心血管系统与消化系统蛋白质组学研究进展

1第十一讲：

心血管疾病蛋白质组学与

消化系统疾病蛋白质组学研究进展重庆医科大学药学院邱宗荫zongyin141@126.com2Ⅰ、心血管疾病蛋白质组学研究Ⅱ、脂肪组织的蛋白质组学研究Ⅲ、幽门螺旋杆菌的蛋白质组学研究3Ⅰ、心血管疾病蛋白质组学CardiovascularProteomics4心血管系统心血管系统由心脏、血管和调节血液循环的神经体液装置所组成，其功能是通过血液将氧和营养物质供给组织，将组织代谢废物运出。Thehumanheartbeatsover100,000timesandmoves5700litersofbloodeachdaythroughoutthelifetimeofanindividual.5心血管疾病心脏和血管疾病（心血管疾病）是多种疾病的总称。包括动脉粥样硬化，冠状动脉粥样硬化症，冠状动脉硬化性心脏病，血栓阻塞部分心脏内的血液流动引起的心脏病发作，高血压病，风湿病，心力衰竭，心律失常，心脏瓣膜疾病，向大脑供血的血管发生阻塞引起的缺血性中风，大脑内的血管破裂引起的出血性中风等。6卫生部心血管病防治研究中心：

中国心血管病报告2006中国处于经济转型期，人们的生活方式发生重大变化。总体上看，中国人口预期寿命有所延长，但以心血管病为代表的慢性病日趋增加，发病年龄前移。心血管病的高发病率、高致残率和高死亡率给社会与居民造成沉重负担，已成为重大的公共卫生问题。1990～2005年，中国农村居民心血管病死亡率波动160～240人/10万人，城市居民为210～240人/10万人，居死因构成首位。估计每年全国心血管病死亡300万人，占总死亡人数的1/3强。7

中国心血管病危险因素水平持续升高中国每年新增加高血压病患1000万人，估计2006年高血压人数已达2亿。血压升高是心血管病发病和死亡的主要危险因素；血压升高与糖尿病、慢性肾脏病发生和总死亡密切相关。高血压患病率城乡差距逐渐缩小，甚至农村人群收缩压水平高于城市。中国每年新增加血脂异常病患1000万人，估计2006年血脂异常人数已达2亿。高胆固醇血症患病率为2.9%，估计2006年全国有高胆固醇血症患者近3000万。血清总胆固醇水平升高与缺血性心血管病密切相关。8中国每年至少新增加超重人数1000万人，估计2006年超重人数超过2.4亿，肥胖人数达到7000万。中国儿童超重/肥胖率增长较快。超重/肥胖或腹性肥胖与高血压、糖尿病、冠心病及脑卒中发病均有关。体重指数(BodyMassIndex,BMI)与总死亡及心血管病死亡存在“U”型关系。近年来，糖尿病发病增长速度较快，估计2006年糖尿病人数超过3000万。代谢综合征是多个危险因素的聚集体，局部地区调查患病率约10%～20%。中国15岁以上人群吸烟率为35.8%，全国烟民高达3.5亿人，被动吸烟者为5.4亿。15～19岁青年吸烟率呈上升趋势；开始吸烟的年龄较1984年提前了4～5年。9中国大部分农民和城市中青年居民均缺乏体力活动，体力活动不足是导致超重/肥胖、血脂异常、糖尿病、高血压的危险因素。中国居民膳食结构不尽合理，城乡居民谷类摄入量呈减少趋势，脂肪摄入量呈上升趋势。脂肪摄入量过多是导致超重/肥胖、血脂异常、糖尿病、高血压等危险因素水平上升的重要原因。10CardiovascularProteomics应用蛋白质组学技术从整体上分析心血管系统的蛋白质组成成分的动态变化，了解蛋白质间的相互作用，将有助于阐明心血管疾病发病的分子机制和筛选特异的生物标志物。PubDate:

December200611ApplicationsofproteomicsincardiovasculardiseaseUnderstandingofnovelpathophysiologicalmechanisms.

Identificationofdiagnostic/prognosticbiomarkersforcardiovasculardisease.

Identificationofnoveltherapeutictargets.

