GB-T 47205-2026 血矛线虫病诊断技术

GB/T47205-2026血矛线虫病诊断技术前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。本文件起草单位：南京农业大学、江苏农林职业技术学院。本文件主要起草人：严若峰、李祥瑞、徐立新、宋小凯、陆明敏、卜永谦。引言血矛线虫病是牛羊等反刍动物最为常见的消化道寄生虫病之一，2022年被列为我国三类动物疫病。该病的病原为圆线目（Strongylata）毛圆科（Trachostrongylidae）血矛属（Haemonchus）的捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）、柏氏血矛线虫（H.placei）、似血矛线虫（H.similis）和长柄血矛线虫（H.longistipes），我国以捻转血矛线虫最为常见。随着我国大力发展牛羊等产业，血矛线虫病的危害日益严重，准确诊断对该病的防控具有重要意义。本文件的制定旨在规范血矛线虫病的诊断技术，统一诊断标准，为该病的监测、防控和检疫提供科学依据，保障畜牧业健康发展。1范围本文件规定了血矛线虫病的临床、病原学、免疫学和分子生物学等诊断技术。本文件适用于反刍动物血矛线虫病的诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1血矛线虫（Haemonchus）指隶属于线形动物门圆线目毛圆科血矛属（Haemonchus）的线虫。我国以捻转血矛线虫最为常见。3.2血矛线虫病（Haemonchosis）由血矛线虫感染而引起反刍动物贫血、水肿、腹泻等症状的一种线虫病。我国以捻转血矛线虫病最为常见。4缩略语下列缩略词适用于本文件。bp：碱基对（basepair）BSA：牛血清白蛋白（bovineserumalbumins）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DMSO：二甲基亚砜（dimethylsulfoxide）EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）ELISA：酶联免疫吸附测定（enzymelinkedimmunosorbentassay）HcADRM：捻转血矛线虫黏附调节分子（Haemonchuscontortusadhesionregulatingmolecule）HRP：辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase）PBS：磷酸盐缓冲溶液（phosphatebufferedsaline）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）SPG：链球菌蛋白G（streptococcalproteinG）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（tris-acetate-EDTA）TBST：三乙醇胺缓冲盐水-吐温20溶液（trisbufferedsaline-Tween-20）TMB：3,3,5,5’-四甲基联苯胺（3,3,5,5'-tetramethylbenzidine）5试剂、耗材和仪器5.1试剂5.1.1除特别规定外，本文件中所使用的试剂均为分析纯，水符合GB/T6682的要求。试剂制备或配置方法按照附录A进行。5.1.2生理盐水。5.1.3PBS（磷酸盐缓冲溶液）。5.1.45%BSA（牛血清白蛋白）。5.1.5TBST（三乙醇胺缓冲盐水-吐温20溶液）。5.1.6TMB工作液。5.1.7HRP标记的SPG（链球菌蛋白G）。5.1.82M硫酸。5.1.9卢氏碘液。5.1.10饱和氯化钠溶液。5.1.11HcADRM重组蛋白。5.1.12粪便/组织基因组DNA提取试剂盒。5.1.132×TaqPCRMix。