IL-27对急性单核细胞白血病细胞株U937作用机制的深度解析

IL-27对急性单核细胞白血病细胞株

U937作用机制的深度解析

一、引言

1.1研究背景

急性单核细胞白血病(AcuteMonocyticLeukemia,AML-M5)作为白血病的一种亚型，主

要特征为单核细胞过度增生、分化不成熟且异常。这种疾病起病隐匿或急骤，患者常出现面

色苍白、疲乏、困倦和软弱无力等症状。其高白细胞性白血病发生率高，髓外浸润严重，治疗

难度较大，预后较差。尽管当前治疗手段，如化疗、放疗和造血干细胞移植等不断发展，但即

使进行了全面且积极的治疗，患者死亡率仍然居高不下，严重威胁着人类的生命健康。

在化疗方面，虽然联合化疗在一定程度上提高了缓解率，但化疗药物不仅会杀伤白血病细胞，

也会对正常细胞造成损害，导致患者出现严重的不良反应，如骨髓抑制、胃肠道反应、肝肾功

能损害等，且部分患者会出现复发的情况。造血干细胞移植是一种有效的治疗方法，但面临

着供者来源有限、移植后免疫排斥反应等问题，限制了其广泛应用。因此，迫切需要寻找新的

治疗方法和药物，以提高患者的生存率和生活质量。

近年来，随着对免疫系统研究的深入，细胞因子在肿瘤治疗中的作用逐渐受到关注。白细胞介

素-27(Interleukin-27,IL-27)作为一种具有独特生物学功能的细胞因子，在免疫系统中

扮演着重要角色。11_-27属于1-12家族，由p28和EBI3两个亚基组成，主要由抗原呈递

细胞产生，如巨噬细胞、炎性单核细胞、小胶质细胞和梃突细胞等，在浆细胞、内皮细胞和上

皮细胞中也有表达。其受体IL-27R由细胞因子结合蛋白。亚基(IL-27Ra/Wsx-1)和信

号转导蛋白B(gp130)亚基组成，IL-27R。在T细胞中表达水平最高，在B细胞、巨噬细

胞中也有较高的表达水平。

IL-27具有促炎和抗炎的双重特性，可调节辅助性T细胞发育、抑制T细胞增殖、刺激细胞

毒性T细胞活性、诱导B细胞同种型转换，对先天免疫细胞具有多种作用。在肿瘤免疫治疗

中，IL-27被证明可以通过多种途径发挥抗肿瘤作用，如促进肿瘤特异性T细胞的活化和增

殖，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力；抑制肿瘤血管生成，阻断肿瘤的营养供应；诱导肿瘤细胞

凋亡等。然而，IL-27在急性单核细胞白血病中的作用机制尚未完全明确，相关研究仍处于

初步阶段。

U937细胞株作为一种人体单核细胞系，常被用于研究单核细胞白血病的生物学特性和治疗。

探究IL-27对U937细胞株的作用，有助于深入了解IL-27在急性单核细胞白血病中的作用

机制，为开发新型免疫治疗手段提供理论依据，具有重要的理论意义和临床应用价值。

1-2研究目的与意义

急性单核细胞白血病严重威胁人类生命健康，现有的化疗、放疗和造血干细胞移植等治疗手段

存在诸多局限性，如化疗药物的不良反应、造血干细胞移植的供者短缺和免疫排斥等问题，

导致患者的生存率和生活质量难以得到有效提高c因此，寻找新的治疗靶点和方法迫在眉睫。

白细胞介素-27作为一种在免疫系统中具有重要调节作月的细胞因子，其抗肿瘤作用逐渐受

到关注。然而，IL-27在急性单核细胞白血病中的具体作用机制尚未完全明确。本研究旨在

探究IL-27对急性单核细胞白血病细胞株U937的作用，包括对细胞增殖、凋亡、周期和迁

移能力等方面的影响。通过深入研究IL-27对U937细胞的作用机制，有望揭示IL-27在急

性单核细胞白血病发生发展中的作用，为白血病的治疗提供新的理论依据。

在实践意义方面，若能证实IL-27对U937细胞具有显著的抑制作用，那么IL-27有可能成

为急性单核细胞白血病治疗的新靶点。基于此，可以开发以IL-27为基础的新型免疫治疗策

略，如IL-27激动剂或相关的基因治疗方法，为白血病患者提供更有效、副作用更小的治疗

选择。这不仅有助于提高患者的缓解率和生存率，还能改善患者的生活质量，减轻患者及其

家庭的负担，具有重要的临床应用价值和社会意义。同时，本研究结果也可能为其他类型白

血病的治疗研究提供借鉴和启示，推动整个白血病治疗领域的发展。

1.3国内外研究现状

在白血病治疗领域，长期以来化疗是主要治疗手段之一。经典的化疗方案如DA（柔红霉素+

阿糖胞昔）方案等，在一定程度上提高了白血病患者的缓解率。然而，化疗药物的非特异性

杀伤使得正常细胞也受到损害，引发一系列严重的不良反应。随着医学技术的发展，造血干

细胞移植成为治疗白血病的重要手段，尤其是异基因造血干细胞移植，对于部分患者能够实现

长期生存甚至治愈。但供者来源的限制、高昂的治疗费月以及移植后的免疫排斥反应和感染

等并发症，极大地限制了其广泛应用。

近年来，免疫治疗作为一种新兴的治疗策略，为白血病的治疗带来了新的希望。细胞因子作

为免疫系统中的重要调节分子，在免疫治疗中发挥着关键作用。白细胞介素-27作为一种具

有独特生物学功能的细胞因子，其在肿瘤免疫治疗中的作用逐渐受到关注。国外研究中，有

团队通过对黑色素瘤小鼠模型的研究发现，IL-27能够激活肿瘤特异性T细胞，增强其对肿

瘤细胞的杀伤能力，显著抑制肿瘤的生长。在结肠癌的研究中，IL・27被证明可以通过抑制

肿瘤血管生成，阻断肿瘤的营养供应，从而抑制肿瘤的发展。

国内研究也在积极探索IL-27的抗肿瘤机制。有学者发现，在神经胶质瘤细胞中，IL・27可

以诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与激活caspase家族蛋白有关。在原发性肝癌的研究中，