PeterP.Liu,etal.CardiovascularProteomics:ToolstoDevelopNovelBiomarkersandPotentialApplications.JAmCollCardiol,2006;48:1733-1741.(IF9.701)12临床将研究结果主要用于：①从蛋白质水平研究相关心血管疾病的发病机制；②应用心血管疾病蛋白标记物来更早、更准确地检测心血管疾病，尤其是急性冠脉综合征(ACS)；③蛋白质组学来源的信息作为目前患者诊断的补充；④蛋白质组检测获得的信息有利于个体化治疗，为其提供新的治疗靶位；⑤蛋白质组学检测工具和信息用于治疗的各个阶段，可以适时评估治疗的效果和校正治疗方案。132-DEHeartProteinDatabasesAccessibleViaWWWDatabaseNameInstituteOrganWebsiteHSC-2DPAGEHeartScienceCentre,HarefieldHospitalHumanheart(ventricle)Ratheart(ventricle)Dogheart(ventricle)http://www.doc.ic.ac.uk/vip/hsc-2dpage/HP-2DPAGEHeart2-DDatabase,MDC,BerlinHumanheart(ventricle)http://www.mdc-berlin.de/emu/heart/HEART-2DPAGEGermanHeartInstitute,BerlinHumanheart(ventricle)Humanheart(atrium)http://userpage.chemie.fu-berlin.de/pleiss/dhzb.htmlRATHEART-2DPAGEGermanHeartInstitute,BerlinRathearthttp://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D/RAT-HEART/2days/EmmaMcGregor,MichaelJ.Dunn.ProteomicsoftheHeart.CirculationResearch.2006;98:30914A2DEseparationof80µgofheart(ventricle)proteins.Thefirstdimensioncomprisedan18-cmnonlinear(NL)pH3to10IPGsubjectedtoisoelectricfocusing.Theseconddimensionwasa21-cm12%SDSgel.Proteinsweredetectedbysilverstaining.TheNLpHrangeofthefirst-dimensionIPGstripisindicatedalongthetopofthegel,acidicpHtotheleft.TheMrscalecanbeusedtoestimatethemolecularweightsoftheseparatedproteins.15LCMofhumancardiactissueA,Cardiacmyocytes.B,Bloodvessels.NLindicatesnonlinear.16Proteomics-basedDevelopmentofBiomarkers

inCardiovascularDisease

Mechanistic,Clinical,andTherapeuticInsightsManuelMayr,etal.Molecular&CellularProteomics5:1853-1864,2006.17Understandingthesediseasestatesandtheirperturbationsrequiresclarificationofmechanisticchangesinorganphenotypeovertime,theinfluenceofgeneticvariations,andtheeffectsofpharmacologic,surgical,andinterventionaltreatment.(了解心血管疾病及其紊乱状态需要弄清器官表型的经时变化、基因变异的影响、以及药物干预,外科处理和介入治疗所带来的影响)Theserequirementshavebeenaddressed,inpart,bygenetic,biochemical,andsystemapproaches.18It

isclear,however,thatknowledgeoftheDNAsequence,although

essential,isnotsufficient.Amoremeaningfulunderstanding

ofgeneexpressioncanbeachievedthroughcharacterization

oftheproductsofthatexpression,theproteinsthatarethe

essentialbiologicaldeterminantsofdiseasephenotype.The

ultimatephenotypeofcell,organ,andorganismisreflected

intheinstantaneousproteomicprofile;similarlychangesin

humanstatesofhealtharetheresultofchangesintheproteomes

ofindividualpatientsovertimeinresponsetoendogenousand/or

externalstimuli.(细胞,器官,机体的最终表型都反映在对于适时蛋白质组的描述;处于健康状态的人体对于内源性和/或外源性刺激的经时性应答的变化会反映在患者个体蛋白质组的变化上面)19Theadventofnovelproteomicapproachesto

investigatethecomplexityofhumanillnesspromisestoshed

newlightonthepathogenesisofabroadrangeofcardiovascular

diseases.(蛋白质组学途径对于在广泛范围内研究人类心血管疾病的复杂机制带来新的曙光)Theseinferencesaremultifacetedandincludethe

commonlyrecognizedroleofproteomicsincharacterizingbiomarkers

andbiosignaturesfortheprognosisanddiagnosisofdisease,

thecapabilityofthesetechnologiesofrevealinginformation

regardingfunctionalsubproteomesoforganellesandnetworks

intheheartandvasculature,andtheimportanceofproteomics

indefiningchangesinthesefunctionalsubproteomestoguide

futuretherapy.

20PROTEOMICSANDCARDIOVASCULARDISEASESProteomicAnalysisinDiseasedCardiacPhenotypesVascularProteomicsAtherosclerotic(动脉粥样硬化)CardiovascularDiseaseHypertension(AnimalModels;InVitroModels)CongenitalHeartDisease(先天性心脏病)

21ORGANELLEPROTEOMICSANDCARDIOVASCULARPHENOTYPES

细胞器蛋白质组学与心血管表型

Themanycelltypesinthecardiovascularsystemincludecardiac

myocytes(心肌细胞),vascularsmoothmusclecells(血管平滑肌细胞),fibroblasts(纤维原细胞),andvascular

endothelialcells(血管内皮细胞).Althoughtheprecisenumberofproteinshosted

bythecardiovascularproteomeisdebated,thetremendouscomplexity

ofthecellularproteomesiswidelyrecognizedandisclearly

beyondtheanalyticalcapabilitiesofcurrentproteomictechnologies.(虽然对心血管蛋白质组中的蛋白质数量还有争议,但一致公认的是,其中的细胞蛋白质组是非常复杂的,并且以现有的蛋白质组学研究技术尚不能充分了解这种复杂性)22Reductionofthiscomplexityeitherbydividingthetargetinto

