DB42-T 2242-2024 水产品中羧甲基赖氨酸的测定液相色谱法

DB42 12规范性引用文件 1 1 1 16仪器与设备 7样品制备与保存 3 3 10检出限与定量限 5附录A（规范性）水产品的试样制备 附录B（资料性）羧甲基赖氨酸衍生物高效液相色谱图 7前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖北省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所、湖北省市场监督管理局行政许可技术评审中心、湖北农科质标检测科技有限公司。刘军、路磊、周有祥、彭立军。对本文件的有关修改意见建议请反馈至湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，电话邮箱：zhibiaosuo204@163.com。水产品中羧甲基赖氨酸的测定液相色谱法本文件描述了用液相色谱法测定水产品中羧甲基赖氨酸含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、样品制备与保存、测定步骤、精密度、检出限与定量限。本文件适用于鱼、虾、蟹类等水产品中羧甲基赖氨酸含量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T30891水产品抽样规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。由葡萄糖与赖氨酸发生非酶催化反应生成的一种典型糖化终末产物。试样脱脂后经硼氢化钠还原、蛋白水解反应，水解产物通过固相萃取后经衍生，再用高效液相色谱分离，荧光检测器进行测定，外标法定量。5试剂与材料5.1试剂5.1.1三氯甲烷（CHCl3，CAS号：67-66-3分析纯。5.1.2丙酮（CH3COCH3，CAS号：67-64-1）：分析纯。5.1.3盐酸（HCl，CAS号：7647-01-0）：分析纯。5.1.4氢氧化钠（NaOH，CAS号：1310-73-2分析纯。5.1.5磷酸二氢钠（NaH2PO4，CAS号：7558-80-7分析纯。5.1.6硼氢化钠（NaBH4，CAS号：16940-66-2）：分析纯。5.1.7邻苯二甲醛（C8H6O2，CAS号：643-79-8）：分析纯。5.1.83-巯基丙酸（C3H6O2S，CAS号：107-96-0）分析纯。5.1.9甲醇（CH3OH，CAS号：67-56-1）：色谱纯。5.1.10乙腈（CH3CN，CAS号：75-05-8）：色谱纯。5.1.11甲酸（HCOOH，CAS号：64-18-6）：分析纯。5.1.12硼酸（H3BO3，CAS号：11113-50-1）：分析纯。）：5.1.14水（H2O，CAS号：7732-18-5）：为符合GB/T6682规定的一级水。5.2溶液配制5.2.16mol/L盐酸溶液：取50mL盐酸（见5.1.3用水溶解并定容至100mL。5.2.20.1mol/L盐酸溶液：取1.67mL盐酸（见5.2.1用水溶解并定容至100mL。5.2.30.1mol/L氢氧化钠溶液：称取2.00g氢氧化钠（见5.1.4），用水溶解并定容至500mL。5.2.40.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8称取0.12g磷酸二氢钠（见5.1.5加水溶解并稀释至5.2.50.1mol/L硼酸钠缓冲液（pH10.2称取0.49g硼酸（见5.1.12）和0.19g十水合四硼酸钠），5.2.62mol/L硼氢化钠溶液：称取7.57g硼氢化钠（见5.1.6用0.1mol/L氢氧化钠溶液（见5.2.3）溶解并定容至100mL。5.2.7衍生化试剂：取80mg邻苯二甲醛（见5.1.7），加入7.0mL0.1mol/L硼酸钠缓冲溶液（见），），），5.3标准品羧甲基赖氨酸标准品（CAS号：5746-04-3），纯度≥98%。5.4标准品的配制5.4.1羧甲基赖氨酸标准储备溶液（1000mg/L准确称取适量羧甲基赖氨酸标准品（精确至0.1mg）至棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀。