CN119386175A 肿瘤微环境响应型纳米载药系统的制备方法 （中山大学附属第一医院）

肿瘤微环境响应型纳米载药系统的制备方法一种肿瘤微环境响应型纳米载药系统的制备方法，在碱性条件下通过生物矿化诱导形成MnO2纳米团簇，修饰HSA纳米粒后再通过碳二亚2(1)首先将HSA纳米粒溶于去离子水中制成浓度为10mg/mL的HSA溶液，向HSA溶液中加入KMnO4溶液，至25℃水浴条件下持续反应4小时，将制得的HSA_锰粒子进行透析(2)将HSA_锰粒子和DBCO_NHS室温反应过夜；然后透析超滤除去游离DBCO_NHS，得到于15mL的去离子水中制成浓度为10mg/mL的HSA溶液，向HSA溶液中加入3mL浓度为20mM的检测，用以判断HSA纳米粒是否成功载有MnO2、Ce6及PD_L1抗体；检测内容包括该纳米粒4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：利用DLS法测得纳米粒5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：利用TE6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：利7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：利用ICP_OES测得MnO2在纳米粒HMC@anti_PD_L1中的包封率和载药量分别为63％和1.21利用ELISA实验测得PD_L1抗体在纳米粒HMC@anti_PD_L1中的包封率和载药量分别为78.98％和1.46利用紫外_可见光吸收波谱分析得知Ce6在纳米粒HMC@anti_PD_L1中的包封9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：对纳米粒HMC@an3肿瘤微环境中乏氧、低pH以及高H2O2引起而且成为癌症治疗中许多抗癌药物递送的生物屏障。虽然纳米药物递送系统技术可利用[0005]为解决上述问题，本发明提供一种肿瘤微环境响应型纳4系统的制备方法，该纳米载药系统为PD_L1抗体、MnO2以及Ce6偶联到HSA纳米粒上的偶联[0007](1)首先将HSA纳米粒溶于去离子水中制成浓度为10mg/mL的HSA溶液，向HSA溶液中加入KMnO4溶液，至25℃水浴条件下持续反应4小时，将制得的HS[0011](5)将N3_PEG_PD_L1抗体与DBCO_HMC发生无铜点击反应，将PD_L1抗体偶联到HSA以判断HSA纳米粒是否成功载有MnO2、[0014]对上述技术方案的进一步改进为，利用DLS法测得纳米粒HMC@anti_PD_L1的粒径[0015]对上述技术方案的进一步改进为，利用TEM观察到纳米粒HMC@anti_PD_L1呈球状[0017]对上述技术方案的进一步改进为，利用ICP_OES测得MnO2在纳米粒HMC@anti_PD_L1中的包封率和载药量分别为63％和1.21利用ELISA实验测得PD_L1抗体在纳米粒HMC@anti_PD_L1中的包封率和载药量分别为78.98％和1.46利用紫外_可见光吸收波谱分析得知Ce6在纳米粒HMC@anti_PD_L1中的包[0018]对上述技术方案的进一步改进为，对主要器官进行HE染色以研究纳米粒HMC@[0019]对上述技术方案的进一步改进为，对纳米粒HMC@antiPD_L1产生分别在体外模拟5[0021]本发明的肿瘤微环境响应型纳米载药系统通过以HSA纳米粒作为载体，在碱性条件下通过生物矿化诱导形成MnO2纳米团簇，修饰HSA纳米粒后再通过碳二亚胺法装载Ce6，及小分子药物，一方面将纳米粒逐渐降解为小尺寸(<10nm)的个体化治疗白蛋白药物复合2以及Mn2+的释放可通过磁共振[0031]图10是纳米粒HMC@anti_PD_L1在正常生理条件及模拟肿瘤微环境下不同时间的[0036]图15是纳米粒HMC@anti_PD_L1在4T13D细胞球在弱酸/H2O2条件下的深入递送效[0039]图17A是纳米粒HMC@anti_PD_L1联合声动力治疗远位效应评价的实验设计示意62以及Ce6偶联到HSA纳米粒上的偶联物。