【《金黄色葡萄球菌检测方法的研究状况国内外文献综述》5800字】

金黄色葡萄球菌检测方法的研究状况国内外文献综述根据研究，金黄色葡萄球菌的检测手段主要有如下三类:传统培养法，国家标准方法为代表；以抗原抗体反应为基础的免疫学检测方法,酶联免疫吸附法(Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)、免疫胶体金技术(Immunecolloidalgoldtechnique)以及免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)为代表;以DNA为基础的分子生物学检测方法,核酸分子杂交技术(Nucleicacidmoleculehybridization)、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReactio，PCR)、环介导恒温扩增技术(lop-mediatedisothermalamplification，LAMP)等为代表。1.1传统培养法目前在我国检测食品中金黄色葡萄球菌采用的是传统检测方法，主要是根据GB4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》总共分为四步骤，所需时长为78h。如图1-1所示。图1-1国家标准GB4789.10-2010方法Fig.1-1ThemethodofGB/T4789.10-2010第一步，先后在75％的氯化钠肉汤培养基、血琼脂平板Baird-Parker平板上接种待测样品。第二步，挑取疑似金黄色葡萄球菌的菌落进行染色然后镜检。第三步，进行血浆凝固酶试验以及其他生化试验。第四步，用标准阳性和菌株作对照组，全程大约需5-8d。定量检测方法：在10％氯化钠胰酪胨大豆肉汤上接种稀释好的三个梯度的稀释液，每个梯度平行做3管，培养一段时间后转接到Baird-Parker平板上继续培养，然后对典型菌落进行确认，通过査MPN表对金黄色葡萄球菌进行定量检测REF_Ref9310\n\h[21-23]。以上传统培养法虽然准确度较高，最低检出限可达到零，但是步骤繁琐，检测时间长，随着食品工业的发展，以及对食品安全的重视，传统检测方法已经远远不能满足食品检测的需要，迫切需要灵敏度更高、特异性更强简便快捷的食品安全检测技术和方法。1.2免疫学检测方法免疫学方法是基于抗原-抗体特异性结合的免疫学原理发展起来的检测技术，具有灵敏度高，特异性强的特点。但是该类方法也有一定的局限性，比如免疫学方法检测的灵敏度和特异性易受抗体特异性、抗体吸附能力以及基质背景干扰等因素的影响，不能满足种类繁多、组分复杂和目标菌含量低的食品样品的检测要求。（1）酶联免疫技术酶联免疫技术(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)是免疫分析技术中应用最广泛的方法。其基本原理是保持抗原(或抗体)原有的免疫活性并将其吸附于固相载体上，再加入酶标记进行免疫酶染色，底物显色后，分析有色产物的量即可确定样品中待测物质的含量，由于酶的催化效率很高，这就间接的放大了反应结果从而提高反应的敏感度REF_Ref9310\n\h[24-26]。ELISA技术在食品分析中的应用有很多，比如检测食品中的营养物质、微生物、农药残留以及重金属污染等。目前，ELISA技术在金黄色葡萄球菌的检测中主要是应用于检测其分泌的肠毒素。虽然ELISA技术以其灵敏度高、特异性强而著称，但是也存在一些缺陷，由于在该技术中所用的抗原、抗体以及标记物等生物制剂的稳定性不够强，容易在相同的检样中产生差別，同时，由于联免疫试剂的储存时间，存贮环境的条件不同也容易在检测时出现差异。同时，酶联免疫吸附技术由于试剂的特异性，可能对结构相似的化合物产生交叉反应，也不能同时应用于多种组分的检测。（2）免疫胶体金技术免疫胶体金技术(Immune

