【《糯米清酒的抗氧化及抗菌性实验探究报告》3900字】

第页共77页糯米清酒的抗氧化及抗菌性实验探究报告目录TOC\o"1-3"\h\u23094糯米清酒的抗氧化及抗菌性实验探究报告 1237411.1材料与仪器 15951.1.1试验材料 114721.1.2试验仪器 1276141.1.3试验试剂 2167741.2试验方法 2237981.2.1糯米清酒抗氧化性研究 2225551.2.1.1糯米清酒DPPH•清除率的测定 2220761.2.1.2糯米清酒ABTS•+清除率的测定 2177531.2.1.3糯米清酒铁离子还原能力的测定 3212371.2.2糯米清酒的抗菌性测定 348571.2.2.1糯米清酒的前处理 3274771.2.2.2细菌培养液的制备 4246331.2.2.3细菌的培养 4292061.2.2.4抗菌性测试 4275421.3试验结果与分析 5122261.3.1糯米清酒抗氧化性研究 5223771.3.1.1糯米清酒DPPH•清除能力 5126381.3.1.2糯米清酒ABTS•+清除能力 5267361.3.1.3糯米清酒铁离子还原能力 634141.3.1.4糯米清酒抗氧化能力相关性分析 7136971.3.2糯米清酒的抗菌性测定 7227431.4讨论 81.1材料与仪器1.1.1试验材料糯米清酒（发酵条件（温度15℃、抛光度7DM和酵母F5）下发酵13天制得）、大肠杆菌（O157）（Escherichiacoli）、金黄色葡萄球菌（503）（Staphylococcusaureus）、变形链球菌（3289）（Streptococcusmutans）1.1.2试验仪器紫外分光光度计（U-3900型）：日本日立高科技公司；旋转蒸发仪（R201D型）：上海豫康科教设备有限公司；恒温水浴震荡器（SHA-C型）：常州市华普达仪器有限公司；恒温培养箱（HF-105A型）：江苏金坛市恒丰仪器厂；酶标仪（SP-Max2300A2型）：上海闪普科生物技有限公司。1.1.3试验试剂无水乙醇、1,1-2-苦肼基(DPPH)标准品、ABTS溶液、过硫酸钾、铁氰化钾、磷酸盐缓冲液、氯化铁、三氯乙酸（均为分析纯）、MHB培养基、BHI培养基1.2试验方法1.2.1糯米清酒抗氧化性研究1.2.1.1糯米清酒DPPH•清除率的测定1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH•）作为一种自由基，性质较为稳定，其乙醇溶液在一般条件下呈紫色，且在517nm条件下存在一个特征吸收峰，当环境中存在其他活性自由基时，其光吸收性将受到影响。因此，可以通过检测DPPH•反应前后吸光值变化来计算出其自由基清除率[90]。选取添加量分别为50、100、150、200、250μL的糯米清酒溶液加入2mL配置好的0.2mmol/LDPPH•溶液中，混合均匀后于避光处静置30min，在517nm下测定其吸光值计为A，在相同条件下，将相同体积样品溶液和2mL无水乙醇混合溶液的吸光度值记为B，相同体积无水乙醇与2mLDPPH•混合溶液吸光度值计为C。按公式（4-1）计算DPPH•清除率。DPPH•清除率（%）=×100%（4-1）式中：A：糯米清酒样液与DPPH•溶液的吸光值；B：糯米清酒样液与无水乙醇的吸光值；C：无水乙醇与DPPH•溶液的吸光值大米清酒测定方法同上。1.2.1.2糯米清酒ABTS•+清除率的测定ABTS•+储备液的制备（7.4mmol/L）：取3mgABTS•+加入0.735mL蒸馏水；K2S2O8储备液的制备（2.6mmol/L）：取1mgK2S2O8加入1.43mL蒸馏水。取0.2mLABTS•+储备液置于试管中，加入0.2mLK2S2O8储备液，混合均匀，在室温黑暗环境中静置12h，使用无水乙醇稀释40-50倍，使A734nm=0.7±0.02，从而制得ABTS•+工作液。取0.8mLABTS•+工作液置于试管中，选取添加量分别为50、100、150、200、250μL的糯米清酒溶液进行混合，振荡10s，使其充分混合均匀后静置6min，在734nm处进行测定其吸光值为A；取0.8mLABTS•+工作液置于试管中，加入等体积无水乙醇，振荡10s，使其充分混合均匀后静置6min，在734nm处测定其吸光值为B[91]。