2023年版宏基因组二代测序技术在血液病患者感染病原诊断中的应用中国专家共识

2023年版宏基因组二代测序技术在血液病患者感染病原诊断中的应用中国专家共识一、前言血液病患者由于疾病本身导致的免疫功能缺陷、化疗或造血干细胞移植等治疗引起的骨髓抑制及免疫抑制，感染已成为其最常见的并发症及主要死亡原因之一。传统病原学诊断方法如细菌培养、涂片镜检、血清学检测等存在检测周期长、阳性率低、难以覆盖少见或罕见病原体等局限性，无法满足血液病患者感染早期精准诊断的需求。宏基因组二代测序（metagenomicnext-generationsequencing,mNGS）技术无需预先培养，可直接对临床样本中的所有核酸进行高通量测序，通过生物信息学分析快速鉴定病原体（包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等）及耐药基因，为血液病患者感染的早期诊断、精准治疗提供了重要技术支持。为规范mNGS技术在血液病患者感染病原诊断中的应用，提高诊断准确性及临床应用价值，国内相关领域专家经充分讨论达成以下共识。二、适用范围本共识适用于各类血液病患者（包括白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等）及造血干细胞移植受者的感染病原诊断，尤其推荐在以下场景中应用mNGS技术：1.不明原因发热或疑似感染的粒细胞缺乏患者，常规病原学检测（培养、涂片、血清学等）24-48小时无阳性结果，或经验性抗感染治疗72小时无效者；2.重症肺炎、中枢神经系统感染、血流感染等重症感染患者，病情进展迅速，常规检测无法明确病原体，需要尽早明确诊断指导治疗者；3.疑似感染少见、罕见或特殊病原体（如诺卡菌、放线菌、肺孢子菌、马尔尼菲篮状菌、新型病毒等），常规检测方法难以覆盖者；4.造血干细胞移植后出现的难治性感染，或伴有发热、肺部浸润、肝功能异常等不明原因症状，怀疑存在混合感染或机会性感染；5.长期使用广谱抗菌药物、糖皮质激素或免疫抑制剂后出现的感染，怀疑存在耐药菌或真菌感染者；6.其他经临床医生评估认为需要进行mNGS检测的感染疑似病例。三、mNGS技术实施要点3.1样本采集与运输样本采集的规范性直接影响mNGS检测结果的准确性，需严格遵循以下要求：（1）样本类型选择：根据感染部位及临床怀疑的病原体类型选择合适的样本，优先选择病原体载量高、受污染风险低的样本。常见样本类型及适用场景：

-血液：怀疑血流感染、菌血症或全身播散性感染时采集，推荐在抗菌药物使用前采集2-3套血培养标本（每套包括需氧瓶和厌氧瓶），同时留取EDTA抗凝全血或血浆用于mNGS检测；

-下呼吸道样本：怀疑肺部感染时，优先选择支气管肺泡灌洗液（BALF），其次为合格痰液（镜检白细胞>25/低倍视野、上皮细胞<10/低倍视野），避免采集鼻咽拭子等污染风险高的样本；