5.1.1450×TAE缓冲液、1×TAE缓冲液。5.1.15EB（溴化乙锭）。5.1.16阳性血清。5.1.17阴性血清。5.1.18捻转血矛线虫DNA。5.2耗材5.2.1酶标板。5.2.2载玻片。5.2.3盖玻片。5.2.4平皿。5.2.5一次性手套。5.2.6一次性真空采血针和采血管。5.2.7离心管。5.2.8PCR反应管。5.2.9搪瓷盆、塑料盆。5.2.10烧杯。5.2.11试管。5.2.12挑虫针。5.3仪器5.3.1酶标仪。5.3.2微量移液器。5.3.3离心机。5.3.4培养箱。5.3.5光学显微镜。5.3.6体视显微镜。5.3.7PCR仪。5.3.8紫外分光光度计。5.3.9电泳仪。6生物安全要求样品采集、处理和检测过程中所涉及的实验操作，应遵守GB19489和GB/T27401的相关规定，防止样品污染、人员感染及病原扩散。7临床诊断7.1流行特点7.1.1易感动物：牛、羊、骆驼、鹿、羊驼等反刍动物，其中牛羊感染最为普遍，幼龄动物易感且病情更严重。7.1.2感染途径：经口感染，反刍动物因采食了含有第三期幼虫的牧草或饮水时饮入第三期幼虫而感染。7.1.3地理分布：血矛线虫病的病原有捻转血矛线虫、柏氏血矛线虫、似血矛线虫和长柄血矛线虫，我国以捻转血矛线虫最为常见，在各省市自治区均有分布。7.1.4流行季节：我国地域广阔，各地因气候条件差异大而有所不同。北方牛羊的感染季节主要是夏季；南方全年都能发生，但主要在夏、秋两季，高温高湿环境有利于幼虫存活和传播。7.2典型临床症状7.2.1贫血：动物眼结膜苍白，严重时黏膜、皮肤均呈现苍白，精神萎靡。7.2.2水肿：动物下颌和下腹部水肿，严重时四肢也会出现水肿，按压后留有凹陷。7.2.3腹泻：动物排出稀便，肛门和后肢常被粪便污染；幼龄动物严重感染可引起急性死亡；如不死亡，则转为慢性型，表现为生长停滞、发育受阻、消瘦、被毛粗乱无光泽。7.2.4血常规检查异常：动物红细胞数量下降、血红蛋白含量降低，符合贫血特征。7.3典型病理变化7.3.1可见黏膜和皮肤苍白，血液稀薄，凝固不良，内脏器官（尤其是肝脏、脾脏）苍白。7.3.2皮下水肿，腹腔、胸腔可能出现积液。7.3.3真胃黏膜充血、出血，黏膜表面可见大量虫体附着，严重时黏膜糜烂、脱落。8病原学诊断8.1样品采集与处理8.1.1粪便样品：按照NY/T541的规定，采集动物新鲜粪便5-10g，置于洁净容器中，做好标记，及时送检；若不能立即检测，应冷藏保存，保存时间不超过24小时。8.1.2真胃内容物及黏膜样品：采集疑似感染动物的真胃，取出内容物，刮取黏膜组织，混合后置于洁净容器中，冷藏送检。8.1.3样品处理：粪便样品加入适量生理盐水，充分搅拌均匀，制成悬液，用于后续虫卵检测；真胃内容物及黏膜样品加入生理盐水，反复冲洗，收集冲洗液，用于虫体分离。8.2虫卵检测8.2.1直接涂片法：取少量粪便悬液，滴于载玻片上，加盖盖玻片，置于光学显微镜下观察，查找血矛线虫虫卵。血矛线虫虫卵呈椭圆形，淡灰黑色，卵壳质地均匀，随粪便刚排出时多为桑葚期或更早阶段，平均大小约70.9μm×45.9μm。8.2.2饱和盐水漂浮法：取5g粪便，加入10mL生理盐水，充分研磨，用纱布过滤，取滤液置于离心管中，加入饱和氯化钠溶液，搅拌均匀，静置30分钟，用接种环取表面液膜，滴于载玻片上，显微镜下观察，查找虫卵。该方法可提高虫卵检出率。8.3虫体检测与鉴定8.3.1虫体分离：将真胃内容物及黏膜冲洗液置于平皿中，加入适量生理盐水，置于体视显微镜下，用挑虫针挑取虫体，置于载玻片上，滴加卢氏碘液固定，光学显微镜下观察。8.3.2虫体鉴定：血矛线虫雌雄异体，颈乳突明显。雌虫长1.8cm～3.0cm，眼观生殖器为白色，消化道为红色，新鲜虫体呈现红白色相互缠绕状，镜下阴门盖异常明显；雄虫长1.5cm~2.2cm，背肋作“Y”字形。根据虫体形态特征，可区分不同种类的血矛线虫。