zimmermann,W.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMicrobiologyandBioprocessTechnology,InstituteofBiochemistry,LeipzigUniversity,Johannisallee21-23,04103,Leipzig,Germany.</auth-address><titles><title>Biocatalysisasagreenrouteforrecyclingtherecalcitrantplasticpolyethyleneterephthalate</title><secondary-title>MicrobBiotechnol</secondary-title></titles><periodical><full-title>MicrobBiotechnol</full-title></periodical><pages>1302-1307</pages><volume>10</volume><number>6</number><edition>2017/04/13</edition><keywords><keyword>Bacteria/enzymology/genetics/*metabolism</keyword><keyword>Biocatalysis</keyword><keyword>Biodegradation,Environmental</keyword><keyword>GreenChemistryTechnology</keyword><keyword>Plastics/*metabolism</keyword><keyword>PolyethyleneTerephthalates/*metabolism</keyword><keyword>Recycling</keyword></keywords><dates><year>2017</year><pub-dates><date>Nov</date></pub-dates></dates><isbn>1751-7915(Electronic) 1751-7915(Linking)</isbn><accession-num>28401691</accession-num><urls><related-urls><url>/pmc/articles/PMC5658586/</url></related-urls></urls><custom2>PMC5658586</custom2><electronic-resource-num>10.1111/1751-7915.12714</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[9]。据报道，这些酶多存在于腐生菌ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[10,11]或植物病原生物（包括真菌和细菌）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[12-14]中，抑或是存在于富含植物性有机物质或塑料碎片的环境中，在极端情况下可利用PET为细胞生长的主要碳源。目前，已知的所有PET水解酶均为角质酶或羧酸酯酶，它们都属于α/β-水解酶超家族，具有高度序列同一性和结构相似性，活性位点内关键残基的取代可以使PET水解酶具水解PET的能力ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[15]。迄今为止，已经鉴定出许多可水解PET的酶（PHE），表1-2总结了现已被生化表征的PHEADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[16,17]。表1-2具有已知氨基酸序列的生化表征PET水解酶（PHE）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[16,17]Table1-2BiochemicallyCharacterizedPET-hydrolyzingenzymes(PHE)withKnownAminoAcidSequence酶登记号来源脂肪酶StreptomycesexfoliatusBTA-1AJ810119.1Thermobifidafusca

DSM43793BTA-2Thermobifidafusca

DSM43793TfHWP_011291330.1Thermobifidafusca

DSM43793Tfu_0882AAZ54920.1ThermobifidafuscaYXTfu_0883AAZ54921.1ThermobifidafuscaWSH03-11TfCut1CBY05529.1ThermobifidafuscaKW3TfCut2CBY05530.1ThermobifidafuscaKW3Est1BAI99230.2ThermobifidaalbaAHK119Est119BAK48590.1ThermobifidaalbaAHK119LCCAEV21261.1MetagenomefromleafbranchcompostFsC1CEXFusariumsolani

pisiThcCut1ADV92526.1Thermobifidacellulosilytica

DSM44535ThcCut2ADV92527.1Thermobifidacellulosilytica

DSM44535Thf42_Cut1ADV92528.1Thermobifidafusca

DSM44342Tha_Cut1ADV92525.1Thermobifidaalba

DSM43185Thh_EstAFA45122.1Thermobifidahalotolerans

DSM44931TfAXEADM47605.1ThermobifidafuscaNTU22Cut1JN129499.1ThermobifidafuscaNRRLB-8184Cut2JN129500.1ThermobifidafuscaNRRLB-8184Cut190AB728484.1Saccharomonosporaviridis

AHK190HiC4OYYHumicolainsolens续表1-2酶登记号来源BsEstBADH43200.1Bacillussubtilis

4P3-11PET2C3RYL0unculturedbacteriumPET5R4YKL9Oleispiraantarctica

RB-8PET6UPI0003945E1FVibriogazogenesPET12A0A0G3BI90PolyangiumbrachysporumPETaseGAP38373.1Ideonellasakaiensis