-脑脊液：怀疑中枢神经系统感染时采集，至少留取2-5mL脑脊液，尽快送检；

-脓液、体液（胸水、腹水、心包积液等）：怀疑局部感染时采集，需严格无菌操作，避免皮肤定植菌污染；

-组织样本：怀疑局部组织感染或深部真菌病时，采集病变部位组织，优先选择新鲜样本。（2）采集时机：尽量在抗菌药物使用前采集样本；若已使用抗菌药物，需在下次给药前或抗菌药物浓度低谷期采集，或在更换抗菌药物前采集；对于重症感染患者，即使已使用抗菌药物，也应尽快采集样本进行mNGS检测。（3）采集规范：严格无菌操作，使用无菌容器盛装样本；血液样本需使用无核酸酶、无防腐剂的EDTA抗凝管；避免样本接触环境中的微生物（如空气中的细菌、操作者皮肤定植菌）。（4）运输与保存：样本采集后需在2-4小时内送至实验室；若无法及时送检，需置于4℃冰箱保存（不超过24小时），避免反复冻融；对于不能在24小时内检测的样本，需置于-80℃冰箱长期保存，运输过程中使用干冰维持低温。3.2核酸提取核酸提取的效率及纯度直接影响测序结果的质量，需选择合适的提取方法及试剂盒：（1）提取方法：根据样本类型选择对应的核酸提取试剂盒，优先选择能同时提取DNA和RNA的试剂盒，以覆盖DNA和RNA病原体（如病毒）；对于富含抑制剂的样本（如痰液、脓液），需选择具有抑制剂去除功能的提取试剂盒，或增加去抑制剂步骤。（2）质量控制：提取的核酸需检测浓度及纯度，推荐使用Qubit荧光定量法检测浓度，Nanodrop检测OD260/OD280比值（DNA样本推荐1.8-2.0，RNA样本推荐1.9-2.1）；对于浓度过低的样本，可考虑进行核酸富集或二次提取。（3）人源DNA去除：对于血液、脑脊液等含有人源DNA较多的样本，需采用人源DNA去除技术（如特异性酶切、免疫磁珠捕获等），以提高病原体核酸的占比，增加测序的有效性。3.3文库构建与测序（1）文库构建：选择经过验证的文库构建试剂盒，根据核酸类型（DNA、RNA）选择对应的构建方法；对于RNA样本，需先进行反转录合成cDNA，再进行文库构建；文库构建过程中需设置阴性对照（如无核酸水），以监测污染情况。（2）文库质量检测：构建好的文库需检测浓度及片段大小，推荐使用Qubit检测浓度，Agilent2100生物分析仪检测片段大小（预期片段大小约300-500bp），确保文库质量符合测序要求。（3）测序：选择合适的二代测序平台（如Illumina、IonTorrent等），根据样本类型及临床需求设置测序深度：一般细菌、真菌感染的样本测序深度推荐500万-1000万reads，病毒感染样本推荐1000万-2000万reads，疑难感染或罕见病原体检测可适当提高测序深度；测序过程中需设置阳性对照（已知病原体核酸）及阴性对照，以监测测序过程的质量。3.4生物信息学分析生物信息学分析是mNGS结果解读的核心，需建立标准化的分析流程：（1）数据预处理：对原始测序数据进行质量过滤，去除低质量reads、接头序列及引物序列；对于人源DNA占比较高的样本，需将reads与人类参考基因组（如hg38）进行比对，过滤掉人源序列，保留非人类序列用于后续分析。（2）病原体比对与注释：将过滤后的reads与病原体数据库（包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等）进行比对，推荐使用综合数据库（如NCBIRefSeq、GenBank）及专业病原体数据库（如PMID、VFDB等）；比对时需设置合适的阈值（如比对相似度≥95%，覆盖度≥10%），以区分病原体与污染菌或背景菌。（3）耐药基因检测：可同时对测序数据进行耐药基因分析，比对耐药基因数据库（如CARD、ARDB），识别常见的耐药基因（如β-内酰胺酶基因、万古霉素耐药基因等），并结合病原体类型判断耐药表型。（4）结果判读：需区分真阳性病原体与污染菌、背景菌，判断标准包括：测序reads数、覆盖度、病原体丰度、临床症状及其他检测结果；对于低丰度病原体，需结合临床情况谨慎判读，必要时进行PCR验证。四、临床应用与结果解读4.1临床应用场景（1）粒细胞缺乏伴发热：mNGS可快速检测出引起发热的病原体，包括细菌、真菌、病毒等，尤其对于常规培养阴性的病例，可显著提高诊断阳性率，指导抗菌药物的调整；若mNGS检测出耐药基因，可及时更换敏感抗菌药物，改善患者预后。（2）重症肺炎：血液病患者合并重症肺炎时，病原体复杂多样，包括细菌、真菌、病毒、肺孢子菌等，mNGS可在24-48小时内明确病原体，避免经验性治疗的盲目性；对于免疫抑制患者，mNGS能有效检测出少见病原体（如诺卡菌、放线菌、马尔尼菲篮状菌等），为精准治疗提供依据。