IL-27能够调节肿瘤微环境中的免疫细胞，增强机体的抗肿瘤免疫反应。然而，无论是国内

还是国外，关于IL-27在白血病尤其是急性单核细胞白血病中的研究仍相对较少。

在急性单核细胞白血病相关研究中，国外有研究初步探讨了IL-27对白血病细胞系的影响，

发现IL-27可以抑制白血病细胞的增殖，但具体的分子机制尚未完全明确。国内的一些研究

则集中在IL-27对白血病患者免疫功能的影响，发现IL-27水平与患者的病情进展和预后可

能存在一定的关联，但这些研究大多处于初步阶段，缺乏深入的机制探讨和临床应用研究。

对于IL・27如何影响急性单核细胞白血病细胞的增殖、凋亡、周期和迁移等生物学行为，以

及其在体内的抗肿瘤效果和安全性等方面，仍有待进一步深入研究。

二、IL・27与急性单核细胞白血病的理论基础

2.1IL-27的结构与特性

白细胞介素-27是一种在免疫系统中发挥关键作用的细胞因子，属于IL-12家族，其独特的

分子结构赋予了它多样的生物学功能。IL-27由p28和EBI3两个亚基通过二硫键连接形成

异源二聚体结构。其中，p28基因定位于人类染色体16p11,在人类和小鼠中cDNA序列编

码分别为243和234个氨基酸多肽，蛋白质分子质量分别为24.5ku和23.6ku,二者同源

性达73%。p28需要与伴侣蛋白EBI3共表达才能发挥生物学活性。EBI3最早在Epstein-

Barr病毒感染后的B细胞表达产物中被发现，是一种可溶性受体样糖蛋白，蛋白质分子质量

约为34ku。除B细胞外，EBI3也可由抗原提呈细胞（如巨噬细胞、树突状细胞、单核细

胞）、T细胞、角质形成细胞等产生。在抗原呈递细胞中，p28和EBI3共同表达，在人类活

化的单核细胞和树突细胞中表达水平最高，而在鼠类巨噬细胞内表达最高。

IL-27的受体IL-27R由细胞因子结合蛋白。亚基（IL-27Ra/Wsx-1）和信号转导蛋白B

（gp130）亚基组成。IL-27R。在T细胞中表达水平最高，在B细胞、巨噬细胞中乜有较高

的表达水平。单一的IL・27Ra或gp130不能介导IL-27的信号转导，只有二者共同存在时

才能完成信号传递。通过对cDNA库中IL-27R。和gp130数据的查询发现，这两种受体可

以在多种类型的细胞中共表达，且在不同细胞中的表达水平存在差异，这也暗示了IL-27可

能具有多种生物学效应。

IL-27具有促炎和抗炎的双重特性，是一种多效性细胞因子。在免疫调节方面，IL-27可调

节辅助性T细胞发育，在T细胞增殖分化早期，能够促进CD4T细胞向Th1方向分化，同时

协同IL-2促进初始T细胞产生IFN-Y。它还能刺激细胞毒性T细胞活性，增强其对病原体

和肿瘤细胞的杀伤能力。此外，IL-27可以诱导B细胞同种型转换，调节B细胞的功能。

在炎症反应中，IL-27既可以促进单核细胞产生IL・1、IL-12、IL・18和IFN等炎症细胞因

子，发挥促炎作用；又能够抑制辅助性17T细胞（Th17：和诱导型调节性T细胞（iTreg）的

发育，减少炎症介质的释放，从而起到抗炎的效果。在抗肿瘤免疫中，IL-27可以通过多种

途径发挥作用，如诱导肿瘤特异性T细胞的活化和增殖，增强其对肿瘤细胞的杀伤能力；抑

制肿瘤血管生成，阻断肿瘤的营养供应；诱导肿瘤细胞凋亡等。

2.2IL-27的功能概述

IL-27作为一种多功能细胞因子，在免疫调节和抗肿瘤等方面发挥着至关重要的作用，其作用

机制复杂且多样。

在免疫调节方面，IL-27对T细胞的分化和功能具有显著影响。在T细胞增殖分化早期，IL-

27能够促进CD4+T细胞向Th1方向分化。Th1细胞主要分泌IFN-Y等细胞因子，在细胞免

疫中发挥关键作用，参与对病毒感染、肿瘤细胞等的免疫应答。IL-27通过与T细胞表面的受

体IL-27R结合，激活下游的Janus激酶信号转导/转录激活因子（JAK/STAT）信号通路。

具体来说，IL-27与IL-27RC和gp130亚基结合后，使JAK激酶磷酸化，进而激活STAT1

和STAT3等转录因子o激活的STAT1和STAT3进入细胞核，与相关基因的启动子区域结

合，促进Th1相关基因的表达，如T-bet等转录因子的表达上调，从而推动CD4+T细胞向

Th1细胞分化。同时，IL-27还能协同IL-2促进初始T细胞产生IFN-y，增强Th1细胞介导

的免疫反应。

IL-27对Th17细胞和诱导型调节性T细胞（iTreg）的发育具有抑制作用。Th17细胞主要分

泌IL-17等细胞因子，在炎症反应和自身免疫性疾病中发挥重要作用。IL-27可以通过抑制

Th17细胞相关转录因子RORyt的表达，从而抑制Th17细胞的分化和发育。在抑制iTreg

