CN114174348B 胰岛素类似物及其使用方法 （伊莱利利公司）

2022.01.27PCT/US2020/0444792020.07.31WO2021/022149EN2021.02.04WO2017041001A2,2017.03.09公开了胰岛素(INS)类似物，其包括与天然胰岛素受体(IR)的选择性和提供体外和体内稳种或多种本文所述的INS类似物。还公开了制备和使用INS类似物的方法，特别是用于治疗代谢2其中VHH是选自SEQIDNO:7和8的氨基3.权利要求1所述的化合物，其中B是SEQIDNO:4且进行选自以下的突变：N3D突变；9.药物组合物，其包含权利要求1-8中的任一项所述的化合物和药学上可接受的缓冲11.权利要求10所述的药物组合物，其中所述另外的治疗剂选自：二肽基肽酶4(DPP-12.有效量的权利要求1-8中的任一项所述的化合物或权利要求9所述的药物组合物在13.权利要求12所述的用途，其中所述化合物或药物组合物进一步与有效量的另外的34[0002]INS是一种由胰腺#(#)细胞分泌的肽激素，其生理作用是通过促进细胞葡萄糖摄[0003]在结构上，INS是通过两个链间二硫键连接的21个和30个氨基酸（分别为A链和B以充当IR激动剂。这样的SCI类似物包括以下的从氨基端(N-端)至羧基端(C-端)的基础结2是第二接头。5NO:23至33中的任一个具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基酸序列。34至36中的任一个具有至少约90%至约99%序列相似性的氨基基酸序列，其与包括以下内容的氨基酸序列具有至少约90%至约99%序列相似性：SEQID可替换地，INS类似物可以具有与SEQIDNO:37至81中的任一个的氨基酸序列具有至少约64)的结合亲和力相当。在其它情况下，INS类似物对IR具有的结合亲和力大于天然人INS本文中的VHH部分或INS类似物的载体和包含其的宿障碍中的护理标准的药剂。在某些情况下，至少一种另外的治疗剂可以是二肽基肽酶4似物、天然胰岛素样生长因子(IGF)或其类似物、二甲双胍、钠-葡萄糖协同转运蛋白-2 [0030]所述方法还可以包括将INS类似物与有效量的至少一种另外的治疗剂组合施用的7将这样的测量/获得的值与一个或多个基线值或先前测量/获得的值进行对比以评估治疗/[0034]所述方法还可以与饮食和锻炼相组合，和/或可以与除以上讨论的那些之外的另89用持续时间，并且可以具有约20天至约30天的t½,从而与天然人INS、尤其是天然人INS物诸如本文中的INS类似物的结合受体并诱导受体处的应答的能力，如使用本领域已知的组二十种氨基酸，其被指定为标准氨基酸并且其可以用作任何生物产生的肽/蛋白的结构括与参考氨基酸序列具有至少约的A链的序列在SEQIDNO:3中列出。同样地，天然人INS的B链的序列在SE合亲和力、受体内化、再循环时间和细胞内信号传递方面存在已知差异。参见，例如，603-613；Frasca(1999)Mol.Cell.Biol.19:3278-3288；Seino等人(1989)Proc.INS中的氨基酸位置的所有提及均基于天然人INS的SEQIDNO:3的A链或SEQIDNO:4的B中包括序列间隙和残基相似性。用于确定序列相似性的方法和算法是本领域众所周知的，和/或链内二硫键中的至少一种以维持正确体(HcAb)的单个单体可变区的抗体片段，其具有非常小的约15kDa的大小。本文已发现，VHH部分可以用作药代动力学增强剂以延长本文中的INS类似物的作用持续时间和/或改善中的VHH部分用于改善INS的t½,但它们同样可以用于改善其它生物活性肽/蛋白例如GDF-IMBT、Kabat或North来完成。NorthCDR定义是基于具有大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagationclustering)(North等人(2011)J.Mol.Bio.406:228-256)。[0208]在某些情况下，VHH部分至少可以包括互补性决定区(CDR)1(CDR1)、CDR2和具有与其作为治疗性治疗的可开发性相关的有益属性，包括改善的在水溶液中的溶解度、和力进行调整以及最小化的免疫原性的可能性。[0212]简而言之，本文中的INS类似物包括从氨基端至羧基端具有以下结构之一的氨基酸序列：和N21G)。可替换地，A链可以是其截短体。例如，A链可以是缺少SEQIDNO:3的残基1-3其截短体。例如，B链可以是缺少SEQIDNO:4的残基1-3(desB1-3)或缺少残基27-30[0220]考虑到以上，A链可以是天然人INSA链(SEQIDNO:3)且B链可以是天然人INSB或SEQIDNO:3的截短体且B链可以是SEQID等人(2017)Appl.Microbiol.Biotechnol.101:3259-3271；Mao等人(2019)Appl.10SEQIDNO:23)。在其它情况下，L1可以包括(PGPQ)nSEQIDNO:7GGSEQID10GGGG(EP)10GGGG10GGGG7PGPQ7PGPQ[0223]可以作为L1用在INS类似物中的其它接头包括但不限于(GGGQ)n(SEQIDNO:11)3其可以结合血清白蛋白或具有长t½的另一种血清蛋白。在某些情况下，VHH可以是SEQIDL1[0234]INS类似物4，其从N-端至C-端包括具有Y16E突变的INS的B链、6个残基的L2(粗[0236]INS类似物5，其从N-端至C-端包括具有Y16H突变的INS的B链、6个残基的L2(粗[0238]INS类似物6，其从N-端至C-端包括具有F25H突变的INS的B链、6个残基的L2(粗基酸序列：基酸序列：基酸序列：基酸序列：基酸序列：[0264]INS类似物19，其从N-端至C-端包括具有N3S突变的INS的B链、6个残基的L2(粗[0266]INS类似物20，其从N-端至C-端包括具有N3S突变的INS的B链、6个残基的L2(粗具有Y14E和N21G突变的INS的A链、(PGPQ)8L1(斜体)和VHH部分(有下划酸序列：基酸序列：[0280]INS类似物27，其从N-端至C-端包括具有N3S和Y16R突变的B链、基酸序列：具有T8H和N21G突变的INS的A链、(G4