colloidal

gold

technique,GICT)是一种免疫标记技术，以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体。胶体金可通过静电作用与抗体非共价结合，形成胶体金示踪标志物，通过抗原-抗体反应与目标抗原相结合，实现病原生物的检测。杜玉萍[27]等人利用胶体金免疫层析技术建立了胶体金免疫层析试纸法，利用该方法检测金黄色葡萄球菌可在60min内完成，实验结果显示灵敏度为1×106cfu/mL。刘晶[28]等人利用胶体金免疫层析技术研发出方便携带的免疫层析测试卡检测金黄色葡萄球菌的肠毒素α和β，检测灵敏度分别为10ng/mL和1ng/mL，整个检测过程在10min内完成，可以满足现场快速检测的要求。胶体金技术的优势在于检测时间短、成本低廉、无需复杂仪器。但利用该方法检测食源性病原菌灵敏度较低，所制备的多克隆抗体特异性无法保证，容易发生交叉反应。（3）免疫荧光技术免疫荧光技术也叫做荧光抗体法(Immunofluorescencetechnique)，已知抗原/抗体采用荧光标记物标记，然后通过标记抗原/抗体与待检样品中的抗体/抗原发生特异性的结合，使得待检样品同时也被荧光物质标记，然后利用特殊的荧光仪器判定荧光位置及强度从而达到定位或者定量检测的目的。免疫荧光技术主要包括两种方法:直接法和间接法。直接法是将荧光物质与已知抗原/抗体来结合测定未知样品。间接法是通过已知抗原/抗体与待检样品发生特异性结合后，经过洗涤，再向结合物中加入被荧光标记的二抗，通过测定已知的一抗的含量间接测定未知样品中待检成分的含量。早在1981年，朱广发[29]等人经过三年的研究采用免疫荧光抗体技术实现了金黄色葡萄球菌的检测性同位素等标记抗原/抗体，然后将这些标记了的抗原/抗体加入到抗原/抗体的特异性反应体系中与相应的抗体/抗原发生特异性结合，通过检测这些标记物的存在及含量来达到对检测样品中的微量被物质进行定性或定量检测的目的。Khan[30]等将免疫荧光技术与联免疫技术相结合检测金黄色葡萄球肠毒素，在用荧光微量滴定器检测荧光信号强度，对金黄色葡萄球菌肠毒素的检测精度可以达到100pg/孔。为了提高免疫荧光技术的检测精度，科研人员将免疫荧光技术与其他技术相结合发明了抗体-直接表面滤膜荧光技术、微菌落免疫荧光检测技术、荧光-PCR技术、荧光酶联疫技术等等。法国生物梅里埃公司还在醇联免疫技术的基础上研究出了荧光酶标分析仪这种全自动荧光免疫分析系统。虽然免疫荧光技术操作简单，方便，灵敏，但是由于检测荧光的高昂价格，因此限制了其在基层企业的广泛应用。（4）免疫磁性微球技术免疫磁性微球技术（Immunomagnetic