细胞发育方面，IL-27可能通过影响相关信号通路，如抑制STAT3的磷酸化，减少iTreg细

胞的产生。这种对Th17和iTreg细胞的调节作用，有助于维持免疫系统的平衡，防止过度炎

症反应和自身免疫性疾病的发生。

在B细胞中，IL-27可以诱导B细胞同种型转换。它能够诱导小鼠B细胞产生lgG2a,抑制

IL-4诱导的lgG1的合成；在人B细胞中，IL-27可以诱导产生lgG1。这种同种型转换作

用，使得B细胞产生的抗体类型发生改变，以适应不同的免疫需求。IL-27还可能影响B细

胞的增殖和分化，调节体液免疫反应。例如，IL-27可能通过调节B细胞内的信号通路，如

激活PI3K/Akt等信号途径，影响B细胞的存活和增殖。

IL-27对先天免疫细胞也具有多种作用。在巨噬细胞中，IL-27可以促进其产生IL-1、IL-12、

IL-18和IFN等炎症细胞因子，增强巨噬细胞的免疫活性。IL-27可以激活巨噬细胞内的NF-

KB等信号通路，促进炎症细胞因子基因的转录和表达。同时，IL-27还可以影响巨噬细胞的

吞噬功能和抗原呈递能力，使其更好地发挥免疫防御作月。在自然杀伤细胞（NK细胞）

中，IL-27可以增强其活化和杀伤能力。IL-27通过激活NK细胞内的信号通路，如

JAK/STAT和MAPK等信号通路，上调NK细胞表面的活化受体表达，增强NK细胞对靶细

胞的识别和杀伤能力。

在抗肿瘤方面，IL-27具有多种作用机制。IL-27可以激活肿瘤特异性T细胞和NK细胞介导

的肿瘤免疫反应。通过促进Th1细胞的分化和活化，IL-27增强了肿瘤特异性T细胞对肿瘤

细胞的识别和杀伤能力。IL-27还能直接增强NK细胞的活性，使其能够更有效地杀伤肿瘤细

胞。IL-27可以诱导肿瘤细胞凋亡。研究发现，IL-27可以上调肿瘤细胞内促凋亡蛋白Bax的

表达，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而破坏肿瘤细胞内的凋亡平衡，诱导肿瘤细胞发

生凋亡。IL-27还可以通过激活caspase家族蛋白，启动凋亡信号通路，促进肿瘤细胞凋

亡。

IL-27可以抑制肿瘤血管生成。肿瘤的生长和转移依赖于充足的血液供应，血管生成是肿瘤发

展的关键环节。IL-27可以通过下调促血管生成相关基因，如VEGFR1、PTGS1、C0X-1和

FGFR3等的表达，同时上调抗血管生成相关基因，如IP-10和TIP3等的表达，阻碍肿瘤新

血管的形成。IL-27还可以通过抑制肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)等促血管生成

因子，减少血管内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制肿瘤血管生成。

2.3急性单核细胞白血病简述

急性单核细胞白血病(AcuteMonocyticLeukemia,AML-M5)属于急性髓系白血病的一种

亚型，其发病机制较为复杂，涉及遗传、环境等多种因素。在遗传因素方面，家族遗传倾向

和基因突变起着重要作用。研究发现，一些家族中存在特定的遗传突变，使得家族成员患急

性单核细胞白血病的风险增加。例如，某些基因突变会影响细胞的增殖、分化和凋亡等正常

生理过程，导致造血干细胞异常分化为大量的单核细胞，这些异常单核细胞在骨髓中大量增

殖，抑制了正常造血干细胞的功能。FLT3、NPM1、CEBPA等基因突变在急性单核细胞白

血病中较为常见。FLT3基因突变会导致FLT3受体持续激活，促进细胞的增殖和存活；

NPM1基因突变会影响核仁蛋白的正常功能，干扰细胞的生长和分化；CEBPA基因突变则会

影响转录因子的活性，导致造血细胞分化异常。

环境因素也是急性单核细胞白血病发病的重要诱因。长期接触某些化学物质，如苯、甲醛、

含有苯的有机溶剂等，会对造血干细胞造成损伤，增加基因突变的风险，从而引发白血病。

苯及其衍生物可以通过代谢产生具有毒性的中间产物，这些产物能够与DNA结合，导致

DNA损伤和基因突变。电离辐射也是一个重要的环境因素，如X射线、丫射线等。高剂量的

电离辐射会直接破坏DNA的结构，引起染色体断裂、易位等异常，进而导致细胞恶变。免疫

系统的异常也与急性单核细胞白血病的发生密切相关。免疫系统功能失调时，无法有效地识

别和清除异常细胞，使得白血病细胞得以在体内增殖和扩散。一些免疫缺陷患者更容易患急

性单核细胞白血病，这表明免疫系统在维持机体健康和预防白血病发生中起着关键作用。

急性单核细胞白血病患者常表现出多种临床症状。贫血是常见症状之一，患者会出现面色苍

白、头晕、乏力、心、悸、气短等表现。这是由于白血病细胞在骨髓中大量增殖，抑制了正常

红细胞的生成，导致红细胞数量减少和血红蛋白水平降低。出血症状也较为常见，可表现为

