应用微生物学

应用微生物学AppliedMicrobiology应用微生物学概论微生物的生长微生物的代谢微生物的遗传与遗传育种微生物基因工程应用微生物的基因操作系统酶工程与生物转化微生物发酵微生物代谢工程概论

基本概念应用微生物学的发展微生物细胞的结构重要的应用微生物定义应用微生物学:以一定的直接或间接应用目标研究微生物及其相互作用和与环境的作用的科学。(appliedmicrobiology)微生物学与相关的生物技术相结合，以实现一定的直接或间接应用目标。(microbiologyinapplication)微生物的特点资源量大（多样性丰富）生物量大（生长迅速）可塑性大（便于操作）个体小（便于运输、携带）完成自然界的物质循环造福人类引起灾难当前人类面临的问题资源的压力环境的挑战传染病的新生与复发应用微生物学研究的一般流程应用微生物学的发展

微生物学的发展是与应用紧密联系的微生物细胞的结构细胞壁——形态保持、物质交换、信号识别细胞膜——转运细胞质——酶、反应场所细胞核——遗传物质核外遗传物质——线粒体、质粒重要的应用微生物病毒：ג-噬菌体细菌：大肠杆菌(E.coli)棒杆菌(Corynebacterium)放线菌：链霉菌(Streptomyces)酵母菌：酿酒酵母(Saccharomycescerevisia)真菌：曲霉(Aspergillus)第一章

微生物的生长微生物生长的条件培养基生长动力学

微生物细胞的化学组成细胞中几种主要元素的含量(干重的百分数)

细胞干物质中主要组分和含量(%)

元素细菌酵母菌霉菌C50~5345~5040~63N12~157.5~12.47~10O~20~30~40H~8~7~7细菌酵母菌霉菌蛋白质50~8032~7520~40碳水化合物12~2827~637~10脂类5~202~154~40核酸10~206~81灰分物质2~107~105~10微生物生长的条件—物质条件水aw=P/P0微生物类群最低aw值细菌0.91酵母菌0.88霉菌0.80耐干霉菌0.65耐高渗酵母菌0.60微生物生长的条件—物质条件碳源和氮源OHPSKCaMgFeMnCuZnMoCoNiVBClNaSi维生素、氨基酸等微生物生长的条件—环境条件pH中性（弱酸、碱）、嗜酸、嗜碱温度最适、生长、耐受氧气严格（专性）好氧、兼性、耐氧厌氧、严格厌氧压力渗透压极端环境微生物(extremophile)不可培养微生物(VBNCvivebutnon-cultured)极端微生物与不可培养微生物极端环境微生物(extremophile):依赖于一种或多种极端物化因子生存的微生物嗜热菌：50-80°C(hyperthermophiles>80°C)嗜冷菌：<16°C嗜酸菌：<3嗜碱菌：>9嗜盐菌：>3M嗜压菌不可培养微生物(VBNCvivebutnon-cultured)培养基

提供微生物生长所需物质与环境条件的体系

培养基的组成要素碳源、氮源、提供各种元素的无机盐生长因子或含生长因子的物质水、固化基（固体培养基）pH、渗透压（糖、盐浓度）、灭菌条件培养基的种类按物理状态：固体、液体、半固体按化学组成：合成、丰富、半合成按使用目的：种子、发酵、筛选、再生、富集……培养基的选择和设计原则适用：利于达到目的利于下游工艺重复性好经济：原料价格原料用量全工艺综合平衡安全：环境影响生物安全培养基的选择和设计是应用微生物学研究的重要内容生长动力学增值曲线（Multiplicationcurve）：细胞数-时间生长曲线（growthcurve）：细胞量-时间微生物生长的实验计量显微计数菌落计数浊度测定细胞干重微生物生长的数学描述比生长速度(specificgrowthrate)

=dx/xdt细菌0.6-1.2酵母菌0.3-0.5放线菌0.1-0.3真菌0.1-0.3生物量倍增时间(biomassdoublingtime)

td=ln2/

增值度(multiplicationdegree)x/xo第二章

微生物的代谢微生物初级代谢微生物次级代谢代谢调节

微生物的代谢微生物细胞所进行的生化反应的总和物质代谢细胞内及细胞与环境间的物质转换的过程能量代谢载体信息代谢微生物初级代谢重要的初级代谢途径糖酵解途径糖代谢的共同分解途径三羧酸循环将糖最终氧化为二氧化碳和水，并产生大量能量磷酸戊糖途径产生四碳糖、五碳糖和七碳糖等多种中间产物ED途径细菌代谢葡萄糖产生乙醇的途径氨基酸合成途径糖酵解途径(Embden-Meyerhofpathway)→三羧酸循环(Krebscycle)磷酸戊糖途径ED途径