Microspheres,IMMS）或称免疫磁珠（Immunomagnetic

Beads,IMB），是表面结合有单克隆抗体的磁性微球。免疫磁性微球技术是在具有磁性的微颗粒表面偶联上特异性的抗体，利用这些特异性的抗体与目标抗原如致病性微生物、病毒等发生特异性结合，然后在外加的磁场中，这些表面含有目标抗原的磁性粒发生定向移动，与样品混合液相互分离，聚集在某一磁极的内壁，然后再弃去检测样品的液体，撤消磁场，将富集在磁极的磁性微球颗粒进行收集，之后再利用光染料进行染色检验或者进行PCR检验。免疫磁性球技术在食品中致病性微生物如大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等的检测中也有应用。Payam[31]等人检测牛奶中的金黄色葡萄球菌，采用的方法就是免疫磁性分离和酶联免疫吸附相结合的方式，在3h以检测最低限度为105cfu/ml的牛奶样品。刘细霞[32]利用金黄色葡萄球菌所特有的SPA(金黄色葡萄球菌A蛋白)可与IgG(免疫球蛋白G）的Fc片段发生特异性结合，制备金属螯合免疫磁性微球，用于分离金黄色葡萄球菌的SPA蛋白，进行免疫印记分析来检测金黄色葡萄球菌，检测限达到100cfu/ml。虽然免疫磁性微球技术以检测时间短，检测精度高而得到广泛应用，但是由于其需要制备相应的抗体，因此检测成本较高。1.3生物学检测方法随着食源性病原菌的检测进入分子水平，一些病原菌的特有核酸序列不断被研究者破解，形成了以核酸分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）等为代表的分子生物学检测方法，来这些方法可以通过计引物、探针、优化条件来提高检测方法的灵敏度、特异性，从而实现多种病原体的快速检测。（1）核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术(Nucleicacidmoleculehybridization)也称作核酸探针技术或基因探针技术。我国从1986年开始相继展开了核酸探针技术的研究工作。目前已成功应用该技术检测大肠杆菌，沙门氏菌及金黄色葡萄球菌等致病菌。该技术检测微生物的依据是核酸杂交，核酸杂交是分子标记技术中的一个分支,其原理是利用物种间所特有的核酸序列，把能与一些特定核苷酸序列发生特异性结合的已知DNA/RNA片段作为探针，进行可识别的标记(如放射性同位素标记，生物素标记等)，然后根据核苷酸分子间的碱基互补配对原则，通过原位杂交、斑点杂交等方法检测未知样品是否与已知样品具有相同的核酸序列，并进一步判定他们的同源程度。陈彬，黄晓蓉[33]等人利用Accuprobe基因探针技术，利用荧光素标记金黄色葡萄球菌特异性的DNA探针与经过增菌处理的待检样品中的金黄色葡萄球菌的rRNA序列进行杂交，生成RNA:DNA杂交体，然后利用荧光发光仪在450mm处读取其吸收峰，当吸收峰大于其临界值时，证明样品中存在金黄色葡萄球菌。采用这种方法检测样品中的金黄色葡萄球菌的检出最低限为10cfu/mL，增菌以后食品中的金黄色葡萄球菌鉴定时间仅需半小时。彭奕冰，毛恩强[34]等人利用金黄色葡萄球菌特异性热核酸m基因核酸探针技术对鼠样进行金黄色葡萄球菌的检测，与核酸斑点杂交检测结果的符合率达到100％,检测准确性较高。核酸探针的特异性强，但灵敏度不高；检测不仅需要昂贵的分析设备，而且每检测一种菌就要制备一种探针成本十分高；同时对操作人员的要求十分高，现场操作又较为复杂，不利于现场的快速筛查与检测。（2）聚合酶链式反应(PCR)聚合酶链式反应(Polymerase

Chain

Reaction,PCR)，是上世纪80年代Rary

B.

Mullis[35]等人发明的体外酶促基因扩增技术，应用常规PCR技术检测食源性病原菌，相比于传统培养法具有特异性强、简单快速、灵敏度高的特点。PCR技术通过提取目的DNA，然后进行人工合成与目的DNA两条链末端互补的寡核酸引物，通过酶促作用在体外经过高温变性、低温退火适温延伸的反复循环，使目的DNA的数量呈现几何级数的增长，达到迅速扩增目的DNA的效果。然后再对扩增产物进行电泳、染色，扩增的目的DNA片段在紫外灯的照射下可见，根据不同的DNA带可以鉴定不同的DNA用这种方法可以进行DNA序列分析，进而鉴别不用的物质。Khan

MA[30]等人利用常规PCR技术检测受到感染绵羊牛奶中的金黄色葡萄球菌，结果显示了100％的特异性，随着目标DNA洗涤次数的增加，灵敏度也从53％增加到90％。但是常规PCR具有易受食品复杂基质以及环境影响、靶序列或扩增产物导致交叉污染以及不合适的引物设计等缺点导致假阳性或者假阴性的检测结果。多重PCR(

multiplex

PCR)技术是在常规PCR技术基础上发展起来的新技术，近年来越来越多地被应用于食源性病原菌的检当中。许一平，成炜[36]等人利用多重PCR技术从羊奶路和乳制甜品样品中分离出金黄色葡萄球菌和肠毒素。但是多重PCR技术对引物设计的要求非常高，在食品微生物的检测中，多重PCR引物与非靶点序列结合容易导致非特异性扩增，从而出现假阴性和假阳性结果。实时荧光定量PCR(Real-time