moremanageablefractionsorbyfocusingonspecificorganelle

proteomesaffordsanattractivealternativeand,moreimportantly,

representsanattainablegoalforbetterspatialandfunctional

correlationsoftheidentifiedproteins.(为了降低这种复杂性,可以采取两种方式:1、把研究对象分组为较为简单的几个部分,分别进行研究;2、进行细胞器蛋白质组学的研究,这种研究方式可以同时了解所鉴定蛋白质的功能与细胞内定位的关系)23OrganelleproteomicapproachInthisapproach,theidentifiedproteinscomewithdistinctsubcellularlocations,whichareoftencoupledwiththebiologicalprocessesinwhichtheyparticipate,thusprovidingthefunctionalsignificanceofproteomicdata.Amongtheessentialcardiovascularcellularorganelles,mitochondria(线粒体),caveolae(细胞膜穴样内陷,质膜微囊),andproteasomes(蛋白酶体)havereceivedattention.24Fuctionsofmitochondria：1、oxidativephosphorylationandenergysupply2、maintenancetheintracellularbalanceofmetabolitesandions3、protectthecellfromtoxitationofproductsofOXPHOS(氧化磷酸化)4、playasignificantroleincellnecrosisandapoptosis我也参与真核细胞的决策,并不仅仅是一台处于幕后的发动机25ÅsaB.GustafssonandRobertaA.Gottlieb.

Heartmitochondria:gatesoflifeanddeath.

CardiovascRes

2007

0:cvm005v2-10Mitochondriaareimportantgeneratorsofenergy,providingATP

throughoxidativephosphorylation.However,mitochondriaalso

monitorcomplexinformationfromtheenvironmentandintracellular

milieu,includingthepresenceorabsenceofgrowthfactors,

oxygen,reactiveoxygenspecies(活性氧,ROS),andDNAdamage.Mitochondriaasacentralintegratorofmultiplestresssignals(胁迫信号).26Mitochondria

havebeenimplicatedinthelossofcellsinvariouscardiac

pathologies,includingischaemia/reperfusioninjury(缺血-再灌注损伤),cardiomyopathy(心肌病),

andcongestiveheartfailure(慢性充血性心力衰竭,CHF).Thereleaseoffactorssuchas

cytochromec(细胞色素C),secondmitochondria-derivedactivatorofcaspases(Smac,第二个线粒体来源的半胱氨酸酶激活剂Smac)，Omi/Htr2A(HtrA是线粒体丝氨酸蛋白酶家族新成员,Omi指mitochondrialintermembranespace即线粒体膜间隙),andAIF(凋亡诱导因子,apoptosis-inducingfactor)frommitochondriaserves

toactivateahighlycomplexandregulatedcelldeathprogram.

Furthermore,mitochondrialcalciumoverload(线粒体Ca2+超载)mighttriggeropening

ofthemitochondrialpermeabilitytransitionpore(MPTP,线粒体通透性转运孔),causinguncoupling

ofoxidativephosphorylation,swellingofthemitochondriadue

toinfluxofwater,andruptureofthemitochondrialoutermembrane.

27Generalstrategyfororganelle-basedproteomics:exampleofcardiacmitochondriaBN/SDS是一种适合于多蛋白复合物(multi-proteincomplexes,MPCs)分离的双向电泳技术。其第一向的BN能使分离得到的复合物保持天然状态，因采用CoomassieBlueG250作指示剂而得名。随后的SDS则使复合物的各组分分开，从而使各组分得到有效的分离。

BN/SDS电泳在线粒体呼吸链复合物、多蛋白复合物和蛋白质包涵体的研究中得到广泛应用。28细胞表面的穴样内陷质膜微囊(caveolae)Caveolae是细胞表面50～100nm大小的凹陷,含有Caveolin(一种小分子量的蛋白，21KD)。大量存在于脂肪细胞、上皮细胞和平滑肌细胞。Caveolae参与细胞的胞吞、胞饮作用、胆固醇的转运和信号转导，是细胞的信号处理中心，具有广泛的抑制信号转导的作用。另外，caveolae对血管壁脂质稳态和eNOS功能都起着重要的调节作用，其功能紊乱是动脉粥样硬化发病机制中的重要环节。Caveolae作为细胞表面的一个重要的细胞膜结构受到了人们的普遍关注29Caveolaeandcaveolinstructure.Notetheuniformsizeandshapeofcaveolae(someareindicatedbyarrowheads)andthenumerouscaveolaearoundlargersurface-connectedvacuoles(asterisks).caveolae(arrowheads)inaprimaryfibroblastshowninaconventionalplasticsection.imageathighermagnificationSheetsofplasmamembranefromadipocyteslabelledforcaveolin-1followedby10nmprotein-A-gold.30Caveolae,aunique"cellularorganelle"withaunique"markerprotein"A)Electronmicrographofanendothelialcellshowingcaveolae,50-100nmstructuresthatareeitherdirectinvaginationsorincloseproximitytotheplasmamembrane.Caveolaeareestimatedtomake-upanestimated30-70%oftheplasmamembraneareaincertaincellssuchasendothelialcells,adipocytes(脂肪细胞),orTypeIpneumocytes(Ⅰ型肺泡细胞).B)Diagramcomparingthebiochemicalcompositionoflipidrafts(脂筏,是膜脂双层内含有特殊脂质和蛋白质的微区。其组分和结构特点有利于蛋白质之间相互作用和构向转化，可以参与信号转导和蛋白质转运。)andcaveolae(adaptedfrom(Galbiatietal.,2001)).Lipidraftsformviaacoalescenceofcholesterolandsphingolipids;asaresult,thesemicrodomainshavevastlydifferentbiochemicalpropertiesthanthebulkphospholipidsbilayer.Caveolaearegenerallyconsideredtobe"invaginated"lipidraftsprimarilyduetoanenrichmentinafamilyorproteinsknownasthecaveolins.Here,thecaveolinoligomerisdepictedasadimerforsimplicity.31蛋白酶体,蛋白水解小体

