CN115927149B 一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和应用 （浙江大学杭州国际科创中心）

一种恶臭假单胞菌工程菌及其制备方法和本发明公开了一种恶臭假单胞菌工程菌及括恶臭假单胞菌和导入恶臭假单胞菌的重组质SEQIDNO.6所示的对苯二甲酸分解代谢模块；或SEQIDNO.4所示的对苯二甲酸分解代谢模块导入对苯二甲酸代谢模块和对苯二甲酸转运模2足自我复制的重组质粒；所述恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关键基恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)KT2440ATC5.一种如权利要求1～4任一项所述的恶臭假单胞菌工程菌的制备方法，其特征在于，(1)利用基因敲除技术将恶臭假单胞菌基因组影响乙二醇代谢的关键基因敲除，敲除(B)将步骤(A)得到的种子液体培养物按照2v/v％的接种量接种在进化培养基中进行2HPO42PO42O4)2SO422O322O。7.如权利要求1～4任一项所述的恶臭假单胞菌工程菌或权利要求5～6任一项所述的制备方法制得的恶臭假单胞菌工程菌在共利用乙二醇4瓶颈之一是利用同一株菌同时将TPA与EG高[0004]恶臭假单胞菌ATCCNO.47054(即PseudomonasputidaKT2440)是近年来引起学[0008]一种恶臭假单胞菌工程菌，包括恶臭假单胞菌和导入恶臭假所述恶臭假单胞菌的基因组中敲除了影响乙二醇代谢的关[0013]其中，SEQIDNO.2所示的对苯二甲酸分解代谢模块来源于阴城假单胞菌分解代谢模块是由来源于丛毛单胞菌(Comamonassp.)E6的对苯二甲酸分解代谢模块(SEQIDNO.4)中的转运蛋白模块(SEQIDNO.5(protein_id＝"BAE47084.1"))替换成来源于阴5为已公开菌株，且对苯二甲酸分解代谢模块和对苯二甲酸转运模块均可通过生物合成获[0015]所述恶臭假单胞菌的株型为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)KT2440[0018]作为优选，所述乙二醇代谢的关键基因为gclR，碱基序列如SEQIDNO.1所示。gclR(PP_4283)是一个内源的Gcl途径的转录抑制因子(NCBIReferenceSequence:NC_[0020](1)利用基因敲除技术将恶臭假单胞菌基因组影响乙二醇代谢的关键基因敲除，[0025](A)挑取LB固体培养基中的恶臭假单胞菌单菌落，接种至液体LB培养基中进行培[0026](B)将步骤(1)得到的种子液体培养物按照2v/v％的接种量接种在进化培养基中[0027](C)将步骤(2)所得的第一代细胞培养物转接至新鲜进化2HPO42PO42O2OZnSO442OMoO4426[0033]本发明还提供了所述的恶臭假单胞菌工程菌在高效共利用乙二醇和对苯二甲酸[0035]本发明以恶臭假单胞菌为出发菌株，通过敲除影响乙二[0036]图1为实施例1构建的恶臭假单胞菌工程菌(Pseudomonasputida)KT1以不同浓度[0037]图2为实施例2构建的恶臭假单胞菌工程菌(Pseudomonasputida)KT1_G以对苯二[0038]图3为实施例4和实施例5构建的恶臭假单胞菌工程菌(Pseudomonasputida)KT1_示KT1_EK与KT1_EK2以对苯二甲酸为唯一碳源的生长曲线；B表示对苯二甲酸消耗速率曲[0039]图4为实施例6构建的恶臭假单胞菌工程菌(Pseudomonasputida)KT1_G与KT1_EK2共利用乙二醇与对苯二甲酸的生长曲线与两底物消耗速率曲线；其中，A表示KT1_G与所示序列为阴城假单胞菌GO16来源的对苯二甲酸分解代谢模块的核苷酸序列(ArtificialIDNO.4所示序列为丛毛单胞菌E6来源的对苯二甲酸分解代谢模块的核苷酸序列所示序列为丛毛单胞菌E6来源的对苯二甲酸转运模块的核苷酸序列(Artificial[0043]实施例1恶臭假单胞菌工程菌(Pseudomonasputida)KT1的构建及乙二醇为唯一[0044](1)恶臭假单胞菌PseudomonasputidaKT2440(ATCC47054)保存于体积分数为7养后挑取单菌落接种在装有灭菌的5mLLB液体培养基的摇管中，在30℃条件下，以220r/[0045](2)采用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除KT2440中gclR基因(碱基序列如SEQID2O42O22O2MoO442O22O。[0053](1)工程菌的构建：通过金斯瑞合成来源于阴城假单胞菌(Pseudomonas块包括对苯二甲酸代谢模块和SEQIDNO.3所示的对苯二甲[0054]将目的基因片段与PCR线性化的质粒(pSEVA644)载体骨架，进行无缝连接后获得[0055]将重组质粒pSEVA64_tphG电转化至恶臭假单胞菌KT1感受态细胞。用LB培养基培[0056]将10μL浓度为100ng/μL的pSEVA64_tphG质粒与100μL感受态细胞混合后加入到电8[0058](3)将步骤(2)的细胞液体培养物以2v/v％接入装有灭菌的50mL无机盐培养基的2O2O42O22O42MoO442[0062]实施例3恶臭假单胞菌工程菌(Pseudomonasputida)KT1_E的构建及对苯二甲酸块和SEQIDNO.5所示的对苯二甲[0064]将目的基因片段与PCR线性化的质粒(pSEVA644)载体骨架，进行无缝连接后获得[0065]将重组质粒pSEVA64_tphE电转化至恶臭假单胞菌KT1感受态细胞。用LB培养基培[0068](3)将步骤(2)的细胞液体培养物以2v/v％接入装有灭菌的50mL无机盐培养基的[0069](4)每隔6_12小时测定一次细胞浊度，直至72小时。该实施例中，Pseudomonas菌PseudomonasputidaKT1_E无法以对苯二甲酸为2O2O42O22O42MoO442[0071]实施例4恶臭假单胞菌工程菌PseudomonasputidaKT1_EK的构建及对苯二甲酸9块中的转运蛋白模块(SEQIDNO.3)的重组质粒pSEVA25_[0073]采用PCR扩增阴城假单胞菌GO16对苯二甲酸分解代谢模块中的转运蛋白模块(SEQLB液体培养基中，30℃培养16h，收集细胞保存备用。所得工程菌株命名为恶臭假单胞菌[0076](3)将步骤(2)的细胞液体培养物以2v/v％接入装有灭菌的50mL无机盐培养基的的浓度，并吸取1mL菌液离心取上清测定对苯二甲酸的浓度，直至72小时。该实施例中，2O2O42O22O42MoO442[0079]实施例5恶臭假单胞菌工程菌(Pseudomonasputida)KT1_EK2的构建及对苯二甲LB液体培养基中，30℃培养16h，收集细胞保存备用。所得工程菌株命名为恶臭假单胞菌[0083](3)将步骤(2)的细胞液体培养物以2v/v％接入装有灭菌的50mL无机盐培养基的[0086]实施例6恶臭假单胞菌工程菌(Pseudomonasputida)KT1_G与KT1_EK2利用乙二醇苯二甲