201-F6Tcur0390CDN67546.1Thermomonosporacurvata

DSM43183Tcur1278CDN67545.1Thermomonosporacurvata

DSM431831.2PET水解酶的研究进展可水解PET的酶主要分为PET表面修饰酶和PET水解酶两类ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[17]。图1-3PET膜的图像及其与酶攻击的关系ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[18]Fig.1-3ImageofPETfilmsanditsrelevancetoenzymaticattackPET中包含非常少量的MHET环状三聚体，存在于聚合物嵌段的内部或外部。当PET表面有环状三聚体或聚合物链的任何末端/环时，它会受到各种水解酶的攻击而产生少量产物（如MHET，BHET和TPA）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[17]。PET的主体在玻璃化转变温度（Tg）以下极难被酶降解。因此，在低水平（<1~2％）下检测到MHET，BHET或TPA只能表明其对PET进行了表面改性。如果能降解PET主体，必然会释放大量的产物（1mgPET相当于约5.2μmolMHET）。许多酶（如脂肪酶，角质酶，酯酶，羧酸酯酶和木瓜蛋白酶）只能水解表面，无法降解主体，可将这些酶被归类为PET表面修饰酶。此外，将可在最佳反应温度（<65~70℃）的条件下，显著降解PET主体的酶被归类为PET水解酶（图1-3）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[17]。2016年，Yoshida等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[19]分离出的菌株（Ideonellasakaiensis201-F6），可以在30℃以无定形PET为主要碳源，实现对PET的水解。该菌株可产生两种酶：聚（对苯二甲酸乙二醇酯）水解酶（IsPETase）和单-（2-羟乙基）对苯二甲酸水解酶（IsMHETase），二者结合，可在30℃将PET降解为TPA和EG。IsPETase在30℃时的降解能力显著高于角质酶LCC，TfH和ThcCut1ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[20]。尽管近年来，IsPETase已经成为PET水解领域的研究热点，但与其他已知PET水解酶的高降解能力（总产物水平为数十毫摩尔每升）相比，它对PET的降解能力其实很低（总产物水平最高为10μM），而且耐久性差（在37℃存放12小时即会损失大部分活性）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[17]。Kawai等人认为ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[17]，目前所有已知的PET水解酶都是角质酶（表1-3）。表1-3PET水解酶ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[17]Table1-3PEThydrolases酶来源反应条件降解度（％）底物PETTfHThermobifidafuscaDSM4379355℃≈50（失重）熔压饮料瓶TfCut2变体T.fuscaKW365℃≤45（失重）无定形膜和聚酯纤维Cut190变体SaccharomonosporaviridisAHK19070℃33.6±3.0（吸收）聚酯纤维60℃59.2±2.1（吸收）PET包装袋LCC植物堆肥的基因组50~70℃≤25（失重）PET包装袋HiCHumicolainsolens70℃97±3（NaOH滴定）聚酯纤维本课题所研究的PET水解酶均为角质酶，主要包括ThcCut1、ThcCut2、TfCut2，LCC及其变体。角质酶（EC4）属于丝氨酸水解酶超家族，具有典型的催化三联体Ser-His-Asp和氧阴离子孔。角质酶能够在体外催化酯水解反应（水性环境）及大分子和小分子的酯化和酯交换反应（无水条件）ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[21]。此外，角质酶具有开放的活性口袋，没有盖子，口袋很浅，可以容纳庞大的聚酯链，并使其在催化三联体中被活性丝氨酸所利用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[17]。本课题使用的角质酶来源于不同的菌种，其中ThcCut1（GenBank：ADV92526.1）和ThcCut2（GenBank：ADV92527.1）均来源于