(proteasome)Proteasome是细胞中调节蛋白质降解最重要的细胞器，具有调控基因表达，细胞分化，细胞凋亡和信号转导等重要的生理功能，与多种疾病的发生相关。Proteasome由10～20个不同的亚基组成中空的圆桶形的结构。这些亚基在动态细胞中形成结构不一的蛋白水解小体复合物，既存在于细胞核中，又存在于胞质溶胶中。蛋白酶体是溶酶体外的蛋白水解体系，主要降解两种类型的蛋白质：错误折叠的蛋白质和需要进行数量调控的蛋白质。蛋白酶体对蛋白质的降解通过泛素(ubiquitin)介导，所以又称为泛素降解途径。32Organelleproteomicsinthecardiovascularsystem33Typesofbiomarkers/biosignaturestobeusedforcardiovasculardisease.Thereareatleastthreedifferenttypesofbiomarkersthatcanbedevelopedforcardiovascularmedicine,includingmechanisticmarkers,clinicaldiseasemarkers,andtherapeuticmarkers.与心血管病医学有关的生物标志物至少可以分为三种类型:机制标志物,临床疾病标志物,治疗标志物。

34MechanisticmarkersInthefirstgroup,changesinthesubcellularphenotypeoftheorganismcanleadtoalterationsinproteinsdetectableasmarkers.Thesechanges,constitutingmechanisticmarkers,arecloselyreflectiveofwhatisgoingoninthecellandhowthesignalingpathwaysaremanipulated.机制标志物是指机体亚细胞表型发生改变时出现的可检测的蛋白质变化。它们反映出细胞的病理变化以及与之相关的信号通路的变化。35ClinicaldiseasemarkersSecond,thearrivalofdiseasecarrieswithitchangesinproteinsthataredetectedbyproteomics,so-calledclinicaldiseasemarkers.Thesemarkersarespecifictotheindividualdiseasestateandcanindicatethestateofprogression,severity,andlocationofthesyndrome.临床疾病标志物是指可通过蛋白质组学方法检测的，伴随疾病而来的蛋白质变化。它们具有与疾病个体相关的特异性，能指示出疾病的进程、严重程度和症状部位。36TherapeuticmarkersLastlytherapeuticmarkersarethosethatbecomeevidentasthetreatmentofachronicdiseaseprogressesinthepatient.Thesemarkersareinfluencedbymanyfactors,includingindividualnatureofthedisease,drugtreatment,patientactivities,etc.治疗标志物反映慢性病治疗进程。这些标志物受多种因素影响,如疾病个体的性质、治疗药物、患者行为等。37这些标志物的变化可用于调整临床处理方案这些标志物可以指示出与治疗有关的亚细胞机制这些标志物有助认识疾病的分子起源,提示调节表型的细胞治疗方向38案例:慢性心肌缺血中的自噬作用LinYan,etal.AutophagyinchronicallyischemicmyocardiumProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(PNAS),September27,2005vol.102no.3913807–1381239细胞的死亡人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点多数学者将细胞的死亡形式分为凋亡性程序性细胞死亡(Apoptosis)、自噬性程序性细胞死亡(Autophagy)和细胞坏死(Necrosis)三种类型。

MaryC,AbrahamandShaiShaham.(2004)Deathwithoutcaspases,caspaseswithoutdeath.TRENDsCellBiol14(4):184-193.

40自噬与凋亡自噬“自己吃自己”，是凋亡之外的第二种程序性细胞死亡方式。细胞的自噬被认为是参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解。自噬一旦被过分激活，就会导致自噬性细胞死亡（AutophagicCellDeath），这是有别于凋亡的另一种程序性细胞死亡。凋亡也称为Ⅰ型程序性细胞死亡，是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。细胞凋亡是机体清除多余、变异或恶化细胞的一种主动、程序化生理过程。该过程的正常与紊乱与机体进行新陈代谢、保持自身相对稳定以及肿瘤发生等密切相关。41Progressionofcellapoptosis,visualisedwithAnnexinV-OregonGreen.ApoptosisofWBC凋亡细胞的典型形态学特点表现为：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最后被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬；磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。

42自噬与自噬性细胞死亡自噬(Autophagy)是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬是进化过程中高度保守的自我保护机制，是营养缺乏时细胞的适应性反应，是细胞内的再循环系统，可为生物合成提供循环利用的原料。自噬作为一种细胞生存的机制，在很多生理过程中发挥着重要的作用。自噬受许多信号通路，包括TOR、PI3K、Beclin1及Ca2+等的调控。43哺乳动物细胞autophagy的