将溶液转至棕色玻璃容器中，-18℃下保存，有效5.4.2羧甲基赖氨酸标准中间溶液（1.0mg/L）：准确量取羧甲基赖氨酸标准储备溶液0.1mL于100mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液（见5.2.2）稀释并定容至100mL，混匀。将溶液转至棕色玻璃容器中，4℃下保存，现配现用。5.5材料5.5.1固相萃取柱，C18填料，容积6mL，填充物500mg。5.5.2微孔滤膜，有机系，孔径0.2μm。6仪器与设备6.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。6.2分析天平：感量0.01mg和0.01g。6.3离心机：转速不低于5000r/min。6.5氮吹仪。6.6涡旋震荡器。6.7烘箱（可控温）。7样品制备与保存样品制备按附录A的规定执行，符合GB/T30891的要求，制备后的样品于-18℃下保存。8测定步骤8.1样品前处理8.1.1脱脂称取2g（精确至0.01g）试样置于50mL离心管中，加入20mL丙酮-三氯甲烷溶液（见5.2.8），充分混匀，以5000r/min离心5min，弃去上清液；再次加入20mL丙酮-三氯甲烷溶液（见5.2.8重复一次，得蛋白沉淀。8.1.2硼氢化钠还原在蛋白沉淀中加入1.6mL硼酸钠缓冲液（见5.2.5）、400μL硼氢化钠溶液（见5.2.6），静置8h。8.1.3水解将还原后的样品溶液转至安瓿瓶中，加入8mL盐酸溶液（见5.2.2氮气保护下密封，于110℃烘箱中水解24h。8.1.4净化和水依次通过固相萃取柱，量取5mL水解液，以1.0mL/min的流速通过固相萃取柱（见5.5.1再用5mL水去除杂质，挤干小柱后用5mL甲醇-0.1%甲酸水溶液（见5.2.10）洗脱，收集洗脱液至刻度离心管中，氮吹至干后用1mL0.1mol/L盐酸溶液（见5.2.2）复溶，待衍生。8.1.5衍生化量取200μL上述溶液，加入500μL硼酸钠缓冲液（见5.2.5），混匀，再加入20μL衍生化试剂（见5.2.7），涡旋2min，取上清液经0.22μm微孔滤膜（5.5.2）过滤后，待测。8.2标准工作溶液的制备稀释，配成浓度为0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10mg/L系列标准工作溶液，各取200μL上述系列溶液，其余步骤同“8.1.5”。8.3仪器参考条件8.3.1色谱柱：C18柱，4.6mm×250mm,粒径5.0μm；或性能相当者。8.3.2流动相：A，0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液（见5.2.4B，水-乙腈-甲醇溶液（见.3流速：1.0mL/min。8.3.5荧光检测器：激发波长340nm，发射波长450nm。8.3.6进样体积：10μL。表1梯度洗脱参考条件8.4定量测定在上述色谱工作条件下，标准工作溶液与试样的衍生物交替进样，采用标准工作溶液单点或多点校正，外标法定量。试样溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，当试样的上机液浓度超过线性范围时，需根据测定浓度，稀释后进行重新测定。典型的羧甲基赖氨酸衍生物的高效液相色谱图参8.5数据处理试样中羧甲基赖氨酸的含量ω,以质量分数表示，单CS——标准溶液中羧甲基赖氨酸衍生物的浓度，单位为毫克每升（mg/L）；A——试样溶液中羧甲基赖氨酸衍生物的峰面积；AS——标准溶液中羧甲基赖氨酸衍生物的峰面积；V1——水解后试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；V2——分取水解后试样用于固相萃取的溶液体积，单位为毫升（mL）；V3——试样溶液的复溶体积，单位为毫升（mL）；m——样品称样量，单位为克（g以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，结果保留2位有效数字。含量超过1mg/kg时，保在重复条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值，不大于该平均值的15%。10检出限与定量限本方法检出限为0.015mg/kg,定量限为0.050mg/kg。水产品的试样制备A.1鱼类至少取3尾鱼清洗后，去头、骨、内脏，取肌肉、鱼皮等可食部分绞碎混合均匀后备用；试样量为400g，分为两份，其中一份用于检验，另一份作为留样。A.2虾类至少取