Thermobifidacellulosilytica

DSM44535ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[22]，TfCut2（GenBank：CBY05530.1）来源于ThermobifidafuscaKW3ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wei</Author><Year>2012</Year><RecNum>233</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[23]</style></DisplayText><record><rec-number>233</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9zf00aqp2weeefadrpz25wd5erese2tdt9"timestamp="1555250941">233</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wei,Ren</author><author>Oeser,Thorsten</author><author>Billig,Susan</author><author>Zimmermann,Wolfgang</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMicrobiologyandBioprocessTechnology,InstituteofBiochemistry,UniversityofLeipzig,Leipzig,Germany.</auth-address><titles><title>Ahigh-throughputassayforenzymaticpolyesterhydrolysisactivitybyfluorimetricdetection</title><secondary-title>BiotechnologyJournal</secondary-title></titles><periodical><full-title>BiotechnologyJournal</full-title></periodical><pages>1517-1521</pages><volume>7</volume><number>12</number><edition>2012/05/25</edition><keywords><keyword>Actinomycetales/enzymology</keyword><keyword>BacterialProteins/metabolism</keyword><keyword>Bioreactors</keyword><keyword>Biotechnology/*methods</keyword><keyword>High-ThroughputScreeningAssays/*methods</keyword><keyword>Hydrolases/*metabolism</keyword><keyword>PhthalicAcids/analysis/chemistry/metabolism</keyword><keyword>PolyethyleneTerephthalates/*chemistry/metabolism</keyword><keyword>Spectrometry,Fluorescence/*methods</keyword></keywords><dates><year>2012</year><pub-dates><date>Dec</date></pub-dates></dates><isbn>1860-6768</isbn><accession-num>WOS:000312032500012</accession-num><urls><related-urls><url>/doi/full/10.1002/biot.201200119</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1002/biot.201200119</electronic-resource-num><research-notes><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">开发了一种高通量荧光检测聚酯水解酶的活性的方法。</style></research-notes></record></Cite></EndNote>[23]，LCC（GenBank：AEV21261.1）来源于采用宏基因组学方法从叶分支堆肥中分离出的新型角质酶ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[24]。来自Thermobifida的角质酶序列都非常相似，但它们对PET的水解活性却有很大不同。有报道表示，从PET水解中释放出的产物对Thermobifida来源角质酶的活性具有抑制作用ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[25]。为解决该问题，Barth等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[26]利用超滤膜反应器连续去除抑制性水解产物，将PET水解效率提高了70%；他们还向PET降解体系中引入了可高效降解中间产物MHET的羧酸酯酶——TfcaADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[27]（SequenceID：P86325.1，来源于ThermobifidafuscaKW3），所构建出的LCC-Tfca双酶降解体系相对于LCC游离酶，将PET水解释放产物增加了104%，TfCut2-Tfca双酶体系也提高了91%ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[28]；Carniel等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[29]以相同思路构建的HiC-CALB双酶协同体系，相对于HiC体系而言，提高了7.7倍的产物量。为解除产物抑制，Wei等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[30]利用TfCut2与LCC之间的序列和结构相似性，通过改造TfCut2中参与底物结合的的部分氨基酸残基，构建了TfCut2-G62A突变体，将TfCut2的水解速率常数提高了3倍。Ribitsch等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[31]通过模型分析发现，源于嗜热菌的不同角质酶对聚酯的水解效率存在较大差异，这可能是由于不同的酶在活性位点附近的静电作用力和表面疏水性质都有所不同。因此，Ribitsch等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[32]将ThcCut1与来自Alcaligenesfaecalis的疏水结合模块PBM融合，表达出的融合酶对PET的吸附效果显著增加，PET水解活性是原生酶的4倍左右；他们还将ThcCut1与II类疏水蛋白HFB4和HFB7共价融合ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[33]，比游离酶的PET降解水平高出16倍以上；其他诱变实验也进一步证实了这种方法的有效性，研究人员对来自Thermobifidafusca、Fusariumsolanipisi和Clostridiumbotulinum角质酶活性部位附近的区域进行了突变，以提高其表面疏水性，最终所得突变体的PET水解性能得到了改善ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[21,34]。众所周知，PET自身的物理性质也对酶促水解有重大影响。在PET的酶促水解过程中，使用FTIR可以观察到PET中结晶域的增加，这表明无定形的PET会被优先水解，该观点在一些比较不同结晶度材料的降解研究中也得到了证实ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[35]。此外，玻璃化转变温度（Tg）也会影响聚合物的降解，接近Tg的酶水解使聚酯链具有更好的柔性，酯键进入水解酶活性位点的可能性更高ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[35]。PET在空气中的玻璃化转变温度（Tg）约为70-80℃，在水中可以降低约10℃ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATAADDINEN.CITE.DATA[17]。