三种主要方式：根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞autophagy可分为三种主要方式：大自噬（Macroautophagy）：由内质网来源的膜包绕待降解物形成自噬体，然后与溶酶体融合并降解其内容物。小自噬（Microautophagy）：溶酶体的膜直接包裹长寿命蛋白等，并在溶酶体内降解。分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediatedautophagy，CMA)：胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化。44错调的自噬作用与多种疾病有关自噬可能对许多疾病包括心肌缺血/再灌注损伤、神经退行性疾病、肿瘤、感染等的发病机制和防治策略提出新的观点。慢性心肌缺血过程中自噬性保护作用可能是“聪明心肌”的一种应对策略，合理调控心肌细胞的自噬作用，有助于维持心肌细胞稳态、减少细胞缺失。在2008年10月8日出版的《细胞—代谢》（CellMetabolism）上，两个国际研究小组证实胰腺β细胞自噬与糖尿病有关。45HyeSeungJung,Myung-ShikLee.CellMetabolism,2008,October

Vol8,318-324

ChieEbato,HirotakaWatada.CellMetabolism,2008,October

Vol8,325-332（封面图片：背景图片显示了高脂肪饮食小鼠的胰腺组织的电子显微镜图像，其中表现出一个自噬体螯合线粒体和胰岛素颗粒的过程。下面右侧的免疫组织化学图像显示了缺少自噬相关基因atg7的胰岛β细胞存在损伤标志物p62（绿色部分）的聚集。其中红色部分为胰岛素，蓝色部分为细胞核。左侧图像显示出atg7-/-胰岛当中p62内含体的发展过程。图像提供：Ebato等）46胰腺β细胞自噬与糖尿病的关联来自韩国和日本的一组科学家利用了一种特异性去除Atg7（自噬相关7）基因胰腺β细胞的小鼠，Atg7变异的小鼠表现出葡萄糖耐量减低（impairedglucosetolerance）以及血清胰岛素浓度的降低。由于细胞凋亡的增加以及β细胞分裂增生程度的降低，导致β细胞数量和胰腺中胰岛素的减少。

生理学分析显示，在小鼠中存在血糖激发的胰岛素分泌的降低，并且自噬作用缺陷的β细胞中血糖诱导的胞内钙离子瞬变过程也被破坏。而形态学分析则表明存在泛素蛋白（ubiquitinatedprotein）的聚集，这种现象与p62共存，并伴随着线粒体肿胀、内质网膨胀以及β细胞液泡的变化。以上研究结果表明,自噬作用对于维持胰腺β细胞的结构、数量以及功能都是非常重要的，自噬作用的破坏将导致胰岛素的缺乏以及高血糖症的发生。

47另一篇文章中，来自日本的一组科学家称他们发现了糖尿病db/db小鼠以及高脂饮食C57BL/6小鼠的胰腺β细胞中存在自噬作用的升调节。而能导致糖尿病相关的外周胰岛素抵抗的游离脂肪酸（freefattyacidFFA）诱导胰腺β细胞自噬作用发生。对于atg7基因的消除将导致胰岛退化、胰岛素分泌以及葡萄糖耐量降低。

与此同时研究人员还观察到，尽管在对照组小鼠中高脂肪含量的饮食能激发胰腺β细胞自噬，但是对于自噬不足变异小鼠而言，这将形成葡萄糖耐量的恶化，以上现象发生的部分原因在于缺乏胰腺β细胞数量的补偿性增加。

因此，基础自噬作用对于维持正常的胰岛结构和功能至关重要。当存在高脂肪饮食诱导的胰岛素抵抗时，自噬作用是一种胰腺β细胞的独特适应性反应。48Autophagy,amembranetraffickingprocessleadingtolysosomaldegradation,isimplicatedincancer,neurodegeneration,andaging.细胞的自噬过程在形态学上，即将发生自噬的细胞胞浆中出现大量游离的膜性结构，称为前自噬泡。前自噬泡逐渐发展成为由双层膜结构形成的自噬泡，其中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞浆。自噬泡的外膜与溶酶体膜融合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解。此过程使进入溶酶体中的物质分解为其组成成分，并被细胞再利用，这种吞噬了细胞内成分的溶酶体被称为自噬溶酶体。自噬泡Autolysosomes自噬溶酶体