皮肤瘀点、瘀斑、鼻出血、牙龈出血、月经过多等。这是因为白血病细胞抑制了血小板的生

成，同时还会破坏血管内皮细胞，影响凝血功能。感染也是患者常见的并发症，由于白血病

细胞抑制了正常白细胞的生成，导致机体免疫力下降，容易受到各种病原体的侵袭。患者可

出现发热、咳嗽、咳痰、腹痛、腹泻等感染症状。此外，患者还可能出现肝脾肿大、淋巴结

肿大等症状。单核细胞浸润可引起牙龈增生、皮肤损害等特异性表现。部分患者会出现牙龈

肿胀、增生，甚至影响咀嚼和口腔功能；皮肤可出现丘疹、结节、斑块等病变。

目前，急性单核细胞白血病的治疗方法主要包括化疗、靶向治疗和造血干细胞移植等。化疗

是基础治疗手段，通过使用化学药物来杀灭白血病细胞。常用的化疗药物有阿糖胞昔、柔红

霉素等。阿糖胞昔能够抑制DNA的合成，阻止白血病纸胞的增殖；柔红霉素则可以嵌入

DNA双链中，破坏DNA的结构和功能，从而诱导白血病细胞凋亡。化疗方案通常根据患者

的年龄、体能状态、病情严重程度等因素进行个体化制定。对于年轻、体能较好的患者，可

能会采用强度较高的化疗方案，以争取更高的缓解率；而对于老年、体能较差的患者，则会适

当降低化疗强度，以减少不良反应。化疗也存在诸多局限性，它不仅会杀伤白血病细胞，还

会对正常细胞造成损害，导致患者出现骨髓抑制、胃肠道反应、肝肾功能损害等不良反应。

化疗后患者的骨髓造血功能会受到抑制，白细胞、红细胞和血小板数量急剧戒少，增加感染和

出血的风险；胃肠道反应表现为恶心、呕吐、食欲不振等，影响患者的营养摄入和生活质量；

肝肾功能损害则可能导致转氨酶升高、黄疸、肾功能衰竭等严重后果。

靶向治疗是近年来发展起来的一种新型治疗方法，它针对白血病细胞的特异性靶点进行精准治

疗。酪氨酸激酶抑制剂可以抑制白血病细胞中异常激活的酪氨酸激酶，阻断信号传导通路，

从而抑制白血病细胞的增殖和存活。单克隆抗体则可以特异性地识别白血病细胞表面的抗

原，通过抗体依赖的细胞毒作用或补体依赖的细胞毒作用来杀伤白血病细胞。靶向治疗具启

更高的选择性和更低的毒副作用，能够更精准地杀灭白血病细胞，减少对正常细胞的损害。

但靶向治疗也存在耐药性问题，部分患者在治疗一段时向后会出现耐药，导致治疗效果下

降。

造血干细胞移植是一种有望根治急性单核细胞白血病的方法，尤其适用于高危或复发难治的患

者。它通过将健康的造血干细胞移植到患者体内，重建患者的造血和免疫功能。造血干细胞

可以来源于自体或异体。自体造血干细胞移植是采集患者自身缓解期的造血干细胞进行储

存，在化疗后回输到患者体内；异体造血干细胞移植则是寻找与患者HLA配型相合的供者，

采集供者的造血干细胞进行移植。移植前需要对患者进行预处理，通常包括全身照射和化疗

药物治疗，以清除患者体内的白血病细胞和抑制免疫系统，为造血干细胞的植入创造条件。

移植后患者需要密切关注免疫重建情况，并采取有效的抗感染治疗措施，以预防感染和其他并

发症的发生。造血干细胞移植面临着供者来源有限、移植后免疫排斥反应等问题。合适的供

者难找，尤其是在非血缘关系供者中；免疫排斥反应可能导致移植物抗宿主病，严重影响患者

的生存质量和预后。

三、实验设计与方法

3.1实验材料准备

本实验所需细胞株为急性单核细胞白血病细胞株U937,购自中国典型培养物保藏中心。

U937细胞具有单核细胞的特性，在白血病研究中被广泛应用，能够较好地模拟急性单核细胞

白血病的生物学行为。

实验中用到的主要试剂包括：重组人IL・27（PeproTech公司）,其纯度高、活性稳定，可

用于细胞培养实验中对细胞进行刺激；RPMI-1640培养基（Gibe。公司），这是一种专门为

悬浮细胞培养设计的培养基，能够提供细胞生长所需的各种营养成分；胎牛血清（FBS,

Gibe。公司），富含多种生长因子和营养物质，可促进细胞的生长和增殖；青霉素-链霉素双

抗溶液（Solarbi。公司），用于防止细胞培养过程中的斑菌污染；0.25%胰蛋白酶-EDTA溶

液（Solarbi。公司），用于消化贴壁细胞，使其成为单斑胞悬液，以便进行传代和实验操作；

MTT试剂（Sigma公司），是一种检测细胞存活和生长的试剂，通过检测活细胞线粒体中的

琥珀酸脱氢酶对外源性MTT的还原能力，来间接反映活细胞数量；二甲基亚碉（DMSO.

Sigma公司），用于溶解MTT还原产物甲瓒，以便进行吸光度测定；AnnexinV-FITC/PI凋

亡检测试剂盒（BDBiosciences公司），可用于准确检测细胞凋亡情况，通过流式细胞仪分

析AnnexinV和PI的双染纭果，能够区分早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞；细胞周期检测试

