CN119385975A 一种基于红细胞的仿生MOFs及其制备方法和应用 （吉林大学）

号一种基于红细胞的仿生MOFs及其制备方法本申请公开了一种红细胞的仿生MOFs及其同时调控白血病细胞中的DNA甲基化、组蛋白甲基化和RNA甲基化来增强针对急性髓系白血病的2所述UiO_66_NH2为UiO_66上连接有氨基官能5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述正丙醇锆溶液的浓度为70wt%,2与MA的重量比为1:0.025～0.15；量比为1mg:0.15x107～0.25x107个。9.权利要求1或2所述基于红细胞的仿生MOFs或根据权利要求3至8任一项所述制备方法得到的基于红细胞的仿生MOFs作为三重表观遗传调节剂在制备增强抗白血病免疫力的36A_RNA甲基化和组蛋白H3K9甲基化进行调节的表观遗传调节剂。4[0001]本申请涉及一种红细胞的仿生MOFs及其制备方法和应用，属于生物材料技术领[0002]急性髓性白血病(AML)是儿童患者中最常见的一种血液恶性肿瘤。标准化疗的疗[0003]表观遗传修饰会影响基因表达模式，而不会改变基本的DNA序列。表观遗传机制录本的N6_甲基腺苷(m6A)修饰改变破坏了正常的RNA处理，导致急性髓系白血病细胞的恶m6A_RNA甲基化的药物在临床前和临床研究中已显示出良好的效果，无论是作为单药还是反应和m6A_RNA甲基化来增强PD_L15我们的研究小组之前通过将CuS/碳点与巨噬细胞膜杂交(CuSCDB@MMT7)开发出了一种纳米肿瘤选择性，并能在近红外光下诱导高热，导致热稳定的多泛素化肿瘤抑制蛋白的积累。属有机框架(MOFs)开发了一种LSC生物仿生双金属纳米平台，用于靶向急性髓系白血病细6[0029]可选的，步骤S1中，步骤S1中，所述UiO_66_NH2与CM272的重量比为1:0.025~备方法得到的基于红细胞的仿生MOFs作为三重表观遗传调节剂在制备增强抗白血病免疫[0037]本申请提供的基于红细胞的仿生MOFs(MA272@MOF@RBC)，通过在MOFs中添加活的细胞毒性T细胞能识别并清除骨髓龛中的LSCs。MA272@MOF@RBC还能激发长期免疫记7小鼠红细胞的形态特征；(L)为制备MA272@MOF@RBC的示意图；(M)为含有MA272@MOF和MA272@MOF@RBC的溶液照片；(N)为MA272@MOF和MA272@MOF@RBC的Zeta电位；(O)为显示MA272@MOF@RBC中总蛋白的SDS_PA凝胶图像；(P)为流式细胞仪直方图显示MA272@MOF@RBC[0039]图2为本申请MA272@MOF@RBC可选择性地靶向急性髓系白血病和白血病干细胞测试：(A)为荧光标记的MA272@MOF@RBC合成示意图；(B)为共焦图像显示AML或正常细胞对定量评估；(D)为小鼠急性髓系白血病模型的建立和体内分布评估示意图；(E)为MA272@MOF@RBC在白血病小鼠体内的分布；(F)为白血病小鼠胫骨中MA272@MOF@RBC的荧光富集检测；(G)为流式细胞术图显示小鼠骨髓中LSCs中MA272@MOF@RBC的荧光信号；(H)为检测定组中的转录活性；(C)为指示组培养上清的IFN_β水平；(D)为流式细胞术分析指定组的印迹显示在CoCl2诱导的缺氧条件下，用MA272@MOF@RBC或MA272@MOF@LM处理的C1498细胞中HIF_1α的表达；(J)为指定组中DNMT3a的转录水平；(K)为指定组的细胞活力；(L)为[0041]图4为本申请MA272@MOF@RBC抑制白血病生长、诱导体内T细胞活化和免疫记忆；髓中LSCs(CD34+CD38+)的百分比；(J)为流式细胞定量检测白血病细胞中MHC_I和(K)为PD_比；(N)为指定组骨髓中CD8+T细胞的百分比；(O)为指定组脾中效应记忆T细胞(CD44+8[0045]图8为本申请用不同浓度的MA272@MOF@RBC处理LO2或原代正常骨髓(NBM)细胞48[0046]图9为本申请不同组别中患急性髓系白血病小鼠的体重，数据以平均值±SD表示[0047]图10为本申请不同组别急性髓系白血病小鼠的IFN_γ[0049]图12为本申请基于红细胞的仿生MOFs作为三重表观遗传调节剂增强抗白血病免[0054]装载能力(LC)和包封效率(EE)的获得采用C18柱高效液相色谱法(HPLC)评估了MA272@MOF@RBC中MA和CM272的装载能力(LC)和包封效率(EE)的计算方式[0057]使用JEOLJSM_6700F扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM，配备200kV场发射枪的Philips_FEITecnaiG2S_Twin显微镜)对纳米颗粒的形态进行了评估；使用布鲁克IFS66V/S傅立叶变换红外光谱仪和KBr小球获得了400_4000cm_1区域的傅立叶变换[0058]本申请中的实验中，按治疗细胞浓度为50ug/ml的浓度设置配置基于红细胞的仿[0060]C1498细胞购自美国组织培养物保藏中心，在添加了10％胎牛血清的Dulbecco改9[0066]用冷蛋白裂解缓冲液裂解经适当处理的细胞，并添加1％磷酸酶抑制剂(CellSignalingTechnology)。