存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中，是微生物特有的,将2-酮-3脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。

氨基酸合成途径GLC→3PG→Ser,Gly,Met（3－磷酸甘油酸衍生型）

PPP↓↓R5PPEP→Phe,Try,Trp（芳香族氨基酸）

↓↓

HisPRY→Ala,

Val,Leu（丙酮酸衍生型）

↓OAA→Asp→ASA→Lys（草酰乙酸衍生型）

↓↓TCAAsnHS→Thr↓↓AKGMetIle↓Arg←Glu

→Gln（α－酮戊二酸衍生型）

↓Pro微生物次级代谢

次级代谢是相对于初级代谢的概念，指微生物在一定的生长时期（一般为稳定期）以初级代谢物为前体、合成对微生物生命活动没有明确功能的物质的过程。次级代谢（前体聚合、

初级代谢结构修饰、装配）营养物前体次级代谢物（初级代谢物）次级代谢的生物学意义

次级代谢的生理意义目前尚无定论，但它肯定对微生物是有意义的，否则这种需要多种酶类协同参与、并在精细的调节机制控制之下的代谢过程是不会在生物体内保存下来的。维持初级代谢的平衡次级代谢产物作为储藏物质的一种形式使菌体在生存竞争中占优势与细胞分化有关青霉素

SCH3R-CO-NH-HC—CHC∣B∣A∣CH3OCNCH

∣COOH侧链：R-CO-母核：噻唑环A，β-内酰胺环B青霉素的生物合成代谢调节细胞为维持正常的生理功能，它的组分、代谢物、能量和电子载体的合成大体上应保持恒定。当环境或细胞自身发生某种变化时，可以通过一定的反馈作用来达到平衡生长，这种反馈作用即代谢调节。代谢调节的位点DNA↓③RNA↓酶底物①底物

产物（营养物）（或中间物）②①底物进入，②酶的活性，③酶的合成代谢调节的本质：酶的调节酶合成的调节：诱导与阻遏—基因水平酶活性的调节：反馈抑制—蛋白质水平适应现象例1，大肠杆菌乳糖代谢：β–半乳糖苷酶乳糖→半乳糖+葡萄糖E.coli生长于无乳糖培养基，β–半乳糖苷酶：3分子/细胞E.coli生长于含乳糖培养基，β–半乳糖苷酶：3000-5000分子/细胞例2，大肠杆菌色氨酸代谢：E.coli生长于无色氨酸培养基，合成色氨酸合成酶，当色氨酸浓度增加时，色氨酸合成酶浓度下降。

细胞需要某种酶时才合成，反映出细胞的自我调节机理。这种诱导物诱导可诱导酶的产生与辅抑物抑制可阻遏酶的产生的现象称适应现象。乳糖：诱导物(inducer)色氨酸：辅抑物(corepressor)底物与诱导物底物不等于诱导物对β–半乳糖苷酶乳糖IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）苯基半乳糖苷苯基硫代半乳糖苷作底物+-+-作诱导物++--乳糖操纵子协同诱导和顺序诱导协同诱导I→a、b、cabc顺序诱导A→B→C→DI→aB→bC→c操纵子(operon)IPOS1S2S3

调节基因启动基因操纵基因结构基因↓变构↑(+or-)外界信号→调节蛋白IorCoR

操纵子：一组功能相关的基因共同组成的转录单位，它们结构上紧密联系、功能上协同表达，接受同一调控序列的调控。诱导与阻遏反馈抑制反馈抑制：在合成代谢途径中，代谢终产物抑制途径中第一个酶的作用。E1E2E3E4ABCDE反馈抑制能对环境变化做出快速反应特点：

1，只有终产物或其结构类似物有反馈抑制2，受抑制的是途径中的第一个酶3，反馈抑制是可逆的别构酶(allostericenzyme)有多亚基和四级结构有结合底物的活性中心和结合调节物的别构中心活性中心和别构中心在酶分子的不同部位分支生物合成途径的调节P1A