剂盒（Beyotime公司），利用碘化丙咤（PI）对细胞DNA进行染色，通过流式细胞仪分析

不同DNA含量的细胞比例，从而确定细胞周期分布；Transwell小室（Corning公司），用

于细胞迁移实验，能够有效模拟体内细胞迁移的微环境，研究细胞的迁移能力；Matrigel基

质胶（Corning公司），在细胞侵袭实验中使用，可在Transwell小室的上室形成一层基质

膜，模拟细胞外基质，检测细胞穿过基质膜的侵袭能力。

实验仪器设备有：CO2细胞培养箱（ThermoScien而c公司），能够精确控制培养环境的温

度、湿度和CO2浓度，为细胞生长提供稳定的环境；超净工作台（苏州净化设备有限公

司），通过过滤空气中的尘埃和微生物，提供一个无菌的操作空间，防止细胞污染；倒置显

微镜（Olympus公司），用于实时观察细胞的形态、生长状态和增殖情况；低速离心机

（Eppendorf公司），用于细胞离心收集、换液等操作，分离细胞和培养液；酶标仪（Bio・

Rad公司），在MTT实验中用于测定吸光度值，定量分析细胞活性；流式细胞仪（BD

FACSCalibur）,能够快速、准确地对细胞进行多参数分析，如细胞凋亡、细胞周期等；

Transwell小室培养板（24孔板，Corning公司）,配合Transwell小室使用，进行细胞迁移

和侵袭实验；细胞计数板（Therm。Scientific公司），月于手工计数细胞数量，确定细胞浓

度。

3.2细胞培养与处理

将急性单核细胞白血病细胞株U937培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100

Mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中。将细胞置于37℃、5%CO2的细胞培养箱口培养，

保持培养箱内湿度恒定，为细胞提供适宜的生长环境。定期使用倒置显微镜观察细胞的形态

和生长状态，正常的U937细胞呈悬浮生长，形态呈圆形，大小较为均一，细胞折光性良

好。当细胞密度达到80%-90%融合时，即细胞在培养基中分布较为密集，相互之间接近但

未完全重叠时，进行传代操作。

传代时，采用离心传代法。先将细胞悬液转移至无菌的离心管中，设置离心机转速为150

g,离心5分钟。离心结束后，小心吸弃上清液，避免吸到细胞沉淀。向离心管中加入适量

预热至37℃的新鲜RPMI7640培养基，用移液器轻轻吹打细胞沉淀，使细胞充分悬浮，制

成单细胞悬液。将单细胞悬液按照1：3-1:4的比例接种到新的培养瓶中，补充适量的新鲜培

养基，轻轻摇匀后放回培养箝继续培养。

进行IL-27处理实验时，将处于对数生长期的U937细胞以每孔5x104个细胞的密度接种于

96孔板中，每孔加入200pL培养基，设置3个复孔，以保证实验结果的准确性和可靠性。

将96孔板置于培养箱中孵育24小时，使细胞贴壁并适应新的环境。孵育结束后，将细胞分

为实验组和对照组。实验组分别加入终浓度为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL

的重组人IL-27,对照组则加入等体积的不含IL-27的培养基。将96孔板继续放回培养箱

中培养，分别在培养12小时、24小时和48小时后进行后续实验检测，以观察不同浓度IL-

27在不同时间点对U937细胞的作用效果。

3.3检测指标与方法

3.3.1细胞增殖检测

采用MTT法检测不同浓度IL-27处理不同时间后U937细胞的增殖情况。在处理时'司点到

达后，向每孔加入20PL浓度为5mg/mL的MTT溶液，轻轻混匀，避免产生气泡。将96

孔板继续放入37℃、5%CO2的培养箱中孵育4小时。此时，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢

酶会将外源性还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中。孵育结束后，小心吸

弃上清液，注意不要吸走甲瓒结晶。每孔加入150pL二甲基亚飒(DMSO),振荡10分

钟，使甲瓒充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度(OD)值。根据公式

计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(％)=(1-实验组OD值/对照组OD值)

x100%o通过比较不同实验组与对照组的OD值和增殖抑制率，分析IL-27对U937细胞增

殖的影响。

3.3.2细胞凋亡检测

运用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪检测细胞凋亡情况。将不同浓度IL

■27处理相应时间后的U937细胞收集到离心管中，设置离心机转速为150g,离心5分

钟。离心后吸弃上清液，用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤后均以150g离心5分

钟。向细胞沉淀中加入500pLBindingBuffer重悬细胞，使细胞浓度约为1x106/mL。接

着，向重悬后的细胞悬液中加入5pLAnnexinV-FITC和5PLpI染色液，轻轻混匀,室温

避光孵育15分钟。孵育完成后，在1小时内使用流式细胞仪进行检测。在流式细胞仪检测

过程中，以AnnexinV-FITC为横坐标，PI为纵坐标，通过分析散点图中不同象限的细胞分

布情况，确定细胞凋亡的比例。其中，右下象限为早期凋亡细胞(AnnexinV+/Pr),右上

象限为晚期凋亡细胞(AnnexinV+/Pl+),左上象限为坏死细胞(AnnexinV/Pl+),左下

象限为活细胞(AnnexinV-/PI-)。通过计算早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞占总细胞数的比

例，评估IL-27对U937细胞凋亡的诱导作用。

3.3.3细胞周期检测

使用细胞周期检测试剂盒通过流式细胞仪检测细胞周期分布。将经过IL-27处理的U937细

胞收集至离心管中，150g离心5分钟，吸弃上清液。用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次洗