49自噬过程的形态学观察(B)Starvation-inducedautophagosomes(AP,自噬体)andautolysosomes(AL,自噬溶酶体

)inthefatbody(thefunctionalanalogueoftheliver)ofafruitflylarva.NotethatAPscontainintactcytoplasm,whereasthecontentsofALsshowvariousstagesofdegradation.(C)LivercellsofstarvedmicecarryingafluorescentlytaggedLC3transgene,labelingcup-shapedandring-shapedstructuresthatcorrespondtoIMsandautophagosomes,respectively.Autophagy/xenophagy(异体吞噬)Autophagy“eatonself”Xenophagy“eatforeignmatter”HighlyconservedandregulatedprocessthatmaintainscellularhomeostasisandprotectscellsagainststarvationandmicrobeinvasionTheparasiteToxoplasmagondii,strippedofitsprotectivemembrane,isenvelopedbyadouble-membranedsacandreadytobeconsumedbylysosomes.The“surprisinglyaggressive”processiscalledautophagy.Credit:DavidFerguson,OxfordUniversity51Xenophagy可以说，‘自然界是节约型的’（natureisthrifty），我们正在自噬作用中验证这一理论。最近两年的实验证明自噬作用可以杀死病毒和细菌，现在我们可以说自噬作用还可以杀死寄生虫。”自噬作用可以消灭致病性入侵者的新发现的功能。GeorgeYap,etal.DeathofaParasite:Stripped,Surrounded,Consumed.JournalofExperimentalMedicine.52Autophagyinchronicallyischemicmyocardium1、动物模型的制作2、自噬形态学的电镜观察3、蛋白的提取4、双相电泳分离5、MALDITOFMS分析6、数据库搜索7、差异表达蛋白的WB验证与定位研究53动物模型的制作Chronicallyinstrumentedpigswerestudiedwithrepetitivemyocardialischemiaproducedbyone,three,orsixepisodesof90minofcoronarystenosis(冠状动脉狭窄)[30%reductioninbaselinecoronaryflowfollowedbyreperfusion(再灌注)every12h]withthenon-ISregionascontrol.Inthismodel,wallthickeningintheISregionwaschronicallydepressedby≈37%.

54ElectronmicrographsofdifferenttypesofAVsobservedinthesix-episodechronicallyISregion(A–C)andsix-episodeNIregion(D).(A)Autophagicvacuoles(Avs,自体吞噬泡)containingremnantsofmitochondriaaredemonstrated.(B)DoublemembraneAVscontainingrecognizablecytoplasmiccontentsaredisplayed.(C)AVscontainingmultivesicularbodiessurroundedbyasequesteringmembranearedemonstrated.(D)TheseAVswerenotobservedinthesix-episodeNI.ArrowsindicateAVs.(Magnifications:1,400–2,000,A–D;5,000,AandBInsets.)55AlterationofcathepsinDinchronicallyISmyocardium.(Upper)2DgelmapofproteinextractsfromchronicallyISregionaftersixepisodes.(Lower)AmagnifiedgelregionfromtheNIregion(Left)andtheISaftereitherthree(Center)orsix(Right)episodesofCS.ArrowsindicatethespotsaftersixepisodesthatwerealllateridentifiedascathepsinD.MW,molecularweight.Eachlowerimageisa6-foldmagnificationfromtheoriginalgel.56ComparisonofexpressionlevelofcathepsinBandDinchronicallyISmyocardiumatdifferentepisodesComparisonofexpressionlevelofcathepsinBandDinchronicallyISmyocardiumatdifferentepisodes.(AandB)WesternblotanalysisofcathepsinD(A)andcathepsinB(B)atsixepisodeschronicallyISvs.NIregions(Upper)andthreeepisodes(Lower).TheexpressionofcathepsinsBandDsignificantlyincreasedatsixepisodes(**,P<0.01;*,P<0.05vs.NI).(C)ThedirectcomparisonoflevelsofcathepsinB(CB)andcathepsinD(CD)inchronicallyISinone,three,andsixepisodes,againshowingmarkedincreasedexpressionofbothproteinsaftersixepisodes.(D)TheelevatedexpressionofcathepsinsBandDwasconfirmedtooccurinmyocytesfromthechronicallyISmyocardium.ADU,arbitrarydensitometricunits.

57EnzymeactivityassaysofcathepsinB(A),cathepsinD(B),andβ-hexosaminidase(C)EnzymeactivityassaysofcathepsinB(A),cathepsinD(B),andβ-hexosaminidase(C).ActivityofbothcathepsinBandDandβ-hexosaminidasewasmuchhigheratsixepisodesinchronicallyISregionvs.NIregioncomparedwiththreeepisodesvs.NI.**,P<0.01vs.NI;*,P<0.05vsNI.58WesternblotanalysisofHsc73atsixepisodeschronicallyISvs.NI(non-IS)myocardium(A)andatthreeepisodesinisolatedmyocytes(B)andcomparingeffectsinnecrotictissueaftermyocardialinfarction(IF)vs.NIregions(C).TheexpressionofHsc73increasedsignificantlyinthechronicallyISofsixepisodes(**,P<0.01vs.NI),butnotintheISafterthreeepisodescomparedwithNI.TheelevationofHsc73aftersixepisodeswasconfirmedinisolatedmyocytes.Incontrast,theexpressionofHsc73decreasedintheinfarctedregion.ADU,arbitrarydensitometricunits.

