DB32T5362-2026 饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫的核酸检测 重组酶介导等温核酸扩增法

饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫的核酸检测重组酶介导等温核酸扩增法江苏省市场监督管理局发发出布版I前言 Ⅲ 12规范性引用文件 13术语和定义 14仪器与设备 15试剂与材料 26水样富集和核酸提取 27核酸检测 38结果判定 4附录A(规范性)RAA基础反应体系溶液 5附录B(规范性)隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增特异性基因的引物和探针 6附录C(规范性)隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增反应体系 7参考文献 8Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省卫生健康委员会提出并组织实施。本文件由江苏省卫生健康标准化技术委员会归口。本文件起草单位：江苏省血吸虫病防治研究所。1饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫扩增法本文件描述了重组酶介导核酸等温扩增法检测饮用水中隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫。本文件适用于各类出厂水和末梢水的检测与监测工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。隐孢子虫Cryptosporidium属于真球虫目，隐孢子虫科，隐孢子虫属的重要的机会致病性原虫。蓝氏贾第鞭毛虫Giardialamblia贾第鞭毛虫，属于双滴虫目，六鞭毛科，贾第鞭毛虫属。生活史包括滋养体和包囊2个发育阶段，其中包囊是感染阶段，可存在于饮用水中。感染人体后，主要寄生于人体十二指肠、小肠上端和胆囊，可引起蓝氏贾第鞭毛虫病。重组酶介导等温核酸扩增技术Recombinase-aidedamplification;RAA一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在等温条件下(一般为39℃)进行核酸扩增的技术。4仪器与设备该方法所需装置如下：2e)流量计。该方法所需设备如下：a)恒温水浴锅：可加热至100℃;该方法所需设备如下：a)RAA恒温核酸扩增检测仪：带有恒温(39±1)℃扩增功能、荧光定量系统及计算机处理系统的荧光检测仪。需具备FAM(6-羧基荧光素)和HEX(六氯-6-甲基荧光素)两种荧光通道；应试剂的恒温混合；c)离心机：相对离心力≥12000g;d)微量可调移液器：量程为100μL组织核酸提取试剂盒、RAA基础反应体系溶液(也可采用等效的扩增反应试剂盒):见附录A的表A.1。乙酸镁溶液(140mmol/L),无水乙醇，试验用水(符合GB/T6682要求)。扩增隐孢子虫属特异性的18SrRNA基因以及蓝氏贾第鞭毛虫β-贾第素(β-giardin)基因的特异性6水样富集和核酸提取3a)将滤膜安置固定于过滤器进水口侧；c)将组装完毕的过滤器通过快速接头/口和橡胶软管连接于自来水龙头后；d)利用快速接头/口和橡胶软管将流量计连接于过滤器后面；按照以下步骤进行核酸提取：a)用无菌眼科剪将滤膜剪成碎片，装入15mL离心管中；b)向上述离心管中加入10mL溶菌酶(50mg/mL)和500μL蛋白酶k(20mg/mL),充分混匀后置于水浴锅中50℃孵育60min;c)再向上述样品管中加入1mL玻璃珠(直径1mm~2mm),并置于超声破碎仪中超声60min(超声功率为25kHz～36kHz),工作10s间隔10s;d)将上述样本置于高速离心机，13000r/min离心2min;e)取离心后的上清液，按照组织核酸提取试剂盒的操作说明完成核酸提取；提取的核酸进行下一扩增反应体系见附录C的表C.1;用双蒸水溶解稀释引物探针至10μmol/L。按照以下步骤进行：a)按照附录A的要求配制基础反应体系；b)将配置好的反应体系溶液按照附录C进行混合；d)向PCR管的管盖内侧加入5μL乙酸镁溶液；4g)将PCR管置于RAA恒温核酸扩增检测仪(也可采用其他等效的荧光检测仪)中进行实时检测；h)设置反应温度39℃,时间30min。8结果判定8.1.1反应结束后，设置斜率(荧光值mV/时间min)为20。8.1.230min内，通道一FAM荧光信号扩增曲线的斜率≥20时判定为蓝氏贾第鞭毛虫阳性；否则判定为阴性。8.1.330min内，通道二HEX荧光信号扩增曲线的斜率≥20时判定为隐孢子虫阳性；否则判定为阴性。8.2质量控制8.2.1FAM通道和HEX通道：加标水样检测结果判定为阳性；试验用水检测结果判定为阴性。8.2.2如果检测结果不符合8.2.1的要求，该检测结果视为无效，应检查仪器、试剂等的偏差，确认无误后重新检测。5(规范性)RAA基础反应体系溶液表A.1给出了RAA基础反应体系溶液的组分和浓度。表A.1RAA基础反应体系溶液醋酸钾聚乙二醇(PEG-35000)单链结合蛋白UvsY蛋白6(规范性)隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增特异性基因的引物和探针表B.1给出了隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增特异性基因的引物和探针。表B.1隐孢子虫和蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增特异性基因的引物和探针引物/探针序列(5'-3')隐孢子虫正向引物ATGACGGGTAACGGGGAATTAGGGT隐孢子虫反向引物CTCCAATTGATACTYGTWAAGGG隐孢子虫探针“CGCAAATTACCCAATCCTRAYACAGGGAGG/i6HEXdT/A/idSp//CTCAGGAAGGAGGCCCTCAAGAGCTCTCGCGGGCGATCGTCTCCTTCTTYGCCACGGAGAACGCMGARAGGAAGAAGA/i6FAMdT//idSp//iAYGACCAGCTCAACGC-C3spa“HEX为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。FAM为荧光报告基团，idSp为四氢呋喃。7(规范性)隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增反应体系表C.1给出了隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增反应体系。表C.1隐孢子虫与蓝氏贾第鞭毛虫RAA扩增反应体系隐孢子虫正向引物隐孢子虫反向引物隐孢子虫探针118[1]周晓农，陈家旭.食源性寄生虫病.北京：人民卫生出版社.2009:139-143.[