Q)5L1(斜体)和VHH部分(有下划线)，具有T8H和N21G突变的INS的A链、G4(AP)10G4L1(斜体)和VHH部分(有下划具有T8H和N21G突变的INS的A链、G4(EP)10G4L1(斜体)和VHH部分(有下划具有T8H和N21G突变的INS的A链、G4(KP)10G4L1(斜体)和VHH部分(有下划具有T8H和N21G突变的INS的A链、(G4Q)5L1(斜体)和VHH部分(有下划线)，具有T8H和N21G突变的INS的A链、(G4Q)5L1(斜体)和VHH部分(有下划具有T8H和N21G突变的INS的A链、(G4Q)5L1(斜体)和VHH部分(有下划具有T8H和N21G突变的INS的A链、(G4Q)5L1(斜体)和VHH部分(有下划线)，具有T8H和N21G突变的INS的A链、(G4Q)5L1(斜体)和VHH部分(有下划线)，具有T8H和N21G突变的INS的A链、(G4Q)5L1(斜体)和VHH部分(有下划人IR-A或人IR-B；分别为SEQIDNO:5和6)的效能对IR(诸如天然的人IR-A或人IR-B；分别为SEQIDNO:5和6)的效能是在例如天然人INS[0324]为了改善它们的体内相容性和有效性，本文中的INS类似物可以与多种无机和有们的常用技术是本领域众所周知的(参见，例如，Stahl等人,“HandbookofPharmaceuticalSalts：Properties,SelectionandUse”([0326]本公开内容还提供并因此涵盖可用于合成本文中的INS类似物或其药学上可接受的盐的新型中间体和方法。通过本领域众所周知的多种技术，可以制备中间体和INS类似以不同方式组合以制备本文中的INS类似物。试剂和起始原料对于本领域技术人员来说是[0328]在这里，药物组合物中的INS类似物的有效量可以是约0.25mg至约5.0mg的剂[0330]以此方式，药物组合物可以包含有效量的至少一种SEQIDNO:37-81的INS类似类似物和药学上可接受的载体、有效量的SEQIDNO:45的INS类似物和药学上可接受的载受的载体、有效量的SEQIDNO:55的INS类似物和药学上可接NO:56的INS类似物和药学上可接受的载体、有效量的SEQIDNO:57的INS类似物和药学上上可接受的载体、有效量的SEQIDNO:61的INS类似物和药学上可接受的载体、有效量的似物和药学上可接受的载体、和有效量的SEQIDNO:70的INS类似物和药学上可接受的载剂盒包括用于给个体施用至少一种INS类似物或包含其(和任选的至少一种另外的治疗剂)选的至少一种另外的治疗剂)的组合物在注射器内预先配制在水溶[0333]通过本领域已知的任何数量的标准重组DNA方法或标准化学肽合成方法，可以制如，Green和Sambrook,“MolecularCloning：ALaboratoryManual”(ColdSpringHarborLaboratoryP化合物的DNA序列引入宿主细胞以产生化合物或其前体。宿主细胞可以是细菌细胞诸如大肠杆菌的K12或B株，真菌细胞诸如酵母细胞，或哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细的化合物或其前体。表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分在宿主的肽合成仪可从例如AppliedBiosystems(FosterCity,CA)和ProteinTechnologies26；Belgi等人(2011)Immun.Endoc.&Metab.AgentsinMed.Chem.11:40-47；Hossain和Wade(2017)Acc.Chem.Res.50:2116-2127；和Liu等人(2016)J.Pept.[0339]本文中的INS类似物的另一种用途是用于治疗心脏和/或肾脏病症、疾病和/或障[0342]所述方法也可以包括给个体施用有效量的至少一种本文中的INS类似物，其可以[0346]关于其中将INS类似物或包含其的药物组合物与有效量的至少一种另外的治疗剂[0355]在这里，使用CHOK1细胞衍生物在哺乳动物细胞表达系统中产生SEQIDNO:3INS类似物。将编码SEQIDNO:37的cDNA序列亚克隆到含有GS的表达质粒主链(基于pEE12.4的质粒)中。cDNA序列与信号肽序列METDTLLLWVLLLWVPGSTG[0356]为了通过瞬时转染生成INS类似物，使用基于PEI的方法用重组表达质粒转染µM含有MSX的无血清培养基中生长并在35℃-37℃和5%-7%CO2下温育来完成转染的细胞的[0358]将从CHO细胞分泌到培养基中的INS类似物通过蛋白A亲和色谱法和随后的离子交和pH，用于后续的尺寸排阻色谱法。可以通过离子交换色谱法使用树脂诸如POROS50HSNaCl梯度经15个柱体积从柱洗脱INS类[0359]可以使用CaptoPhenylImpResHIC柱(GEHealthcare)通过疏水相互作用色谱可以通过SEC进一步纯化INS类似物，其中将浓缩的CaptoPhenylImpRes合并物(pool)加[0366]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例2，除了将编码SEQIDNO:38的[0371]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例3，除了将编码SEQIDNO:39的[0376]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例4，除了将编码SEQIDNO:40的[0381]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例5，除了将编码SEQIDNO:41的[0386]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例6，除了将编码SEQIDNO:42的[0391]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例7，除了将编码SEQIDNO:43的[0396]