涤后150g离心5分钟。向细胞沉淀中缓慢加入预冷的70%乙醇，边加边轻轻吹打，使细胞

充分分散，避免细胞成团。将细胞固定于4℃冰箱中过夜。固定完成后，150g离心5分

钟，弃去固定液，用预冷的PBS洗涤细胞2次。向细胞沉淀中加入500兄含有RNaseA

(终浓度为100pg/mL)的PI染色液，轻轻混匀，室温避光孵育30分钟。孵育结束后，使

用流式细胞仪检测。在流式细胞仪检测时，通过分析不同DNA含量的细胞比例，确定细胞周

期分布情况。G1期细胞DNA含量为2n,S期细胞DNA含量介于2n-4n之间，G2/M期细

胞DNA含量为4n。通过计算各期细胞所占的百分比，分析IL-27对U937细胞周期的影

响。

3.3.4细胞迁移能力检测

采用Transwell小室检测细胞迁移能力。在实验前，将Transwell小室（8pm孔径）放入24

孔板中。在下室中加入600兄含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基作为趋化因子。将经

过不同浓度IL-27处理相应时间后的U937细胞用无血清的RPMI-1640培养基重悬，调整

细胞浓度为1x106/mL。取200PL细胞悬液加入到Transwell小室的上室中°将24孔板置

于37。（2、5%CO2的培养箱中孵育24小时。孵育结束后，取出Transwell小室，用棉签小

心擦去小室上室未迁移的细胞。将小室放入4%多聚甲醛中固定30分钟，然后用0.1%结晶

紫染色液染色15分钟。染色完成后，用清水冲洗小室数次，去除多余的染色液。在显微镜

下随机选取5个视野，计数迁移到下室膜表面的细胞数量。通过比较不同实验组迁移细胞的

数量，评估IL-27对U937细胞迁移能力的影响。

3.3.5蛋白表达检测

利用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测相关蛋白的表达。将不同浓度IL-27处理后的

U937细胞收集到离心管中，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），

冰裂解30分钟，期间不时轻轻振荡。裂解结束后，12000g离心15分钟，取_1_清液作为

蛋白样品。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白样品的浓度。将蛋白样品与5x上样缓冲液按

4:1的比例混合，100℃煮沸5分钟使蛋白变性。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶

电泳，根据蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度。电泳结束后，通过湿转法将凝胶上的蛋白

转移至PVDF膜上。将PVDF膜放入5%脱脂牛奶中，室温封闭1小时，以减少非特异性结

合。封闭结束后，将PVDF膜与一抗（如抗Bax抗体、抗Bel・2抗体、抗p21抗体等，根

据检测目的选择）在4℃孵育过夜。一抗孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，

每次10分钟。然后将PVDF膜与相应的二抗（如HRP标记的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）室

温孵育1小时。二抗孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。

最后，使用化学发光底物（如ECL试剂）进行显色，通过凝胶成像系统曝光显影，分析蛋白

条带的灰度值。以B-actin作为内参蛋白，通过比较目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比

值，确定目的蛋白的相对表达量，从而分析IL-27对相关蛋白表达的影响。

3.4实验分组与对照设置

本实验设置了严格的实验组和对照组，以确保实验结果的准确性和可靠性，有效探究IL・27

对急性单核细胞白血病细胞株U937的作用。

将处于对数生长期的U937细胞以每孔5x104个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入200

皿培养基，设置3个复孔。在细胞贴壁并适应环境24小时后，进行分组处理。

实验组分别加入终浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的重组人IL-27,每个浓度设置

3个复孔。不同浓度的设置旨在探究IL-27对U937细胞作用的剂量效应关系，分析随着IL

-27浓度变化，对细胞增殖、凋亡、周期和迁移等生物学行为的影响。例如，较低浓度的IL-

27（10ng/mL）可能对细胞产生轻微的作用，而较高浓度（100ng/mL）可能会产生更显著的

影响。

对照组加入等体积的不含IL-27的培养基，同样设置3个复孔。对照组的设置是实验的重要

基础，它能够提供一个基准数据，用于对比实验组中加入IL-27后细胞的变化情况。通过与

对照组比较，可以明确判断出IL-27对U937细胞的影响是由IL・27本身引起的，而不是其

他因素导致的。

在细胞增殖检测实验中，实验组和对照组在加入IL-27或培养基后，分别在培养12小时、

24小时和48小时后进行MTT检测。在细胞凋亡检测实验中，按照相同的分组和处理时间，

收集细胞进行AnnexinV-FITC/PI染色和流式细胞仪检测。细胞周期检测和细胞迁移能力检

测也遵循相同的分组和处理时间设置，以保证各个检测指标实验条件的一致性。这样的实验

分组与对照设置，能够有效控制实验变量，减少误差，从而得出关于IL-27对U937细胞作

用的准确结论。

3.5统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件对实验数据进行分析处理。所有实验均独立重复至少3次，以确

保数据的可靠性和重复性。计量资料以均数士标准差(x士s)表示，两组间比较采用独立样本

t检验；多组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),若方差齐性，进步进行

LSD-t检验进行两两比较；若方差不齐，则采用Dunne1fsT3检验进行两两比较。以

Pv0.05为差异具有统计学意义，P<0.01为差异具有高度统计学意义。在细胞增殖实脸中，

通过比较不同实验组和对照组在不同时间点的吸光度值和细胞增殖抑制率，分析IL-27浓度

和作用时间对细胞增殖的影响。在细胞凋亡、细胞周期和细胞迁移实验中，同样运用上述统

计学方法，比较不同实验组与对照组的凋亡率、各期细胞比例和迁移细胞数量，判断IL-27

对这些生物学过程的作用是否具有统计学差异。在蛋白表达检测中，通过分析目的蛋白与内

参蛋白条带灰度值的比值，采用相应的统计学方法比较不同实验组中蛋白表达水平的差异，从

而明确IL-27对相关蛋白表达的影响。

四、实验结果与分析

4.1IL-27对U937细胞增殖的影响

利用MTT法检测不同浓度IL-27(Ong/mL.10ng/mL.50ng/mL、100ng/mL)处理

U937细胞12小时、24小时和48小时后的增殖情况，结果如图1所示。

IL-27浓12小时24小时48小时12小时增24小时增48小时增

度OD值OD值OD值殖抑制率殖抑制率殖抑制率

(ng/mL(%)(%)(%)

)

0(对'0.587±0.020.765±0.031.023±0.04000

昭)：3|5

10I0.556±0.020.698±0.020.897±0.035.28±1.058.76±1.5412.32±2.1

I0|81

50i0.512±0.010.623±0.020.789±0.0312.78±1.818.56±2.322.87±2.5

B42946

100।0.465±0.010.556±0.020.654±0.0220.82±2.527.32±3.136.07±3.4

518625

(注：数据以均数士标准差表示，n=3)