[0055](1)首先将150mg的HSA(人血清白蛋白)纳米粒溶于15mL的去离子水中制成浓度为[0058](4)采用traut’s(2_亚氨基硫烷盐酸盐)试剂活化PD_L1抗体巯[0059](5)将N3_PEG_PD_L1抗体与DBCO_HMC发生无铜点击反应，将PD_L1抗体偶联到HSAMnO2米粒HMC@anti_PD_L1在肿瘤微酸环境是否具备响应性释放[0061]在步骤(6)中，纳米粒HMC@anti_PD_L1的检测内容包括该纳米粒HMC@anti_PD_L1[0062]结合图1所示，利用DLS法测得纳米粒HMC@anti_PD_L1的粒径为409.08~抗体成功地包载在纳米粒HMC@anti_7粒HMC@anti_PD_L1在300_400nm附近显示出新的吸收带，这可能归因于MnO2的表面等离激进一步证实Ce6已成功偶联至HSA纳米粒表面，同时说明了纳米粒HMC@anti_PD_L1保留了[0067]药物包封率主要检测在纳米粒HMC@anti_PD_L1中MnO2、Ce6以及[0068]利用ICP_OES测得MnO2在纳米粒HMC@anti_PD_L1中的包封率和载药量分别为63%[0069]利用ELISA实验测得PD_L1抗体在纳米粒HMC@anti_PD_L1中的包封率和载药量分度值A对浓度C作图，得到标准曲线。对曲线进行线性拟合，得到标准曲线方程为：y=明显干扰。经计算得知Ce6在纳米粒HMC@anti_PD_L1中的包封率和载药量分别为48％和8H2O2纳米粒HMC@anti_PD_L1可以在肿瘤微环境下特异性地释放并发挥治疗作用。[0074]使用溶氧仪来测定纳米粒HMC@anti_PD_L1在正常生理条件及弱酸性/H2O2溶液中纳米粒HMC@anti_PD_L1可在肿瘤微环境中(ROS)检测的结果如图13所示，对纳米粒HMC@anti_PD_L1在正常生理条件及弱酸性/H2O2溶免疫原性，并且可靶向性作用于肿瘤组织中半胱氨酸的酸性分泌蛋9[0080]下面通过纳米粒HMC@anti_PD_L1体内外联合声动力治疗的药物递送与渗透性能anti_PD_L1来探究纳米粒HMC@anti_PD_L1于模拟肿瘤微环境条件下在3D细胞球的深入递L1也可在弱酸/H2O2条件下在3D细胞球均匀分布，意味着该纳米粒在响应分解后“由大变结合该纳米粒HMC@anti_PD_L1用功率为2.5W/cm2的超声仪只对小鼠的左侧肿瘤照射5分[0097]以上这些结果说明纳米粒HMC@anti_PD_L1介导的O2增效的声动力治疗不仅能够[0099]为了进一步验证纳米粒HMC@anti_PD_L1介导的声动力治疗是否能在肿瘤中触发[0106]f.接着经PBS洗涤后再用AlexaFluor5瘤切片中出现大量的红色荧光，证明纳米粒HMC@anti_PD_L1结合声动力治疗能够增加CRT27.4已知，CD8+T细胞对肿瘤细胞具有高度细胞毒性，而CD4+T细胞被认为是辅助性细PD_L1介导的声动力治疗在激活效应细胞上anti_PD_L1介导的声动力治疗对肿瘤组织内调节性T淋巴细胞的影响，在经纳米粒HMC@anti_PD_L1结合声动力治疗处理后对肿瘤细胞进anti_CD25_APC、anti_CD4_FITC和anti_[0122]为了更进一步验证纳米粒HMC@anti_PD_L1联合声动力治[0123]结合图21A所示，纳米粒HMC@anti_PD_L1联合声动力治疗后远端肿瘤复发的实验[0127]记忆T细胞可以更快地产生比首次接触此抗原更强烈的免疫反应，这也是是衡量肿瘤免疫治疗的重要指标之一。记忆性T细胞分为中央记忆性T细胞(CentralmemoryT