B

CP2协同反馈抑制同功酶反馈抑制累积反馈抑制顺序反馈抑制（细调）协同反馈抑制P1A

B

CP2

合成代谢途径中的第一个酶有几个变构中心，分别可与不同终产物结合，每一种终产物对第一个酶都没有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时才有反馈抑制作用。同功酶反馈抑制P1A

B

CP2

合成代谢途径中的第一个酶有几种结构略有不同的同功酶，每一种终产物只对一种同功酶有反馈抑制作用，只有当几种终产物同时过量时，才使几种同功酶同时被作用而抑制合成反应。积累反馈抑制P1A

B

CP2

每一种终产物对第一个酶都有一定的反馈抑制作用，他们合在一起达到最大程度的反馈抑制。顺序反馈抑制P1A

B

CP2

合成代谢途径中的第一个酶的效应物不直接是终产物而是代谢分支点的中间物，每一种终产物抑制分支后的第一个酶，使分支点的中间物积累，然后抑制合成代谢途径的第一个酶。这一调节作用可根据不同终产物的量分别调节，是一种细调。在许多分支代谢的调节中，细调与粗调往往同时发生。第三章

微生物的遗传与菌种选育微生物的遗传物质基因突变基因重组遗传育种

微生物的遗传物质核酸(DNARNA)染色体染色体外遗传物质DNA是遗传物质的实验证明肺炎双球菌转化

△SⅢ→dead，SⅢ→alive，RⅡ→alive

SⅢ△dead→SⅢ→SⅢRⅡ噬菌体感染T2(DNA-32P,protein-35S)→E.coli→上清T2（35S）↓沉淀E.coli（

32P）双螺旋模型遗传育种基因突变遗传物质小范围的改变，只涉及一对或少数几对碱基，又称点突变。

基因突变的类型基因型置换：GA,CT转换(transition)；G,A

C,T颠换(transversion)移码(frameshift)：DNA分子中一对或几对核苷酸的增加或缺失表型

形态：造成形态发生改变的突变致死：造成个体死亡或生活力下降（半致死）的突变条件致死：在一定条件下有致死效应的突变生化：没有形态效应的突变，如营养缺陷、抗药性等翻译

同义、错义、无义(UAG,UGA,UAA)基因突变的特性稀有性突变率低（可通过理化处理提高突变率）随机性独立性Kmr10-5,Apr10-6,

KmrApr10-11可逆性回复突变率也很低稳定性突变率：一个世代或一定时间内发生突变的概率。几种微生物每次复制的突变率

微生物基因组大小（bp）突变率（碱基）突变率（基因组）噬菌体M136.4×1037.2×10－70.0046噬菌体λ4.9×1047.7×10－80.0038噬菌体T2、T41.7×1052.4×10－80.0040大肠杆菌4.6×1065.4×10－100.0025酿酒酵母1.2×1072.2×10－100.0027粗糙脉胞菌4.2×1077.2×10－110.0030平均

0.0034诱变剂能引起微生物遗传物质发生改变的化学物理因子化学：碱基类似物（5-溴尿嘧啶、羟胺、亚硝酸）烷化剂（亚硝基胍、硫酸二乙酯）物理：短波（紫外线）射线（X-射线、γ射线）诱变剂的作用诱变剂诱变作用对DNA的影响诱变能力5-溴尿嘧啶碱基错配转换(AT

GC)弱羟胺胞嘧啶脱酰胺转换(GC

AT)弱亚硝酸A、C、G脱酰胺转换(AT

GC)、缺失中亚硝基胍A、C烷基化转换(GC

AT)强硫酸二乙酯A、C烷基化转换(GC

AT)强溴化乙啶嵌入碱基对移码弱紫外线嘧啶二聚转换(GC

AT)、巅换、缺失、移码中γ射线DNA单链或双链断裂结构改变、缺失强基因突变的应用诱变育种虽然分子生物学技术已普遍用于育种，诱变育种仍是重要而基本的育种方法。诱变育种的基本步骤：