（3）中枢神经系统感染：脑脊液mNGS的诊断阳性率显著高于传统涂片及培养，尤其对于结核分枝杆菌、新型隐球菌、病毒等病原体，可早期明确诊断，降低患者的死亡率。（4）造血干细胞移植后感染：移植后患者免疫功能极度低下，易发生混合感染、机会性感染及耐药菌感染，mNGS可同时检测多种病原体及耐药基因，帮助临床医生及时调整治疗方案，减少感染相关并发症。（5）耐药菌感染：mNGS可直接检测病原体的耐药基因，预测耐药表型，指导临床选择敏感抗菌药物，避免无效抗菌药物的使用，减少抗菌药物的滥用。4.2结果解读原则（1）阳性结果解读：需结合患者的临床症状、体征、影像学检查及其他实验室检查结果综合判断，避免孤立解读mNGS结果。若mNGS检测出的病原体与临床高度符合，且测序reads数较高、覆盖度较好，可作为确诊依据；若检测出低丰度病原体，需考虑污染或背景菌的可能，建议结合PCR或培养结果验证；对于正常菌群（如皮肤定植菌、呼吸道正常菌群），需根据患者的病情判断是否为感染病原体。（2）阴性结果解读：mNGS阴性结果不能完全排除感染，可能的原因包括：样本采集时机不当（病原体载量低）、抗菌药物使用导致病原体死亡或核酸降解、样本中存在核酸抑制剂、测序深度不足等；若临床高度怀疑感染但mNGS结果阴性，建议重新采集样本进行检测，或结合其他检测方法（如血清学、PCR）进一步验证。（3）耐药基因结果解读：耐药基因阳性提示病原体可能存在耐药性，但需结合病原体类型及药敏试验结果综合判断；部分耐药基因可能不表达或表达水平不足，需结合临床治疗效果调整方案。五、质量控制体系5.1前质量控制前质量控制是保证mNGS检测结果准确性的关键，包括：（1）样本采集、运输、保存的规范化培训：对临床医护人员进行培训，确保样本采集符合规范，避免污染及核酸降解；（2）样本验收：实验室接收样本时需检查样本类型、量、保存条件及采集时间，不符合要求的样本需重新采集；（3）环境控制：样本处理区域需严格分区（试剂准备区、样本处理区、文库构建区），避免交叉污染；使用无核酸酶的试剂及耗材，定期对环境进行清洁消毒。5.2中质量控制中质量控制包括核酸提取、文库构建及测序过程的质量控制：（1）核酸提取质量控制：设置阳性对照（已知病原体核酸）及阴性对照（无核酸水），监测核酸提取过程中的污染及提取效率；定期对提取试剂盒进行性能验证，确保提取效率稳定；（2）文库构建质量控制：设置文库构建阴性对照，监测文库构建过程中的污染；对文库浓度及片段大小进行检测，确保文库质量符合要求；（3）测序质量控制：定期对测序仪进行维护及校准，设置测序阳性对照及阴性对照，监测测序过程的准确性；对测序数据进行质量评估，确保Q30比例≥80%。5.3后质量控制后质量控制包括生物信息学分析及结果报告的质量控制：（1）生物信息学分析质量控制：建立标准化的分析流程，设置分析阳性对照及阴性对照，确保分析结果的准确性；定期对分析流程进行验证，更新数据库以覆盖新发现的病原体；（2）结果验证：对于疑似阳性结果或低丰度病原体，需进行PCR或培养验证；对于临床高度怀疑但mNGS结果阴性的病例，建议重新分析数据或更换检测方法；（3）报告规范：mNGS报告需包含样本信息、检测方法、测序数据质量、病原体检测结果（包括名称、reads数、覆盖度）、耐药基因检测结果及临床建议；报告需由具备mNGS解读能力的检验医师或临床医生审核签字。5.4实验室质量体系开展mNGS检测的实验室需建立完善的质量体系，包括：人员培训（检验人员、分析人员、解读人员）、室内质控（定期进行阳性对照、阴性对照检测）、室间质评（参加国家或省级室间质评活动）、质量记录的保存等，确保检测结果的准确性及可靠性。六、伦理与管理（1）知情同意：在进行mNGS检测前，需向患者或其家属充分告知检测的目的、意义、费用、可能的结果及风险，取得患者的知情同意；（2）数据隐私保护：mNGS检测涉及患者的遗传信息及病原信息，需严格遵守医疗数据隐私保护相关法律法规，确保患者数据的安全性，避免数据泄露；（3）报告管理：mNGS报告需由具备专业知识的人员审核，避免过度解读或误读；临床医生需结合患者病情合理使用mNGS结果，避免过度依赖；（4）多学科协作：建立临床医生、检验医师、微生物学家及生物信息学家的多学科协作机制，共同解读mNGS结果，制定合理的治疗方案；（5）医保政策衔接：积极推动mNGS检测纳入医保报销范围，减轻患者的