在接近其Tg的反应温度下进行酶水解，可以导致lcPET薄膜的有效降解ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>RenWei</Author><Year>2017</Year><RecNum>36</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[36]</style></DisplayText><record><rec-number>36</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9zf00aqp2weeefadrpz25wd5erese2tdt9"timestamp="1543027197">36</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>RenWei,WolfgangZimmermann</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMicrobiologyandBioprocessTechnology,InstituteofBiochemistry,LeipzigUniversity,Johannisallee21-23,04103,Leipzig,Germany.</auth-address><titles><title>Biocatalysisasagreenrouteforrecyclingtherecalcitrantplasticpolyethyleneterephthalate</title><secondary-title>MicrobialBiotechnology</secondary-title></titles><periodical><full-title>MicrobialBiotechnology</full-title></periodical><pages>1302-1307</pages><volume>10</volume><number>6</number><edition>2017/04/13</edition><keywords><keyword>Bacteria/enzymology/genetics/*metabolism</keyword><keyword>Biocatalysis</keyword><keyword>Biodegradation,Environmental</keyword><keyword>GreenChemistryTechnology</keyword><keyword>Plastics/*metabolism</keyword><keyword>PolyethyleneTerephthalates/*metabolism</keyword><keyword>Recycling</keyword></keywords><dates><year>2017</year><pub-dates><date>Nov</date></pub-dates></dates><isbn>1751-7915(Electronic) 1751-7915(Linking)</isbn><accession-num>28401691</accession-num><urls><related-urls><url>/doi/full/10.1111/1751-7915.12714</url></related-urls></urls><custom2>PMC5658586</custom2><electronic-resource-num>10.1111/1751-7915.12714</electronic-resource-num><research-notes><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">综述了</style><styleface="normal"font="default"size="100%">PET</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">水解酶</style></research-notes></record></Cite></EndNote>[36]，PET水解反应温度的升高会导致PET降解速度的加快。因此，提高PET水解酶的热稳定性至关重要，Then等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[37]研究发现Ca2+和Mg2+的添加可显著提高来自Thermobifidafusca的聚酯水解酶（TfH，BTA2，Tfu_0882，TfCut1和TfCut2）对PET薄膜的降解，通过用带正电荷的精氨酸替换Ca2+结合位点（Asp174，Asp204和Glu253）的酸性残基，提高了TfCut2的热稳定性；此外，他们还以二硫键取代TfCut2的Ca2+结合位点ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[38]，增加了其热稳定性和对聚对苯二甲酸乙二醇酯的活性，通过向邻近残基处引入进一步的突变，所获得的TfCut2-D204C/E253C/D174R变体，将反应最佳温度提高了约10℃。Tournier等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[39]对LCC采用了相同的突变策略，在二价金属结合位点构建二硫键，设计了D238C/S283C变体，酶热稳定性增加，在此基础上引入了前期实验中导致最高比活性的两个突变和可提高热稳定性的几个突变，最终获得了效果最好的两个突变体F243I/D238C/S283C/Y127G（ICCG）和F243W/D238C/S283C/Y127G（WCCG），可在10小时内降解90%以上的PET粉末（先将消费后PET无定形化后，再进行造粒），为现今活性最强的PET水解酶。通过生物技术进行的酶优化在某种程度上取得了成功，但到目前为止还没有研究出一种能以经济有效和环保的方式完全渗透和降解厚层高结晶PET的酶ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Palm</Author><Year>2019</Year><RecNum>800</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[40]</style></DisplayText><record><rec-number>800</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rffpp522x55v2vesfz5xpwt8z92xvdzzze2d"timestamp="1562485704">800</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Palm,GottfriedJ.</author><author>Reisky,Lukas</author><author>Böttcher,Dominique</author><author>Müller,Henrik</author><author>Michels,EmilA.P.</author><author>Walczak,MiriamC.</author><author>Berndt,Leona</author><author>Weiss,ManfredS.</author><author>Bornscheuer,UweT.</author><author>Weber,Gert</author></authors></contributors><titles><title>Structureoftheplastic-degradingIdeonellasakaiensisMHETaseboundtoasubstrate</title><secondary-title>NatureCommunications</secondary-title></titles><periodical><full-title>NatCommun</full-title><abbr-1>Naturecommunications</abbr-1></periodical><volume>10</volume><number>1</number><dates><year>2019</year></dates><isbn>2041-1723</isbn><urls><related-urls><url>/articles/s41467-019-09326-3#Sec1</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1038/s41467-019-09326-3</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[40]。1.3PET水解产物的分析方法1.3.1高效液相色谱（HPLC）分析色谱法是一种基于分子结构与组成不同而分离的分析技术。色谱分离可以使用不同的固定相，如固定在玻璃板上的二氧化硅（薄层色谱），挥发性气体（气相色谱），纸张（纸色谱）和液体（液体色谱）。