按公式（4-2）计算ABTS•+消除率。ABTS清除率（%）=×100%（4-2）式中，A：样品溶液加上0.8mLABTS•+工作液的吸光值；B：无水乙醇加上0.8mLABTS•+工作液的吸光值。大米清酒测定方法同上。1.2.1.3糯米清酒铁离子还原能力的测定pH6.6磷酸盐缓冲溶液的制备（0.2mol/L）：取1.74g磷酸二氢钠、1.7g氯化钠、2.7g磷酸氢二钠，加蒸馏水使其溶解，并定容至400mL。取2.5mL配制好的磷酸盐缓冲液于试管中，选取添加量分别为50、100、150、200、250μL的糯米清酒溶液，混合均匀后再加入1mL1%的铁氰化钾溶液，于50℃下水浴20min，水浴结束后进行快速冷却，再加入1mL10%的三氯乙酸溶液，静置1min，取上清液2.5mL于试管中，并向试管中加入0.5mL0.1%三氯化铁溶液与2.5mL蒸馏水，静置5min，再在波长700nm处测定其吸光值[92]。大米清酒测定方法同上。1.2.2糯米清酒的抗菌性测定1.2.2.1糯米清酒的前处理真空冻干技术，可以最大限度的保留食品原料中的营养成分和功能性成分，因此选用了冻干技术进行处理。取一定量酿制好的糯米清酒，利用真空旋转蒸发仪在45℃下蒸发糯米清酒，并使用冻干机进行冻干，试验中按照所需浓度进行配制使用。MH肉汤培养基（MHB）：由牛肉粉、可溶性淀粉和酸水解酪蛋白配制而成。脑心浸液培养基（BHI）：由小牛脑浸粉、牛心浸粉、D-葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钠和琼脂配置而成。表4-1试验菌株及培养条件Table4-1Experimentalstrainsandcultureconditions菌株温度培养基时间大肠杆菌（O157）37℃MHB24h金黄色葡萄球菌（503）37℃MHB24h变形链球菌（3289）37℃BHI24h1.2.2.2细菌培养液的制备MHB培养液：将21gMHB培养基加入1000mL蒸馏水中混合均匀，待溶解后于121℃下灭菌15min，至冷却后冷藏保存备用。BHI培养液：将37gBHI培养基加入1000mL蒸馏水中混合均匀，待溶解后于121℃下灭菌15min，至冷却后冷藏保存备用[93]。1.2.2.3细菌的培养细菌培养过程中的操作应全程在无菌室的无菌操作台上进行。将20µL大肠杆菌菌液放入10mL无菌离心管中，再加入2mLMHB培养液，充分混匀后置于恒温震荡培养箱中培养24h。金黄色葡萄球菌操作如上。在10mL无菌离心管中放入20µL变形链球菌菌液，再加入2mLBHI培养液，充分混匀后置于恒温震荡培养箱中培养24h。1.2.2.4抗菌性测试本研究采用双倍连续稀释法，抗菌性测试全程均需在无菌室完成。取适量糯米清酒，用相同体积的二甲基亚砜（DMSO）进行溶解，在无菌96孔板中加入100µL培养液，使用酶标仪在650nm处测定加菌后96孔板的吸光度值，读取并保存数据，然后将96孔板置于恒温培养箱中培养24h，取出后再次测定吸光度值并保存数据。根据公式计算出抑菌率并确定最小抑菌浓度（MIC），公式（4-3）如下（4-3）A：试验组培养24h后的吸光度值；B：空白对照组培养24h后的吸光度值；C：空白对照组培养24h前的吸光度值；D：试验组培养24h前的吸光度值。1.3试验结果与分析1.3.1糯米清酒抗氧化性研究1.3.1.1糯米清酒DPPH•清除能力图4-1糯米清酒、大米清酒的DPPH•清除率Figure4-1DPPH•clearancerateofglutinousricesake.DPPH•呈现一种深紫色较为稳定的状态，在517nm处存在最大吸收峰，因此当待测样品溶液具有抗氧化能力时，抗氧化物质与自由基单电子配对，其混合液颜色会从紫色变淡或呈黄色[94]，样液吸光度测得越小，说明其抗氧化性越大。图4-1为糯米清酒、大米清酒与VC对DPPH•清除能力的测定。由图中可以看出，大米清酒与糯米清酒都具有一定的抗氧化能力，VC的抗氧化性远强于两种清酒。