各组的蛋白质样本经SDS_PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯SantaCruzBiotechnology)和抗_HIF_1α(14179，CellSignalingTe不同时间。在指定时间间隔提取RNA并进行qPCR分析。使用线性回归分析确定mRNA的半衰[0074]4_6周龄的雄性C57BL/6N或Balb/c小鼠购自CharlesRiver公司，饲养于无病原体组、CM272+MA组(60μM的MA和1μM的CM272，相当于MA272@MOF@RBC中的剂量)和MA272@MOF@[0076]将H22细胞(1×106)皮下注射到雄性Balb/c小鼠的右侧腹部。当肿瘤体积达到约421)抗体(BioLegend)检测成熟的树突状细胞(DC和抗CD44(APC/Cy7)抗体(BioLegend)染色，以区分中枢记忆T细胞和效应记忆T细胞。抗肾脏，称重并在80℃的王水中消化3天。样品中的硅含量通过ICP一AES(Perkin一Elmer[0088]将100mgUiO_66_NH2纳米颗粒与10mgMA和10mgCM272在5mL甲醇溶剂中混合后[0092]合成过程示意图如图1L所示，将5mg的MA272@MOF纳米颗粒与200uL的1×107红细胞的PBS溶液混合，使用Avanti迷你挤压机(AvantiPolarLipids)挤出20个循环，然后用[0094]实施例1中采用室温合成法制备了具有代表性的MOFUiO_66作为药物载体，这种UiO_66的N2吸附/脱附等温曲线和孔径分布，UiO_66的比表面积和总孔体积分别为能力可归因于UiO_66的大孔隙结构，透射电子显微镜(TEM)测试确定了MA272@MOF的尺寸，MA272@MOF@RBC的电位逆转为_14.4±2.7mV(图1N)，这可能是由于红细胞膜的负电位维持标记(图1P、Q)。综上，说明成功合成了[0097]为了评估MA272@MOF@RBC特异性靶向白血病细胞的能力，对其在正常骨髓细胞和C1498细胞中的吸收情况进行跟踪：将MA272@MOF@RBC与Cy3或Cy7混合，使细胞与MA272@MOF@RBC纳米颗粒融合和封装(图2A)。C1498或LSC与Cy3标记的颗粒对白血病母细胞有更高的选择性。此外，用MA272@MOF@RBC处理的C1498细胞与用MA272@MOF处理的C1498细胞相比，锆含量明显更高，这证实红细胞包被促进了细胞对以及MHC_I和PD_L1表达的选通策略如图11所示。在骨髓细胞(图2F)和CD34+CD38_L2G)中都观察到了升高的Cy7荧光信号，从而证实了MA272@MOF@RBC对白血病的精准靶向能降低了5mCDNA甲基化和H3K9me组蛋白甲基化耐药性的关键因素。为验证MA272@MOF@RBC可以通过红细胞运输氧气来改善白血病的低氧的HIF1_α蛋白。虽然MA和CM272的组合不能下调HIF_1α,但即使是装载白血病细胞膜的[0103]为了验证体外实验结果，在C1498诱导的急性髓系白血病小鼠模型中检测了MOF@RBC对白血病生长的抑制率达到93.890天内存活率达到100％。此外，MA272@MOF@[0105]在体内进一步研究了MA272@MOF@RBC的潜在免疫机制。与体外结果一致，MA272@发挥着关键作用，能对以前遇到的病原体提供持久保护。如图4O所示，与其他组相比，MA272@MOF@RBC治疗小鼠脾细胞中的中心记忆T细胞(CD8+CD44+CD62L_)数量显著增加，这的抗白血病免疫力，采用C1498细胞再次对小鼠处理(图4P)。当未经处理的小鼠接受10×[0107]由于表观遗传机制会调节包括肝脏肿瘤在内的各种癌症的免疫反应，为探究MA272@MOF@RBC对肝癌的疗效，通过H22细胞的正位注射建立了小鼠肝脏肿瘤模型，并用TGI率高达92.9第80天的总存活率达到100％。各组肿瘤组织中增殖细胞核抗原的原位致(图5G)。各组均未发现明显的体重减轻，表明能诱导针对肝脏肿瘤的免疫记忆效应，在手术切除原发性肿瘤后对小鼠进行了再次挑战。申请基于红细胞的仿生MOFs(MA272@MOF@RBC)作为三重