荧光免疫层析技术原理进展宣讲专家讲座

荧光免疫层析技术原理与进展第1页荧光免疫层析技术基本原理层析法(chromatography)原理是利用混合物中各组分物理性质之差(如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)而建立来一个分离技术。层析系统是由固定相(stationaryphase)和流动(MobilePhase)相组成。第2页固定相是固体物质或固定于固体物质上成份。流动相是能够流动物质，如水或各种溶剂。层析过程：当待分离混合物随流动相经过固定相时，因为混合物各组分理化性质差异，与固定相相互作用弱组分随流动相移动时受到阻滞作用小，向前移速度快；与固定相相互作用强组分向前移动速度慢。从而实现混合物中各组分分离。

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免疫层析法免疫层析技术是建立在层析技术和抗原一抗体特异性免疫反应基础上一项新兴免疫检测技术。第4页免疫层析技术以固定有检测线和控制线条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，经过毛细作用使待测物在层析条上移动。待测物在T线处发生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。待测物层析方向免疫反应TC免疫层析技术基本原理示意图第5页荧光（fluorescence）

荧光物质吸收激发光能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。

发射光谱和激发光谱发射光谱是指固定激发波长，在不一样波长下统计样品发射荧光强度。激发光谱是指固定检测发射波长，用不一样波长激发光激发样品统计对应荧光发射强度。第6页荧光效率定义:荧光物质分子将光能转变成荧光百分率计算公式:

荧光效率=

荧光寿命定义:荧光物质被激发后所产生荧光衰减到一定程度时所用时间。各种荧光物质荧光寿命不一样。

第7页荧光淬灭定义:荧光物质在一些理化原因作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。引发荧光淬灭原因：有如紫外线照射、高温、一些硝基化合物、重氮化合物等。第8页免疫层析技术以固定有检测线和控制线条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，经过毛细作用使待测物在层析条上移动。待测物在T线处发生特异性免疫反应。游离物在C线处发生免疫反应。待测物层析方向免疫反应TC免疫层析技术基本原理示意图第9页第10页竞争法待测物中某种抗原与T（检测线）线处同种抗原竞争性地与标识抗体相结合过程。第11页

竞争法含抗原AY1:A单抗与标识物偶联体Y2：抗原AY3:羊抗鼠二抗结合垫免疫层析法检测实物图第12页夹心法待测物中某种抗体（抗原）与T线处抗原A（抗原A）以及荧光标识抗原（抗体）特异性相结合过程，在T线处形成抗体A+抗原+抗体B形式夹心结构。结合垫免疫层析法检测实物图第13页双抗体夹心法(k)Ab1-Ag-Ab2(k)Ab1(k)Ab1-AgAb2Ab3-(k)Ab1TC阳性结果T,C都有颜色待测液含抗原Ag待测液，不含抗原Ag(k)Ab1(k)Ab1(k)Ab1Ab2TCAb3-(k)Ab1阴性结果T无颜色，C有颜色双抗体加心法检测原理图K代表某一标识物结合垫免疫层析法检测实物图第14页双抗原夹心法双抗原夹心反应模式阳性检测（左）与阴性检测（右）第15页利用荧光免疫层析试纸条能够实现对待测物定性或者定量检测.第16页第17页金颗粒之间存在静电斥力使其在水中保持相对稳定状态，形成稳定水溶性胶体，即称为胶体金胶体金第18页胶体金现有明亮色彩，又有高电子密度，能够吸附生物大分子，且不影响生物分子活性，故可作为生物分子标志物，用于免疫反应中抗原或抗体标识定位，定性甚至定量研究。层析试纸标识用金颗粒直径大多在20～40nm，呈深红色。第19页胶体金标识蛋白质过程是蛋白被动吸附到金颗粒表面过程。因为蛋白分子牢靠地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，阻止了胶体金颗粒相互接触，而使胶体金处于稳定状态。第20页胶体金作为标志物有以下优势:①几乎可标识全部蛋白分子，过程简单，效率高，用量少，廉价，基本不改变被标识蛋白活性。且稳定，无毒，使用方便，保质期长。②不一样直径纳米金能够用于多重标识。③结果判断只需普通光学仪器或直接肉眼观察。第21页胶体金作为标识物应用第22页试孕纸第23页第24页应用（定量）08天津大学精密仪器与光电子工程学院与天津市进出口检验检疫局合作开发研发一个便携式仪器。竞争法原理用于农药残留定量检测第25页2镧系元素镧系元素又称为稀土金属元素，指元素周期表中原子序数57～71全部元素。第26页两种不一样镧系元素离子(分别作为光吸收子和发射子)掺杂入亚微米尺寸陶瓷颗粒(作为主基质)中，会组成一类能上转发光产生荧光特殊材料。——UCP(up-convertingphosphor，UCP)颗粒。第27页UCP颗粒主要含有以下三种成份:主基质：氧硫化物（Y2O2S,GdO2S）、氟化物(YF3,GdF3）、硅酸盐(YSi2O5,YSi3O7）...吸收子Yb3+Er3+Sm3+发射子Er3+Ho3+Tm3+