59Westernblotanalysisofbeclin1atthreeandsixepisodes(chronicallyISvs.NIregions)Westernblotanalysisofbeclin1atthreeandsixepisodes(chronicallyISvs.NIregions)(A)andinisolatedmyocytesfromthechronicallyIS(B)andcomparingeffectsinnecrotictissueaftermyocardialinfarction(IF)vs.NIregions(C).Theexpressionofbeclin1wasincreasedsignificantlyinthechronicallyISaftersixepisodes(*,P<0.05vs.NI),butnotafterthreeepisodes.Theelevationofbeclin1aftersixepisodeswasconfirmedinisolatedmyocytes.Incontrast,theexpressionofbeclin1decreasedintheinfarctedregion.ADU,arbitrarydensitometricunits.60WesternblotanalysisofLC3atsixepisodeschronicallyISvs.NImyocardium.WesternblotanalysisofLC3atsixepisodeschronicallyISvs.NImyocardium.TheLC3-II/LC3-IratiowassignificantlyincreasedinthechronicallyIS(**,P<0.01vs.NI).Westernblottingofactinshowedequalloadingofthesamples.61LocalizationofcathepsinBandduallabelingofcathepsinBandapoptosisLocalizationofcathepsinBandduallabelingofcathepsinBandapoptosis.(A)FluorescentimmunostainingfordetectionofcathepsinBinmyocytesaftersixepisodes.CathepsinB(green)waslocalizedtomyocytes.(BandC)Duallabelingofapoptosis(TUNEL)andcathepsinB.(B)StainingforcathepsinB(blue)wasmoreintenseinareaswhereapoptosiswasabsent.(C)Conversely,myocytesassociatedwithincreasedapoptosis(green)exhibitedmuchlesscathepsinB(indicatedbyblueandthearrow)immunostaining.(Magnification:×430,A;×275,BandC.)

62WesternblotsofcathepsinsBandD,Hsc73,andbeclin1intwopigswithrecoverycomparedaftersixepisodesWesternblotsofcathepsinsBandD,Hsc73,andbeclin1intwopigswithrecoverycomparedaftersixepisodes.ThelevelofallalteredproteinsreturnedtonormalinthepreviouslyISregioncomparedwiththeNIregion.

63结论WedemonstratedincreasedexpressionofcathepsinD,aproteinknowntomediateautophagy.(本研究证实了一种调节自噬过程的蛋白质组织蛋白酶D的表达增加)Additionalautophagicproteins,cathepsinB,heatshockcognateproteinHsc73(akeyproteinmarkerforchaperone-mediatedautophagy),beclin1(amammalianautophagygene),andtheprocessedformofmicrotubule-associatedprotein1lightchain3(amarkerforautophagosomes),werealsoincreased.[此外,还发现组织蛋白酶B、热休克同源蛋白Hsc73(一种分子伴侣介导自噬的关键标志蛋白)、哺乳动物自噬基因beclin1、微管相关蛋白1轻链3(一种自噬泡标志物)的表达增加]64ImmunohistochemistrystainingforcathepsinBwasmoreintenseinareaswhereapoptosiswasabsent.Thus,autophagy,triggeredbyischemia,couldbeahomeostaticmechanism,bywhichapoptosisisinhibitedandthedeleteriouseffectsofchronicischemiaarelimited.

组织蛋白酶D的免疫组化染色结果显示,没有发现明显的凋亡,说明由缺血所触发的自噬是适应性机能,它可以抑制凋亡,减少慢性缺血所带来的有害影响.65Ⅱ、脂肪组织的

蛋白质组学研究近年来，随着脂肪组织内分泌功能的发现，以蛋白质组学的技术和策略对其开展研究成为人们十分关注的一个领域。66脂肪组织(adiposetissue)与脂肪细胞(adipocyte)脂肪组织主要由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶。人体内脂肪细胞的数目以数十亿计。分两种类型：白色脂肪细胞和棕色脂肪细胞。人体内的脂肪组织主要由白色脂肪细胞构成。传统认为脂肪组织是一种惰性组织，起着贮存中性脂肪、供应能量，以及绝缘、减震、调节体温、填充、固定等功能。The

ADIPOCYTE

isaremarkablecelltypeinseveralrespects.