但随着添加量的增大，糯米清酒和大米清酒对DPPH•清除率也在升高，证明其抗氧化能力也随之增强，当添加量达到150µL时，其对DPPH•清除速率逐渐变缓，于添加量为250µL时达到最高值，糯米清酒和大米清酒的清除率分别为36.61%、25.10%，证明糯米清酒对DPPH•清除能力高于大米清酒。1.3.1.2糯米清酒ABTS•+清除能力图4-2糯米清酒的ABTS•+清除能力Figure4-2ABTS•+ofGlutinousRiceSakeClearAbility图4-2为糯米清酒、大米清酒和VC对ABTS•+清除能力的测定，由图中可以看出，糯米清酒与大米清酒随着添加量的增加其ABTS•+清除能力也随之增加，在添加量为250µL时，对ABTS•+清除率达到最大值，分别为43.78%、32.16%。刘晓艳等人[95]选用广东客家黄酒测定其ABTS•+清除能力，检测出当添加量达到20µL/mL时，客家黄酒的ABTS•+清除率与VE相当，由此可见，糯米清酒对ABTS•+清除能力高于大米清酒，具有一定的抗氧化能力。1.3.1.3糯米清酒铁离子还原能力KriengsakT[96]等人对番石榴提取物的抗氧化能力进行测定，运用方法为测定ABTS•+清除率、DPPH•清除率和铁离子还原能力等，在进行对比时发现以测定铁离子还原能力的方法测定样品的抗氧化性具有诸多优点，如操作简便、简洁快速、准确度高等。图4-3为糯米清酒、大米清酒对铁离子还原能力，由图中可看出，糯米清酒及大米清酒的还原能力总体上呈上升趋势，但在添加量低于150µL时其还原能力均呈现缓慢趋势，而当添加量高于150µL时其还原能力呈现高速上升的状态，直至添加量达到250µL时得到最高铁离子还原能力，糯米清酒及大米清酒分别为2.01、1.25，糯米清酒的还原能力远高于大米清酒。图4-3糯米清酒的铁离子还原能力Figure4-3Ironreductionabilityofglutinousricesake1.3.1.4糯米清酒抗氧化能力相关性分析表4-2糯米清酒中多酚、黄酮与抗氧化能力的相关性分析Table4-2Correlationanalysisofpolyphenols,flavonoidsandantioxidantcapacityinglutinousricesake相关系数多酚总黄酮DPPH•ABTS•+铁离子糯米清酒多酚1总黄酮0.988**1DPPH•0.8590.8461ABTS•+0.989**0.983**0.925*1铁离子0.8700.901*0.5620.8101注：*和**分别表示相关性显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）。由表4-2可知，糯米清酒的三种抗氧化能力均与多酚及总黄酮含量呈现正相关关系，其相关性强度存在差异，DPPH•清除率与多酚、总黄酮含量相关性不显著，其相关系数分别是0.859、0.846；ABTS•+清除率与多酚、总黄酮含量呈现极显著正相关关系，相关系数分别是0.989、0.983；铁离子清除能力与多酚含量呈正相关性，其相关系数为0.870，与总黄酮含量呈现显著正相关性，相关系数为0.901。由此可见，糯米清酒的抗氧化能力与多酚及总黄酮含量存在一定相关性。1.3.2糯米清酒的抗菌性测定由表4-3可以看出糯米清酒提取物的石油醚层、乙酸乙酯层和水层对金黄色葡萄球菌（503）及变形链球菌（3289）均无抗菌性，而提取物的乙酸乙酯层对大肠杆菌（O157）有明显抗菌性，其MIC值（最小抑菌浓度）为128µg/mL。大肠杆菌是致病菌，当其浓度过高时会对人体造成伤害，如胃肠道感染、尿道感染、关节炎、脑膜炎及败血性感染等。表4-3糯米清酒冻干粉对不同细菌的MIC（µg/mL）Table4-3Antibacterialpropertiesofglutinousricesake菌种石油醚乙酸乙酯水金黄色葡萄球菌>256>256>256变形链球菌>256>256>256大肠杆菌>256128>256>256：代表没有抗菌性。1.4讨论经试验研究发现，糯米清酒对DPPH•清除能力和ABTS•+清除能力均高于大米清酒，且糯米清酒对ABTS•+清除能力与多酚和总黄酮含量呈极显著