从图1和表格数据可以看出随着IL-27浓度的增加和作用时间的延长，U937细胞的0D

值逐渐降低，细胞增殖抑制率逐渐升高。与对照组相比，10ng/mLIL-27处理12小时、24

小时和48小时后，细胞增殖抑制率分别为5.28%、8.76%和12.32%,差异具有统计学意义

(P<0.05)。50ng/mLIL•27处理组在相应时间点的增殖抑制率分别为12.78%、18.56%

和22.87%,与对照组相比，差异具有高度统计学意义(P<0.01)。100ng/mLIL-27处理

组的增殖抑制率更高，在12小时、24小时和48小时时分别达到20.82%、27.32%和

36.07%,与对照组相比，差异具有极显著统计学意义(P<0.001)o

进一步进行单因素方差分析，结果显示IL-27浓度和作用时间对U937细胞增殖抑制率均有

显著影响(P<0.01)oLSD-t检验两两比较结果表明，不同浓度IL-27处理组之间在各时

间点的增殖抑制率差异均具有统计学意义(P<0.05)。这表明IL-27能够显著抑制U937细

胞的增殖，且这种抑制作用呈浓度和时间依赖性。随着IL-27浓度的升高，对U937细胞增

殖的抑制作用逐渐增强；作用时间越长，抑制效果也越明显。这种浓度和时间依赖性的抑制

作用，为进一步研究IL-27在急性单核细胞白血病治疗中的应用提供了重要的实验依据。

4.2IL-27对U937细胞凋亡的影响

运用AnnexinV・FITC/PI凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪，检测不同浓度IL-27(0

ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL)处理U937细胞48小时后的凋亡情况,结果如

图2所示。

IL-27浓度早期凋亡率(%)晚期凋亡率(%)总凋亡率(％)

(ng/mL)

0(对照)2.35±0.451.56±0.323.91±0.56

104.56±0.673.21±0.457.77±0.89

508.78±1.025.67±0.7814.45±1.23

10015.67±1.569.87±1.2325.54±1.89

(注：数据以均数士标准差表示，n=3)

从图2和表格数据可以看山随着IL-27浓度的增加，U937细胞的早期凋亡率、晚期凋亡

率和总凋亡率均逐渐升高。对照组的总凋亡率为3.91%,10ng/mLIL-27处理组的总凋亡率

升高至7.77%,与对照组相匕差异具有统计学意义(P<0.05)。50ng/mLIL-27处理组

的总凋亡率达到14.45%,与对照组相比，差异具有高度统计学意义(P<0.01)o100ng/mL

IL-27处理组的总凋亡率高达25.54%,与对照组相比，差异具有极显著统计学意义

(P<0.001)0

单因素方差分析结果显示，IL・27浓度对U937细胞凋亡率有显著影响(P<0.01)。LSD•t

检验两两比较表明，不同浓度IL-27处理组之间的凋亡率差异均具有统计学意义

(P<0.05)。这表明IL-27能够显著诱导U937细胞凋亡，且诱导凋亡的作用呈浓度依赖

性。IL-27浓度越高，对U937细胞凋亡的诱导作用越强。这种浓度依赖性的凋亡诱导作

用，进一步说明了IL-27在抑制U937细胞生长方面的重要作用机制，为IL-27作为急性单

核细胞白血病潜在治疗靶点提供了有力的实验证据。

4.3IL-27对U937细胞周期的影响

使用细胞周期检测试剂盒结合流式细胞仪，检测不同浓度IL-27(0ng/mL、10ng/mL、50

ng/mL.100ng/mL)处理U937细胞48小时后的细胞周期分布情况，结果如表1和皆3所

ZFo

IL-27浓度G1期细胞比例S期细胞比例(％)G2/M期细胞比例

(ng/mL)(%)(%)

0(对照)45.67±2.1138.56±1.8915.77±1.23

1052.34±2.5632.12±1.5415.54±1.11

5060.23±3.0125.45±1.3214.32±1.02

10068.78±3.5618.67±1.0512.55±0.98

(注：数据以均数士标准差表示，n=3)

从图3和表格数据可以看出随着IL-27浓度的增加，处于G1期的U937细胞比例逐渐升

高，而处于S期和G2/M期的细胞比例逐渐降低。对照组中，G1期细胞比例为45.67%,S

期细胞比例为38.56%,G2/M期细胞比例为15.77%。10ng/mLIL-27处理组的G1期细胞

比例升高至52.34%,S期组胞比例降低至32.12%,与对照组相比，G1期和S期细胞比例

差异具有统计学意义(Pv0.05),G2/M期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。50

里/17)1_11_-27处理组的61期细胞比例达到60.23%,S期细胞比例降低至25.45%,与对照

组相比，G1期和S期细胞比例差异具有高度统计学意义(P<0.01),G2/M期细胞比例差异

具有统计学意义(P<0.05)。100ng/mLIL-27处理组的G1期细胞比例高达68.78%,S

期细胞比例降低至18.67%,与对照组相比，G1期、S期和G2/M期细胞比例差异均具有极

显著统计学意义(P<0.001)。

单因素方差分析结果显示，IL-27浓度对U937细胞周期分布有显著影响(P<0.01)。LSD

-t检验两两比较表明，不同浓度IL-27处理组之间G1期、S期细胞比例差异均具有统计学

意义(P<0.05)。这表明IL-27能够显著影响U937细胞周期分布，使细胞阻滞在G1期，

抑制细胞从G1期向S期的转换。随着IL-27浓度的升高，这种细胞周期阻滞作用逐渐增

强。

为了进一步探究IL-27诱导U937细胞G1期阻滞的机制，利用蛋白质免疫印迹法(Western

blot)检测细胞周期相关蛋白p21和CyclinD1的表达。结果如图4所示，随着IL-27浓度

的增加，p21蛋白表达水平逐渐升高，CyclinD1蛋白表达水平逐渐降低。对照组中，p21蛋

白相对表达量为0.56±0.05,CyclinD1蛋白相对表达量为1.23±0.08。10ng/mLIL-27处理

组的P21蛋白相对表达量升高至0.78±0.07.CyclinD1蛋白相对表达量降低至1.05±0.06

与对照组相比，p21和CycInDI蛋白表达差异具有统计学意义(P<0.05)o50ng/mLIL-

27处理组的p21蛋白相对表达量达到1.02±0.09,CyclinD1蛋白相对表达量降低至

0.87±0.05,与对照组相比，p21和CyclinD1蛋白表达差异具有高度统计学意义

(P<0.01)。100ng/mLIL-27处理组的p21蛋白相对表达量高达1.35±0.11|,CyclinD1

蛋白相对表达量降低至0.65±0.04,与对照组相比，p21和CyclinD1蛋白表达差异具有极显

著统计学意义(PvO.001)o

P21是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，能够与细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶

复合物结合，抑制其活性，从而阻止细胞从G1期进入S期。CyclinD1是细胞周期蛋白家族

的重要成员，在G1期发挥关键作用，其表达水平的降低会影响细胞周期的正常进程“本研

究结果表明.IL-27可能诵i寸卜调p21霍白表土.同时丁调CyclinD1看白表认，诱导U937

细胞发生G1期阻滞，进而抑制细胞的增殖。这种对细胞周期的调控作用，为IL-27抑制急

性单核细胞白血病细胞生长提供了重要的作用机制。

4.4IL-27对U937细胞迁移能力的影响

采用Transwell小室检测不同浓度IL-27(0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL)处

理U937细胞48小时后的迁移能力，结果如表2和图5所示。

IL-27浓度（ng/mL）迁移细胞数量（个/视

野）

0（对照）256.33±12.56

10189.67±10.23

50125.3318.78

10076.67±6.54

(注：数据以均数士标准差表示，n=3)

从图5和表格数据可以看出随着IL-27浓度的增加，迁移到Transwell小室下室的U937

细胞数量逐渐减少。对照组迁移细胞数量为256.33±12.56个/视野，10ng/mLIL-27处理

组的迁移细胞数量降低至189.67±10.23个/视野，与对照组相比，差异具有统计学意义

(Pv0.05)050项m1_11,-27处埋组的迁移细胞数量进一步减少至125.33±8.78个/视野，

与对照组相比，差异具有高度统计学意义(P<0.01)。100ng/mLIL-27处理组的迁移细胞

数量仅为76.67±6.54个/视野，与对照组相比，差异具有极显著统计学意义(P<0.001)。

单因素方差分析结果显示，IL-27浓度对U937细胞迁移能力有显著影响(P<0.01)。LSD

-1检验两两比较表明，不同浓度IL-27处理组之间迁移细胞数量差异均具有统计学意义

(P<0.05)。这表明IL-27能够显著抑制U937细胞的迁移能力，且抑制作用呈浓度依赖

性。IL・27浓度越高，对U937细胞迁移能力的抑制作用越强。

为了进一步探究IL-27抑制U937细胞迁移的机制，利用蛋白质免疫印迹法(Westernblot)

检测迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达。MMP-2和MMP-9是基质金属蛋白酶家

族的重要成员，能够降解细胞外基质，在肿瘤细胞的迁移和侵袭过程中发挥关键作用。结果

如图6所示，随着IL-27浓度的增加，MMP-2和MMP-9蛋白表达水平逐渐降低。对照

组中，MMP-2蛋白相对表达量为1.56±0.11,MMP-9蛋白相对表达量为1.32±0.09。10

ng/mLIL-27处理组的MMP-2蛋白相对表达量降低至1.23±0.08,MMP-9蛋白相对表达

量降低至1.05±0.07,与对照组相比，MMP-2和MMP-9蛋白表达差异具有统计学意义

(P<0.05)。50ng/mLIL-27处理组的MMP-2蛋白相对表达量达到0.98±0.06,MMP-9

蛋白相对表达量降低至0.87±0.05,与对照组相比，MMP-2和MMP-9蛋白表达差异具有

高度统计学意义(P<0.01)。100ng/mLIL-27处理组的MMP-2蛋白相对表达量低至

0.65±0.04,MMP-9蛋白相对表达量降低至0.56±0.03,与对照组相比，MMP-2和MMP・

9蛋白表达差异具有极显著统计学意义(PvO.001)。

本研究结果表明，IL-27可能通过下调MMP-2和MMP-9蛋白的表达，抑制U937细胞对

细胞外基质的降解能力，从而阻碍细胞的迁移。这种对迁移相关蛋白的调节作用，为IL-27

抑制急性单核细胞白血病细胞的迁移提供了重要的作用机制。

4.5IL-27对U937细胞相关蛋白表达的影响

为了深入探究IL-27影响U937细胞凋亡和周期的分子机制，利用蛋白质免疫印迹法

(Westernblot)检测了凋亡相关蛋白Bax和Bel-2以及细胞周期相关蛋白p21和Cyclin

D1的表达。结果如图7所示，随着IL-27浓度的增加，Bax蛋白表达水平逐渐升高，Bel-

2蛋白表达水平逐渐降低。对照组中，Bax蛋白相对表达量为0.45±0.04,Bel-2蛋白相对表

达量为1.35±0.09。10式/|71口1,・27处理组的82*蛋白相对表达量升高至0.67±0表6,Bel-

2蛋白相对表达量降低至1.12±0.07,与对照组相比，Bax和Bel-2蛋白表达差异具有统计学

意义(Pv0.05)。50ng/mLIL-27处理组的Bax蛋白相对表达量达到0.98±0.08,Bel-2

蛋白相对表达量降低至0.89±0.06,与对照组相比，Bax和Bel-2蛋白表达差异具有高度统

计学意义(P<0.01)0100ng/mLIL-27处理组的Bax蛋白相对表达量高达1.32±0.10,

8。1-2蛋白相对表达量降低至0.65±0.04,与对照组相比，Bax和Bel-2蛋白表达差异具有

极显著统计学意义(P<0.001)。

Bax是一种促凋亡蛋白，能够促进细胞色素c从线粒体释放到细胞质中，进而激活caspase

家族蛋白，启动细胞凋亡程序。Bel-2是一种抗凋亡蛋白，能够抑制Bax的活性，阻止细胞

色素c的释放，从而抑制细胞凋亡。本研究结果表明，IL・27可能通过上调Bax蛋白表达，

同时下调Bel-2蛋白表达，破坏细胞内的凋亡平衡，