出发株→诱变剂处理→初筛→复筛→鉴定一般要进行多次，以积累有益突变。诱变谱系：

诱变剂处理1诱变剂处理2出发株中间株1中间株2→…→目的株

诱变育种的关键环节出发株：性状、潜力诱变处理：诱变剂选择、剂量筛选：方法、筛选量High-throughputscreening致死率与诱变效果突变株的筛选初筛：弃去大量无价值菌株复筛：选出少数有价值菌株方法：直接测定利用可观察现象营养限制培养基选择培养基组成型育种β–半乳糖苷酶加诱导酶抑制剂培养基：乳糖+邻硝基-β-D-岩藻糖苷（诱导型酶抑制剂）只有组成型能利用乳糖交替培养法培养基1：乳糖培养基2：葡萄糖交替培养使组成型优势扩大交替培养法组成型诱导型组成型：诱导型1061061:1乳糖106-108106–2x10650:1葡萄糖107-

1092x105-2x10750:1乳糖108-

10102x106-4x1062500:1葡萄糖109-10114x105-4x1072500:1乳糖1010-10124x106-8x106125000:1葡萄糖1011-10138x105-8x107125000:1营养缺陷型育种

营养缺陷型C-ABCB积累ABCD积累

D

抗反馈抑制育种原理：

产物+酶（结合于调节中心）反馈抑制类似物+酶（结合于调节中心）影响生长抗类似物的变异株类似物与酶的调节中心不能结合产物与酶的调节中心不能结合反馈抑制解除产物能过量积累抗反馈抑制育种举例苏氨酸C.crenatumAS1.5420mg/mlMNNGLR-1458AHVr6mg/ml<1MNNGLRA-96AHVr8mg/ml,Met-3.5MNNGLRA-359AHVr10mg/ml,Met-6.5

LRA-359-667.0DESD20-23AHVr20mg/ml,Met-9.0

m8513.0

AsaHseThrIle

MetAHV(-氨基--羟基戊酸):Thr,Ile结构类似物抗底物类似物育种*海因酶（二氢嘧啶酶）5-氟尿嘧啶：底物(尿嘧啶)类似物，诱变剂抗底物类似物大量产生分解底物(类似物)的酶培养剂：平板培养剂+5-氟尿嘧啶

UVNTGNTG+5-FUJ43J404BO419M390.2750.7141.344.32IU/ml产物压力法*L－乳酸ADH丙烯醇—

烯醛（对细胞有毒性）NTG丙烯醇AS3.3461HBF－12（从21株中选出）乳酸6896乙醇164ADH5012基因重组

基因重组是遗传物质大范围的改变，涉及一个或多个基因、部分染色体甚至整个基因组。有性生殖：与高等生物相同，限于产有性孢子微生物细胞融合：通过原生质体结合：通过细胞间接触转导：通过噬菌体为媒介转化：游离DNA直接进入宿主细胞感染：病毒DNA进入细胞细胞融合育种菌种的保藏菌种保藏方法液体隔绝法冷冻干燥法低温保藏法菌种保藏中心

ATCC(

AmericanTypeCultureCollection)IFO(InstituteforFermentation,Osaka)CGMCC(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCentre)ACCC(ChinaAgriculturalCultureCollectionCentre)CACC(ChinaAntibioticCultureCollectionCentre)CICC(ChinaIndustrialCultureCollectionCentre)第四章

微生物基因工程基本概念工具酶载体目的基因的获得DNA体外重组基因的转移工程菌的筛选基因工程基本概念名词：geneticengineering,DNArecombination,recombinantDNAtechniques,genemanipulation,genecloning,molecularcloning…基本材料：供体，载体，受体一般过程：基因体外重组→转入受体→分离鉴定载体

工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶ITaqDNA聚合酶逆转录酶S1核酸酶碱性磷酸酯酶限制与修饰E.coliCλ.CEOP=1

EOP=1

EOP=1

EOP=10-4λ.KE.coliK限制性内切酶

一类专一性很强的核酸内切酶，包括对碱基的专一性和磷酸二酯键断裂方式的专一性。类型发现时间作用位点识别位点与作用位点的关系所需辅助因子Ⅰ1968不完全限定不同Mg2+,ATP…Ⅱ1970限定相同Mg2+Ⅲ1972限定不同Mg2+限制性内切酶的命名与作用特点命名：根据分离到该酶的菌株例：HindⅢHemophilusinfluenza

dⅢ作用特点：1，识别4~6个核苷酸序列2，中心对称3，可产生粘性末端或平末端几种限制性内切酶C↓CCGGG37LXmaIT↓CGA65LTaqICCC↓GGG37*SmaI↓GATC37MSau3ACTGCA↓G30MPstI↓GATC37HMboIA↓AGCTT37MHindIII**G↓AATTC37HEcoRIA↓GATCT37MBglIIT↓GATCA60MBclI**G↓GATCC37MBamHI2ndactivitysequenceTemp(℃)saltenzyme限制酶的反应条件BufferNaClTrisMgSO4DTTL010mM(pH7.4)10mM1mM