PCR)技术是基于检测过程中所发射的荧光量与PCR产物的量成正比来实现PCR反应的监测。目前该技术已经广泛应用于临床微生物学和食品微生物学检测中，与传统PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术极大地改善和简化了核酸定量检测，所花费时间更短，检测效率更高，交污染风险更小。但是该方法也有一定的局限性，比如PCR产物呈指数增长、发射光谱重叠、假阴性结果增加等。本研究将使用普通PCR技术作为对照组实验。1.4其他检测方法(1)生物传感器:生物传感器的分子识别原件是酶、抗体、细胞等生物活性物质，通过信号转换器和电子测量仪器进行分析。样品与分子识别元件发生特异性结合，产生生物学信息，这些信息通过信号转换器转化为光信号或者电信号，再通过仪表放大和输出，达到检测目的[37]。生物传感器具有准确、灵敏易操作和可重复使用等优点。用于食品微生物检测主沙门氏菌、大肠杆菌等检测，而且基因传感器使对目的DNA测量时间大大缩短，且操作简单，灵敏度高[38-39]。然而，目前该技术多处于研究阶段，且检测费用昂贵，不利于推广。(2)基因芯片技术:近几年，基因芯片技术在生命科学领域迅速发展，它是一项基于基因表达和基因功能研究的革命性技术，综合了分子生物学、半导体微电子、激光、化学染料等领域的最新科学技术，把生命科学与信息科学联系在了一起，是当今前沿科学的研究热点[41-42]。该技术可以有效的鉴别微生物和转基因成分，为现代社会检测人们所关注的食品安全问题提供了一个新方向。目前基因芯片主要应用在检测食品原料和食品成分方面，对监督食品的卫生、安全和食品质量有着深刻的作用[43-44]。但要想要更广泛的应用基因芯片技术，还需要解决如何建立标准化程序、降低检测费用、简化样品制作和标记操作、进一步提检测特异性等问题。(3)电阻抗法:电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术。其原理培养基中的碳水化合物、蛋白质和脂类等大分子电惰性物质，随着细菌的生长被代谢成乳酸盐、醋酸盐等小分子电活性物质，[45]。这些小分子电活性物质可以增加培养基导电性，使培养基的电阻发生变化，通过检测培养基电阻变化情况，就可以判定细菌在培养基中生长繁殖特性，即可以检测出相应的细菌来。该方法目前已应用于细菌总数、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等细菌的检测[46-47]。参考文献TongS,DavisJS,EichenbergerE,etal.StaphylococcusaureusInfections:Epidemiology,Pathophysiology,ClinicalManifestations,andManagement[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2015,28(3):603-661.东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001,246-247.方太松,王军,王晔茹,吴瑜凡,刘阳泰,王翔,董庆利.我国熟肉制品中金黄色葡萄球菌污染状况Meta分析[J].生物加工过程,2020,1803:386-391.陈琼,董华夏,戴小芳,刘萍,晏涛,郦娟.畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌可视化LAMP检测方法的研究[J].食品工业科技,2020,4120:235-240+245.QuiteriaJ,DCid,SanzR,etal.InfluenceofageofthedonorsheeponthephagocytosisofStaphylococcusaureussubspeciesanaerobiusandSaureusbyneutrophils-ScienceDirect[J].ResearchinVeterinaryScience,1996,61(3):231-233.李琼琼,范一灵,宋明辉,施春雷,杨美成.食源性金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法[J].食品安全质量检测学报,2016,702:555-560.胡金强,雷俊婷,白艳红,魏向珂,景建洲,高辉,孙新城,董彩文,耿尧,姜春鹏.食品中金黄色葡萄球菌PCR-ELISA检测技术建立[J].食品工业科技,2016,3720:63-67.

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