高效液相色谱法（HPLC）是一种液相色谱法，用于分离和定量溶解在溶液中的化合物，通常用于确定溶液中特定化合物的含量ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Kupiec</Author><Year>2004</Year><RecNum>842</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[41]</style></DisplayText><record><rec-number>842</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9zf00aqp2weeefadrpz25wd5erese2tdt9"timestamp="1615474433">842</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Kupiec,Tom</author></authors></contributors><auth-address>AnalyticalResearchLaboratories,OklahomaCity,Oklahoma.</auth-address><titles><title>Quality-controlanalyticalmethods:high-performanceliquidchromatography</title><secondary-title>Internationaljournalofpharmaceuticalcompounding</secondary-title></titles><periodical><full-title>Internationaljournalofpharmaceuticalcompounding</full-title></periodical><pages>223-7</pages><volume>8</volume><number>3</number><edition>2004/05/01</edition><dates><year>2004</year><pub-dates><date>2004</date></pub-dates></dates><isbn>1092-4221</isbn><accession-num>MEDLINE:23924674</accession-num><urls><related-urls><url>extension://oikmahiipjniocckomdccmplodldodja/pdf-viewer/web/viewer.html?file=https%3A%2F%2F%2Fpdf%2FHigh-Performance%2520Liquid%2520Chromatography%2520quantification.pdf</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>[41]。PET水解酶的酶活性可以通过对形成的水溶性降解产物（如TPA）进行定量来确定，由于其在240nm处具有特征吸收，TPA和相关的酯（如对MHET和BHET）可以通过反相HPLC进行监测ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[19]，是目前最常用的PET水解产物分析方法。1.3.2对苯二甲酸（TPA）荧光检测对苯二甲酸以对苯二甲酸酯的形式溶于碱性缓冲液中，可通过游离羟基自由基转化为2-羟基对苯二甲酸酯（HOTP），从而能够利用荧光光谱法进行测定（图1-4）。由于对苯二甲酸酯具有对称结构，它可被羟基化为一种单羟基化异构体，该异构体在室温下，可在36小时内显示出稳定的荧光ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wei</Author><Year>2012</Year><RecNum>233</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[23]</style></DisplayText><record><rec-number>233</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9zf00aqp2weeefadrpz25wd5erese2tdt9"timestamp="1555250941">233</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wei,Ren</author><author>Oeser,Thorsten</author><author>Billig,Susan</author><author>Zimmermann,Wolfgang</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMicrobiologyandBioprocessTechnology,InstituteofBiochemistry,UniversityofLeipzig,Leipzig,Germany.</auth-address><titles><title>Ahigh-throughputassayforenzymaticpolyesterhydrolysisactivitybyfluorimetricdetection</title><secondary-title>BiotechnologyJournal</secondary-title></titles><periodical><full-title>BiotechnologyJournal</full-title></periodical><pages>1517-1521</pages><volume>7</volume><number>12</number><edition>2012/05/25</edition><keywords><keyword>Actinomycetales/enzymology</keyword><keyword>BacterialProteins/metabolism</keyword><keyword>Bioreactors</keyword><keyword>Biotechnology/*methods</keyword><keyword>High-ThroughputScreeningAssays/*methods</keyword><keyword>Hydrolases/*metabolism</keyword><keyword>PhthalicAcids/analysis/chemistry/metabolism</keyword><keyword>PolyethyleneTerephthalates/*chemistry/metabolism</keyword><keyword>Spectrometry,Fluorescence/*methods</keyword></keywords><dates><year>2012</year><pub-dates><date>Dec</date></pub-dates></dates><isbn>1860-6768</isbn><accession-num>WOS:000312032500012</accession-num><urls><related-urls><url>/doi/full/10.1002/biot.201200119</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1002/biot.201200119</electronic-resource-num><research-notes><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">开发了一种高通量荧光检测聚酯水解酶的活性的方法。</style></research-notes></record></Cite></EndNote>[23]。因此，TPA曾被用于定量游离羟基自由基ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[42]。图1-4铁自氧化作用介导的对苯二甲酸酯羟基化为荧光HOTP的示意图ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wei</Author><Year>2012</Year><RecNum>233</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[23]</style></DisplayText><record><rec-number>233</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9zf00aqp2weeefadrpz25wd5erese2tdt9"timestamp="1555250941">233</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wei,Ren</author><author>Oeser,Thorsten</author><author>Billig,Susan</author><author>Zimmermann,Wolfgang</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofMicrobiologyandBioprocessTechnology,InstituteofBiochemistry,UniversityofLeipzig,Leipzig,Germany.