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例8，除了将编码SEQIDNO:44的[0401]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例9，除了将编码SEQIDNO:45的[0406]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例10，除了将编码SEQI[0411]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例11，除了将编码SEQI[0416]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例12，除了将编码SEQI[0421]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例13，除了将编码SEQI[0426]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例14，除了将编码SEQI[0431]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例15，除了将编码SEQI[0436]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例16，除了将编码SEQI[0441]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例17，除了将编码SEQI[0446]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例18，除了将编码SEQI[0451]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例19，除了将编码SEQI[0456]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例20，除了将编码SEQI[0461]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例21，除了将编码SEQI[0466]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例22，除了将编码SEQI[0471]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例23，除了将编码SEQI[0476]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例24，除了将编码SEQI[0481]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例25，除了将编码SEQI[0486]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例26，除了将编码SEQI[0491]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例27，除了将编码SEQI[0496]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例28，除了将编码SEQI[0501]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例29，除了将编码SEQI[0506]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例30，除了将编码SEQI[0511]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例31，除了将编码SEQI[0516]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例32，除了将编码SEQI[0521]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例33，除了将编码SEQI[0526]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例34，除了将编码SEQI[0531]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例35，除了将编码SEQI[0536]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例36，除了将编码SEQI[0541]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例37，除了将编码SEQI[0546]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例38，除了将编码SEQI[0551]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例39，除了将编码SEQI[0556]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例40，除了将编码SEQI[0561]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例41，除了将编码SEQI[0566]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例42，除了将编码SEQI[0571]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例43，除了将编码SEQI[0576]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例44，除了将编码SEQI[0581]在这里，基本上如关于实施例1所述产生实施例45，除了将编码SEQI[0585]在Biacore8K仪器上进行实施例23至30的INS类似物与各种血清白蛋白的结合。