M50mM10mM(pH7.4)10mM1mMH100mM50mM(pH7.4)10mM0

*20mMKCl10mM(pH8)10mM1mM第二活性

EcoRI当甘油＞10%(12~20)，Mn2+代替Mg2+,pH8.5时，识别AATTDNA连接酶3’5’OHPT4:ATP,Mg+2ATPPpiE.coli:NAD,Mg+2EE-AMPEAP

ÖHPAMP

DNA聚合酶IMW109,0005’-3’聚合酶活性5’-3’外切酶活性3’-5’外切酶活性DNA聚合酶I

经枯草杆菌蛋白酶切得Klenow片段MW76,0005’-3’聚合酶活性3’-5’外切酶活性TaqDNA聚合酶

耐高温的DNA聚合酶，从水生栖热菌(Thermusaquaticus)分离得到。由于聚合酶链式反应(polymerasechainreactionPCR)应用的不断扩大，TaqDNA聚合酶已成为分子生物学研究最重要的工具酶之一。聚合酶链式反应(PCR)

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

变性（~94°C）¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

退火（~37°C）5¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯33‘¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯5’

延伸（~72°C）

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯

用DNA聚合酶Klenow片段延长退火引物，由于在变性温度下酶失活，每经过一轮就需补充酶。1987年耐热DNA聚合酶的发现PCR使得以实用。PCR反应系统DNA模板引物（20~30bp，内部无二级结构）底物（4dNTPs）热稳定的DNA聚合酶逆转录酶发现于感染RNA病毒的动物组织，以RNA为模板合成DNA，又称依赖RNA的DNA聚合酶，常被用来合成cDNA，是获得真核基因的重要工具酶。S1核酸酶作用于单链DNA的核酸酶，来自米曲霉(Aspergillusoryzae)，降解单链DNA，不降解双链DNA和DNA-RNA杂合分子，用于制造DNA平末端和去掉cDNA合成时的发夹环。碱性磷酸酯酶除去DNA5’末端的磷酸，以提高重组效率细菌碱性磷酸酯酶BAP（耐热）小牛肠道碱性磷酸酯酶CIP（68ºC可完全失活）载体能运载外源基因，进入受体细胞并在其中复制、转录、翻译的特殊物质。基因重组基因转移基因表达稳定性、分泌、分离纯化…

能自我复制能进行基因操作可接纳与运载外源基因有选择方法有期望的性状克隆载体与表达载体克隆载体：拷贝数高，利于得到基因表达载体：表达量高，利于得到蛋白这两类载体没有绝对的区别。质粒(plasmid)一种染色体外遗传因子，为闭合的环状双链DNA分子，大小从10-1~102kb不等，可以自我复制并且在细胞分裂时保持恒定地传递给子代细胞。质粒DNA带有与质粒复制有关的基因、抗药性基因以及其他一些基因，这些基因表现为与宿主有关的性质，如转移、稳定性、分泌性质、特殊的代谢途径、限制、修饰等。拷贝数：一个细胞内质粒DNA分子的个数，与质粒复制区的结构有关。质粒的类型复制类型：严紧型：质粒DNA复制较严格受染色体DNA复制控制，复制时需有新的蛋白质合成，一般拷贝数较少。松弛型：质粒DNA复制不受染色体DNA复制控制，复制时不需要新的蛋白质合成，一般拷贝数较多。接合类型（根据其引起细菌接合转移的能力）：接合(conjugative)质粒：有Tra基因，一般较大，拷贝数较少。非接合(non-conjugative)质粒：没有Tra基因。质粒的制备培养、收集带质粒的细胞裂解细胞（生物、化学、物理）除去核酸外的其它细胞成分（苯酚、氯仿）除去染色体DNA、RNA（生物、化学、物理）浓缩、纯化质粒载体能在受体系统复制有尽可能多的限制酶的单一切点有正选择标记分子量较小（拷贝数高、转化效率高、操作方便等）能高效表达外源基因在细胞分裂时保持稳定外泌性、不可转移性等穿梭(shutle)质粒噬菌体噬菌体是以细菌为宿主的病毒，由遗传物质核酸与蛋白质外壳组成，只有在宿主细胞里才能繁殖。按形状分类：