</auth-address><titles><title>Ahigh-throughputassayforenzymaticpolyesterhydrolysisactivitybyfluorimetricdetection</title><secondary-title>BiotechnologyJournal</secondary-title></titles><periodical><full-title>BiotechnologyJournal</full-title></periodical><pages>1517-1521</pages><volume>7</volume><number>12</number><edition>2012/05/25</edition><keywords><keyword>Actinomycetales/enzymology</keyword><keyword>BacterialProteins/metabolism</keyword><keyword>Bioreactors</keyword><keyword>Biotechnology/*methods</keyword><keyword>High-ThroughputScreeningAssays/*methods</keyword><keyword>Hydrolases/*metabolism</keyword><keyword>PhthalicAcids/analysis/chemistry/metabolism</keyword><keyword>PolyethyleneTerephthalates/*chemistry/metabolism</keyword><keyword>Spectrometry,Fluorescence/*methods</keyword></keywords><dates><year>2012</year><pub-dates><date>Dec</date></pub-dates></dates><isbn>1860-6768</isbn><accession-num>WOS:000312032500012</accession-num><urls><related-urls><url>/doi/full/10.1002/biot.201200119</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1002/biot.201200119</electronic-resource-num><research-notes><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">开发了一种高通量荧光检测聚酯水解酶的活性的方法。</style></research-notes></record></Cite></EndNote>[23]Fig.1-4SchematicillustrationofthehydroxylationofterephthalatetofluorescentHOTPmediatedbyironautoxidation1.3.3紫外分光光度法原理同1.3.1相似，TPA在240nm波长处具有特征吸收，其在微碱性（pH=7~9）溶液中的吸光度可以保持相对稳定ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>俞雄飞</Author><Year>2007</Year><RecNum>845</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[43]</style></DisplayText><record><rec-number>845</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9zf00aqp2weeefadrpz25wd5erese2tdt9"timestamp="1615532271">845</key></foreign-keys><ref-typename="ConferencePaper">47</ref-type><contributors><authors><author>俞雄飞</author><author>袁丽凤</author><author>王豪</author><author>莫卫民</author></authors></contributors><auth-address>[宁波出入境检验检疫局宁波315012,浙江工业大学化学工程与材料学院杭州310005]</auth-address><titles><title>紫外分光光度法测定粗对苯二甲酸中对苯二甲酸含量</title><secondary-title>浙江省第三届分析测试学术报告会论文集</secondary-title></titles><pages>399-402</pages><keywords><keyword>紫外分光光度法</keyword><keyword>粗对苯二甲酸</keyword><keyword>含量检测</keyword></keywords><dates><year>2007</year></dates><pub-location>杭州</pub-location><urls><related-urls><url>/details/detail.do?_type=conference&id=6555403</url></related-urls></urls><remote-database-provider>北京万方数据股份有限公司</remote-database-provider><language>chi</language></record></Cite></EndNote>[43]。该法极其简便、快速，但对苯二甲酸酯在240nm左右也具有特征吸收峰，此外蛋白质在该区域也会强烈吸收ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>O'Neill</Author><Year>2009</Year><RecNum>844</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[44]</style></DisplayText><record><rec-number>844</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9zf00aqp2weeefadrpz25wd5erese2tdt9"timestamp="1615476555">844</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>O'Neill,Alexandre</author><author>Cavaco-Paulo,Artur</author></authors></contributors><titles><title>Monitoringbiotransformationsinpolyesters</title><secondary-title>Biocat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1029-2446</isbn><urls></urls><electronic-resource-num>10.1080/10242420400025760</electronic-resource-num><research-notes><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">【提到了紫外分光光度法的弊端】</style><styleface="normal"font="default"size="100%">本文介绍了两种监测聚酯纤维（PET聚对苯二甲酸乙二醇酯）表面酯酶水解的方法。通过与反应性染料（CI反应性黑5）进行碱性反应确定纤维表面的羟基，并使用反射分光光度计确定颜色强度。在与过氧化物反应之后，通过荧光测定所得的羟基对苯二甲酸，还定量了所形成的对苯二甲酸溶液。这些方法的详细说明在本文中给出。</style></research-notes></record></Cite></EndNote>[44]，实际应用时测量误差较大。