8.4幼虫培养与鉴定8.4.1幼虫培养：取新鲜粪便适量，置于平皿中，加入少量生理盐水，保持湿度，置于25-28℃培养箱中培养7-10天，期间定期补充生理盐水，防止干燥。8.4.2幼虫分离与鉴定：培养结束后，用饱和盐水漂浮法分离幼虫，置于显微镜下观察。血矛线虫第三期幼虫大小约0.65～0.75mm×0.025～0.030mm，口孔封闭，有圆形小口腔，食道呈丝状形，肠管由16个方形细胞构成，尾部尖细，长约0.054mm~0.068mm。9免疫学诊断9.1样品采集与处理按照NY/T541的规定，采集动物静脉血，置于无抗凝剂采血管中，静置析出血清，离心分离血清，置于-20℃保存，备用。9.2ELISA检测（以HcADRM重组蛋白为抗原）9.2.1包被：用PBS将HcADRM重组蛋白稀释至适宜浓度，加入酶标板，每孔100μL，4℃孵育过夜，弃去孔内液体，用PBST洗涤3次，每次3分钟，拍干。9.2.2封闭：加入5%BSA，每孔150μL，37℃孵育1小时，弃去封闭液，PBST洗涤3次，拍干。9.2.3加样：加入待检血清、阳性血清和阴性血清，每孔100μL，37℃孵育1小时，弃去孔内液体，PBST洗涤3次，拍干。9.2.4加酶标二抗：加入HRP标记的SPG，每孔100μL，37℃孵育1小时，弃去酶标二抗，PBST洗涤3次，拍干。9.2.5显色：加入TMB工作液，每孔100μL，37℃避光孵育15-20分钟。9.2.6终止：加入2M硫酸，每孔50μL，终止反应。9.2.7结果判定：用酶标仪在450nm波长下测定每孔吸光度（OD值）。以阴性血清OD值的平均值加3倍标准差作为临界值，待检血清OD值大于临界值为阳性，小于或等于临界值为阴性。10分子生物学诊断10.1样品采集与DNA提取采集粪便、真胃黏膜或虫体样品，按照粪便/组织基因组DNA提取试剂盒说明书的操作步骤，提取样品总DNA，置于-20℃保存，备用。10.2PCR检测10.2.1PCR反应体系：2×TaqPCRMix12.5μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，无菌去离子水8.5μL，总体系25μL。10.2.2PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃终延伸10分钟，4℃保存。10.2.3电泳检测：制备1.5%琼脂糖凝胶，加入EB染色，取PCR产物5μL，与上样缓冲液混合后，加入凝胶孔中，120V电压电泳30分钟，紫外分光光度计下观察结果。10.2.4结果判定：若出现与阳性对照一致的特异性条带，则为阳性；若未出现特异性条带，则为阴性。11诊断结果判定11.1疑似病例：符合7.1流行特点、7.2典型临床症状和7.3典型病理变化中的任意2项，且病原学诊断中虫卵检测、虫体检测或幼虫培养有1项疑似阳性。11.2确诊病例：疑似病例经病原学诊断（虫卵检测、虫体鉴定、幼虫鉴定任意1项阳性）、免疫学诊断（ELISA检测阳性）或分子生物学诊断（PCR检测阳性）中的任意1项确诊，即可判定为确诊病例。12检测报告检测报告应包括以下内容：样品信息（样品编号、采集时间、采集地点、动物种类、样品类型）、检测依据（本文件GB/T47205-2026）、检测方法、检测结果、结果判定、检测人员、检测日期、检测单位。附录A（规范性附录）试剂制备与配置方法A.1PBS（磷酸盐缓冲溶液）：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄、0.24gKH₂PO₄，加入1000mL蒸馏水，搅拌溶解，调节pH至7.4，高压灭菌后备用。A.25%BSA：称取5.0gBSA，加入100mLPBS，搅拌溶解，4℃冷藏备用。A.3TBST：取100mLTris-HCl缓冲液（0.1mol/L，pH7.5），加入0.5mLTween-20，搅拌均匀，高压灭菌后备用。A.4TMB工作液：按照试剂盒说明书配置，现配现用。A.5饱和氯化钠溶液：称取360gNaCl，加入1