蝌蚪状噬菌体(T4)、球状噬菌体(ǾX174)、线状噬菌体(Ff)按遗传物质分类：

RNA噬菌体(MS2)、单链DNA噬菌体(M13)、双链DNA噬菌体(λ)按于宿主的关系分类：

烈性噬菌体、温和噬菌体温和噬菌体可能构建为载体温和噬菌体的生活史噬菌体载体能感染受体细胞，并能在细胞内复制在非必须区内有多种限制酶的单切或双切位点能容纳不同大小的外源DNA片断并包装成感染性颗粒，重组噬菌体有一定产量能形成噬菌斑，并能通过噬菌斑的形成与表型区分重组与非重组噬菌体生物学安全性噬菌体的制备培养寄主菌接种噬菌体固体培养：双层平板法液体培养：至培养液澄清噬菌体DNA的制备：苯酚反复抽提（关键是得到高浓度的噬菌体）目的基因的获得化学合成酶促合成cDNA合成PCR鸟枪法化学合成基因用化学法合成目的基因的条件：1，已知基因的核苷酸序列，或至少要知道该基因产物的氨基酸序列2，基因必须很小举例：生长激素释放抑制因子(somatostatin)10LE.coli

发酵液

5mgsomatostatin

cDNA合成基因

mRNA5’AAAn3’(模版)dT

5’AAAn3’(合成引物)TTTn5’

逆转录酶：合成RNA-DNA碱处理：得单链cDNADNA聚合酶：合成带发夹环的双链DNAS1核酸酶：去发夹环，得双链DNA

PCR合成基因已知基因序列已知基因保守区序列反向PCRRT-PCR鸟枪法用适当的限制酶将含有目的基因的供体基因组切成不同大小的DNA片段根据需要收集一定大小的DNA片段，这些片段应比目的基因大，其中包括了带有目的基因的片段将这些DNA片段连接到载体上，得到大量不同的重组DNA，其中包括了带有目的基因的重组DNA将所有重组DNA转化受体细胞，得到大量不同的重组子，其中包括了带有目的基因的重组子从大量重组子中筛选带有目的基因的重组子。由于鸟枪法克隆的基因不是专一的，因此筛选时要运用一些特殊的方法与技巧鸟枪法供体基因组的切割选择限制酶与反应条件时应考虑：片段大小目的基因的完整性片段的末端识别6核苷酸序列46=4096识别4核苷酸序列

44=512基因库建立一定概率的基因库所需的克隆数：N=ln(1-P)/ln(1-f)P：所需的概率f：克隆的片段与整个基因组的长度比例：细菌基因组4000kb，克隆片段4kb，90%概率需2301个克隆99%概率需4603个克隆克隆片段40kb，90%概率需229个克隆99%概率需458个克隆DNA体外重组DNA体外重组的方式平末端连接粘性末端连接

载体与外源DNA用同一限制酶酶切载体与外源DNA分别用产生相同粘性末端，但识别序列不同的两种限制酶酶切，在切载体的限制酶活性存在的条件下连接定向克隆部分补齐法HindIII→AGCT,BamHI→CTAG人工接头法连接效率连接效率：载体与外源DNA连接得到重组DNA在总连接产物中的比例影响连接效率的因素DNA浓度DNA片段长度DNA片段的卷曲度DNA末端的状态载体与外源DNA的比例判断连接效率的两个参数分子内粘性末端的有效浓度j=(3/2

lb)3/2l:DNA片段长度,b:DNA片段卷曲度全部粘性末端的浓度i=2N0M10-3/mlM:摩尔浓度j=i自连与互连相等，j

i互连为主，j

i自连为主基因的转移转化（transformation)：游离DNA直接进入细胞的过程，目前主要有感受态(competance）和原生质体(protoplast)转化转染(transfection)：游离的噬菌体DNA直接进入细胞的过程，转染率较低，一般采用感染感染(infection)：DNA包装进病毒颗粒后进入宿主细胞的过程转导(transduction)：通过噬菌体为媒介在细菌间转移遗传物质的过程结合(conjugation)：通过细胞间接触，遗传物质从供体细胞转入受体细胞的过程物理方法结合转移(con