Ma等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[20]利用无细胞蛋白表达系统，排除了菌体对吸光度的影响，使用pRSET-CFP（青色荧光蛋白）载体表达PETase-CFP融合蛋白，通过检测荧光强度来表征蛋白表达水平，240nm处检测产物吸光度，从而实现对PET水解酶的高通量筛选。朱丽姗等人ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>朱丽姗</Author><Year>2020</Year><RecNum>552</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[45]</style></DisplayText><record><rec-number>552</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9zf00aqp2weeefadrpz25wd5erese2tdt9"timestamp="1594052037">552</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>朱丽姗</author><author>宋为丽</author><author>付小蕾</author><author>刘晙玭</author></authors></contributors><auth-address>武汉市职业病防治院;</auth-address><titles><title>工作场所空气中对苯二甲酸测定方法的改进</title><secondary-title>工业卫生与职业病</secondary-title></titles><periodical><full-title>工业卫生与职业病</full-title></periodical><pages>67-69</pages><volume>46</volume><number>01</number><keywords><keyword>对苯二甲酸</keyword><keyword>紫外分光光度法</keyword><keyword>工作场所</keyword></keywords><dates><year>2020</year></dates><isbn>1000-7164</isbn><call-num>21-1147/R</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[45]还优化了紫外分光光度法波长的选择，使用微孔滤膜采集空气中TPA，由于滤膜本身在240nm处的底值偏高且不规律。对空白滤膜及TPA标准液进行全波长扫描，发现滤膜在250nm后几乎没有紫外吸收，基本不影响测定，但TPA在250~260nm也有很大吸收，经过条件优化后，选择260nm为试验波长。此外，Zhong等人ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Zhong-Johnson</Author><Year>2021</Year><RecNum>848</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[46]</style></DisplayText><record><rec-number>848</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="za9zf00aqp2weeefadrpz25wd5erese2tdt9"timestamp="1615713851">848</key><keyapp="ENWeb"db-id="">0</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Zhong-Johnson,E.Z.L.</author><author>Voigt,C.A.</author><author>Sinskey,A.J.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiology,MassachusettsInstituteofTechnology,77MassachusettsAvenue,Building68-370A,Cambridge,MA,USA. DepartmentofBiologicalEngineering,MassachusettsInstituteofTechnology,500TechnologySquare,NE47-140,Cambridge,MA,USA. DepartmentofBiology,MassachusettsInstituteofTechnology,77MassachusettsAvenue,Building68-370A,Cambridge,MA,USA.asinskey@.</auth-address><titles><title>Anabsorbancemethodforanalysisofenzymaticdegradationkineticsofpoly(ethyleneterephthalate)films</title><secondary-title>ScientificReports</secondary-title></titles><periodical><full-title>ScientificReports</full-title></periodical><pages>928</pages><volume>11</volume><number>1</number><edition>2021/01/15</edition><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Jan13</date></pub-dates></dates><isbn>2045-2322(Electronic) 2045-2322(Linking)</isbn><accession-num>33441590</accession-num><urls><related-urls><url>/articles/s41598-020-79031-5</url></related-urls></urls><custom2>PMC7806724</custom2><electronic-resource-num>10.1038/s41598-020-79031-5</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[46]也在260nm处实现了所有IsPETase同源酶的活性测定。1.4PET水解酶的活性测定方法1.4.1对硝基苯酚法以对硝基苯酯为底物，测量生色基团（对硝基苯酚）的释放ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[47]，对硝基苯酚在405nm或410nm处有最大吸收峰，可通过紫外分光光度法进行产物吸光度的检测ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[48]。此方法非常简单，但将棕榈酸酯释放到水性介质中时会产生浑浊，需要添加乳化剂或有机溶剂（乙醇或丙醇）以保持其均一性，而有机溶剂难以测量和处理ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[47]。目前常用于PET水解酶的对硝基苯酯底物主要有p-NPAADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[49]、p-NPBADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[27,28,50]、p-NPHADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[49]等。1.4.2快速比色法Shinozaki等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[51]利用尼罗蓝染色试剂对生物可降解塑料（BPs）进行染色，制备出含染料的生物可降解塑料薄膜，进行酶促反应后，可以观察到反应溶液的颜色变化，反应进程可通过OD600进行测定。操作流程如图1-5所示，其中（A）为载玻片上的BP膜和酶溶液的剖视图；（B）为反应后（30℃，24h）的带有BP膜和酶溶液的载玻片的照片；（C）为在含染料的BP膜降解后收集的反应溶液。图1-5使用含染料的BP膜（染料-BP分析）评估相对BPs降解活性ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[51]Fig.1-5EvaluationoftherelativeBPs-degradationactivityusingdye-containingBPfilms(dye-BPassay)1.4.3快速比浊法Wei等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[52]将PET纳米颗粒固定在琼脂糖凝胶中，通过测量PET水解过程中，由于散射效应引起的透射光强度的变化，来确定来自Thermobifidafusca