Itstoresexcessenergyintheformoflipidsandisthusable

todramaticallychangeitssizeinaccordancewithchanging

metabolicneeds.Thisabilitygivesadiposetissueanalmost

unlimitedcapacityforgrowth,makingitperhapstheonlytissue

inthebodywiththeabilitytosodrasticallyincreaseits

sizewithoutanunderlyingtransformedcellularphenotype.67根据分布、形态和功能的不同，可分为棕色脂肪组织，白色脂肪组织。棕色脂肪组织(brownadiposetissue):细胞内含有大量的细胞色素C和线粒体而呈棕色，其含量较低，仅占正常人体重的1%（不同体重成人含量为肥胖人＜正常人＜瘦人），其分布有限，仅见于颈、肩、腋窝、肩胛区部位及皮下、甲状腺、肾门、自主神经、嗜铬细胞；其形态呈多边形，直径约60μm，内含多个小脂滴。棕色脂肪组织的主要功能是产生热量68白色脂肪组织(whiteadiposetissue)血管供应少，因而呈白色。在体内含量高，占体重的20%（肥胖人＞正常人＞瘦人）；广泛分布于全身皮下组织及腹腔内；其形态呈圆形，直径约67~98μm，每个细胞含0.6μg脂质（单个大脂滴）。每一正常成人有（26.6±1.8）×109个白色脂肪细胞，肥胖者为正常人的3~5倍，细胞直径及脂质含量较正常人增加2~3倍。白色脂肪组织除了储存能量外，还具有广泛而复杂的内分泌功能。69脂肪组织—内分泌的新器官近年来发现，脂肪组织(脂肪细胞、前脂肪细胞和巨噬细胞)还是一种代谢十分活跃、功能非常复杂的内分泌和旁分泌器官，分泌许多细胞因子和生物活性因子。在2005年第65届美国糖尿病学会（ADA）年会上，脂肪组织源性因子的研究成为一个亮点，PhillipEScherer博士在会上作了题为“脂肪组织：从脂肪储存库到内分泌器官”的精彩报告。脂肪组织作为一个内分泌器官已成为学术界的共识，脂肪内分泌学已成为内分泌学的一个新的领域。70“脂肪组织：从脂肪储存库到内分泌器官”的报告要点脂肪组织及其分泌的脂联素(adiponectin)在胰岛素抵抗、心血管疾病、代谢综合征等发病机制中的重要作用，并以最新建立的转基因小鼠模型对脂肪组织的功能作进一步探讨。脂联素是脂肪细胞中表达最为丰富的激素，在血浆中有相当高的浓度，女性高于男性。脂联素在肥胖、2型糖尿病、心血管疾病和代谢综合征的发病机制中起重要作用，且脂联素研究也涉及伤口愈合、癌症等。脂联素的发现为胰岛素抵抗发病机制的研究开辟了另一条途径，理解脂联素的表达调控和作用机制至关重要。由于脂联素水平与胰岛素敏感性成正比，脂联素将来有可能成为如口服葡萄糖耐量试验一样的诊断工具，成为糖尿病的临床诊断标志物，也应用于心血管疾病和代谢综合征。71脂肪组织能分泌脂肪细胞因子和激素脂肪组织分泌多种细胞因子和生物活性物质（如激素），统称为脂肪因子（adipokines）或脂肪细胞因子（adipocytokines）。它们不仅调控体内能量平衡，而且参与炎症、凝血、纤溶、胰岛素抵抗、糖尿病和动脉粥样硬化，甚至一些癌症的发生。LagoFetal.(2007)Adipokinesasemergingmediatorsofimmuneresponseandinflammation.NatClinPractRheumatol

3:716–724Themultiplefunctionsofwhiteadiposetissueincludethesynthesisandsecretionofadipokines,andtheuptake(摄取),storageandsynthesisoflipids73目前已知脂肪组织分泌的激素及活性物质有：瘦素(leptin，LEP)脂联素(adiponectin，APN)抵抗素(resistin)内脏脂肪素（visfatin）孤儿G蛋白偶联受体APJ的天然配体(apelin)内脏脂肪特异性丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)网膜素(omentin)肝脏分泌的杀菌蛋白[Hepcidin,hepaticbactericidalprotein,Hepc,又称肝脏表达的抗微生物肽(liverexpressedantimicrobialpeptide,LEAP-1)性激素血管紧张素前列腺素E2及前列腺素I2。74细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）白介素6和白介素8胰岛素样生长因子1（IGF-1）胰岛素样生长因子结合蛋白3视黄醇结合蛋白（RBP）酰化刺激蛋白（ASP）补体D固醇脂转化蛋白磷酰化转化蛋白血管内皮生长因子等。新的细胞因子还在不断地被发现。脂肪组织细胞因子·

脂联素·

瘦素·

抵抗素巨噬细胞源性因子·

抵抗素（人）·IL-1β促炎细胞因子与趋化因子·TNF·IL-6·CCL2巨噬细胞脂肪细胞凋亡的脂肪细胞Tilg,H.,andA.R.Moschen.2006.Adipocytokines:mediatorslinkingadiposetissue,inflammationandimmunity.Nat.Rev.Immunol.6:772–783.76脂联素(adiponectin)是一种重要的脂肪细胞因子家族成员Adiponectin在血中有较高的浓度(5～30μg/ml),几乎占血浆总蛋白的0.01％。肥胖者其血浆水平却降低,在糖尿病、冠状动脉疾病患者其水平也低于正常。Adiponectin与胰岛素抵抗有密切联系,并可能有抗动脉粥样硬化的作用。PhilippE.Scherer.AdiposeTissue,FromLipidStorageCompartmenttoEndocrineOrganDiabetes55:1537-1545,200677脂联素又被称作Acrp30、apM1、AdipoQ、GBP28人体内的脂联素由244个氨基酸组成，分子量为30KD，由氨基末端的分泌信号序列(

aa

1-18)

，一段特异序列(aa19-41)，一组由22个氨基酸组成的胶原重复序列(aa

42-107)，一段球状序列(aa108-244)组成。其中球状区是脂联素生物活性的关键部位。脂联素的单聚体和三聚体是其生物活性形式或受体亲和配基,

可以特异性结合骨骼肌或肝脏细胞膜上的G蛋白偶联受体一型或二型脂联素受体，

进而调节脂肪酸氧化和糖代谢