根据生产商的说明书(AmineCouplingKitBR-1000-50)将血清白蛋白固定到S系列传感49)中稀释，然后以10µL/min注射到活化的芯片表面(流动池2,通道1-7)上90秒(人、小自HölzelDiagnostika(Cologne，德国)；狗血清白蛋白得自MolecularInnovations(Novi,MI)；和兔血清白蛋白得自FitzgeraldIndustriesInternational(Acton,0.051和0.017nM的浓度在HBS-EP+缓冲液(10mMHEPESpH7.6,150mMNaCl,3mM面，然后在25℃以50μL/min流速解离600秒。通过以50μL/min注射10mM甘氨酸-HClpH1.5(BR-1003-54)100秒使表面再生。使用Biacore8KInsight评价软件（版本学学浮缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.5)中融化，所述缓冲液在每50mL缓冲液中含有1片[0613]受体结合测定方案：通过竞争性放射性配体结合测定用均得自PerkinElmer(Waltham,MA)的人重组(3-[125I]-碘酪氨酰-A14)-胰岛素(2200Ci/mmol)或人重组基甲苯(PVT)麦胚凝集素偶联的SPA珠子(PerkinElmer)用SPA方法进行测定。测定缓冲液0.001%NonidetP-40Substitute(NP-40,RocheDia人(Tecan)在测定缓冲液中制备使用试验样品或对照的三倍系列稀释液的十点浓度响应曲线。使用TeMO机器人(Tecan)将50μL化合物稀释液添加到96孔白色透明底微孔板[0616]在室温温育10小时和珠子沉降后，使用Microbeta-Trilux闪烁计数器(Perkin测定缓冲液以8孔/板确定最大结合应答(MAX)，并使用100nMBHI在每个孔中确定最小结[0627]STZ小鼠：允许来自EnvigoRSMInc.(Indianapolis,IN)的11-12周龄雄性[0628]如下制备STZ：将媒介物添加到预先称重的S最近的体重以6mL/kg(100mg/kg)[0637]允许来自EnvigoRMSInc.(Indianapolis,IN)的390-425g雄性Sprague12小时光照和12小时黑暗的光周期（可能因研究相关活动而中断20℃至26℃的温度，和[0638]如下制备STZ：将19m[0639]在STZ处理后三天，使用旨在实现血糖仪值(450mg/dL至550mg/dL纳入标准)和小时通过尾部取血测量葡[0648]在STZ诱导的糖尿病大鼠模型中测试了本文中的INS类似物的药代动力学。给STZ[0649]使用与DionexUltimate3000UPLC系统偶联的Thermoorbitrap质谱仪(Q/Exactive或FusionLumos)通过免疫亲和-LC/MS测量动物的血浆类似物浓度。使用固定化至链霉亲和素包被的磁珠(DynalM-280,ThermoE2017-02)的抗-骆驼科-VHH-生物素单克隆抗体(EliLillyandCompany,克隆96A3F5)从K3EDTA大鼠血浆中免疫沉淀类似物。12）。通过LC/MS在0.293nM至150nM的范围内测量来自变体的不同区域的后续胰蛋[0650]实施例29和30的药代动力学在测试的剂量范围(50-400nmol/kg皮下)内大约呈[0665]SEQIDNO:5–具有C-端C9标NP_001073285.1)[0668]SEQIDNO:6–具有C-端C9标签NP_000199.2)[0714]ccc[0726]cccccc[0747]SEQIDNO:45-INS类似物#9(SCI(B3S,B25H,A8H,A21G)-(PGPA)8-MC6.1C22.43)8-C22.43)MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)[0755]SEQIDNO:49-INS类似物#13(SCI(B3S,B16H,B25H,A8H,A14E,A21G)-[0763]SEQIDNO:53-INS类似物#17(SCI(B3S,B16R,A8H,A21G)-(PGPA)8-MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)[0777]SEQIDNO:60-INS类似物#24(SCI(B3S,B16H,B25H,A8H,A14E,A21G)-[0783]SEQIDNO:63-INS类似物#27(SCI(B3S,B16R,A8H,A21G)-(G4Q)5-MC6.1C22.43)[0785]SEQIDNO:64-INS类似物#28(SCI(B3S,B16R,A8H,A21G)-(PGPQ)8-MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)[0797]SEQIDNO:70-INS类似物#34(SCI(B3S,B16R,B25H,A8H,A21G)-G4(AP)10G4-MC6.1C22.43)[0799]SEQIDNO:71-INS类似物#35(SCI(B3S,B16R,B25H,A8H,A21G)-G4(EP)10MC6.1C22.43)[0801]SEQIDNO:72-INS类似物#36(SCI(B3S,B16R,B25H,A8H,A21G)-G4(KP)10G4-MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)MC6.1C22.43)[0807]SEQIDNO:75-INS类似物#39(SCI(B3K,B16R,B25H,A8H,A21G)-G4Q)5-MC6.1C22.43)[0809]SEQIDNO:76-INS类似物#40(SCI(B3K,B16R,B21Q,B25H,A8H,A21G)-G4Q)5-MC6.1C22.43)[0812](SCI(B3K,B16R,B21Q,<170>PatentInversion3151515