A2S1S2A1A3第28页UCP独特优势①高敏感性，有报道UCP灵敏度可达胶体金100倍。②高稳定性，UCP发光信号不受检测环境或样品腐蚀或标志物本身衰变等影响，可长久存放和可重复。③使用简便，安全无毒，可适合用于定量分析与多重分析，在普通试验室或野外现场都可轻松应用.第29页中科院报道了一个用于免疫活性检测UCP试纸条读数计，采取半导体激光器作为光源，CCD作为光电接收器，步进电机带动控制试纸条移动装置UCP应用举例第30页军事医学科学院研制出一个UPT十通道免疫层析试纸盘，同时检测各种抗体以确证是否感染鼠疫菌第31页霍乱弧菌—霍乱—烈性肠道传染病甲胎蛋白(AFP）-肝癌特异性指标。第32页3量子点量子点(quantumdots，QDs)，主要指主族Ⅱ～Ⅵ(如CdSe)，Ⅲ～Ⅴ(如InP、InAs、GaSe)，副族化合物以及Si等元素组成纳米颗粒第33页①QDs有可准确调谐发射波长，经过调整粒子尺寸可得到不一样发射光谱，即可使用大小不一样同种QDs颗粒实现不一样颜色标识。第34页②较大Stokes位移和狭窄对称荧光谱峰。使得用同一激发光源可同时激发不一样大小量子点，产生不一样发射光谱，使同时检测多样本成为可能。③QDs荧光性质稳定，可长久保留，经受重复屡次激发。第35页④生物相容性好物理结合

化学偶联第36页量子点是一个新荧光标识物，当前在免疫层析中得应用相对UCP，胶体金较少见报道。张国华，赖卫华等，量子点标识免疫层析试纸条快速检测莱克多巴胺研究[J]，，以CdSe为标识物，对莱克多巴胺(一个苯酚胺类β-肾上腺素激动剂)快速定量检测。胡华军，付涛等，CdTe/ZnSe核壳量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗研究，,检测克伦特罗(Clenbuterol，CLE)—属于β-兴奋剂类药品,又称“瘦肉精”量子点在免疫层析中应用第37页4有机纳米粒子荧光素衍生物等荧光染料类有机纳米粒子是早期惯用于免疫层析技术中一大类标志物，如异硫氰酸酯荧光素，标识原理基本都是利用荧光分子中异硫氰酸根为反应基团，与蛋白分子中氨基结合，实现对蛋白标识，同时以分子中荧光素为检测信号，早期应用研究较多。有机纳米粒子荧光发射依赖于粒子本身化学发光集团不含有没有机纳米粒子波长可调控尺寸效应。第38页5纳米磁性颗粒纳米磁性颗粒(magneticnanoparticle，MNs)也被称为超顺磁颗粒，它结合了磁性粒子和纳米材料优点，含有粒径小、超顺磁性和比表面积大等特征。第39页经典是以磁性材料四氧化三铁.表面引入活性基团，经过耦联反应与酶、抗体等生物分子结合形成生物标志物.超顺磁性.第40页6碳纳米管碳纳米管(carbonnanotubes，CNTs)结构可看成是石墨六角形网格结构发生一定弯曲而形成空间拓扑结构。第41页CNTs作为生物分子标志物原理与胶体金类似，