KW3的聚酯水解酶（TfCut2）对PET水解的程度。PET纳米颗粒悬浮液的浊度降低与酶降解产生的表面侵蚀过程相关，可以基于非均相生物催化模型直接估算PET酶水解的动力学参数。此外，Schmidt等人ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[53]还使用比浊法分析了聚酯水解酶LCC，TfCut2，Tcur1278和Tcur0390对聚酯PUImpranilDLN的降解，其中TfCut2和Tcur0390具有最高的聚氨酯水解速率。参考文献[1]MALIZIAA,MONMANY-GARZIAAC.TerrestrialecologistsshouldstopignoringplasticpollutionintheAnthropocenetime[J].ScienceoftheTotalEnvironment,2019,668:1025-1029.[2]GEYERR,JAMBECKJR,LAWKL.Production,use,andfateofallplasticsevermade[J].ScienceAdvances,2017,3(7):e1700782.[3]KOSHTIR,MEHTAL,SAMARTHN.Biologicalrecyclingofpolyethyleneterephthalate:amini-review[J].JournalofPolymersandtheEnvironment,2018,26(8):3520-3529.[4]VOLLMERI,JENKSMJF,ROELANDSMCP,etal.Beyondmechanicalrecycling:givingnewlifetoplasticwaste[J].Angew