伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传脑动脉病动物模型的研究进展总结2026

伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传脑动脉病动物模型的研究进展总结2026伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传脑动脉病（CADASIL）是一种非动脉粥样硬化性、非淀粉样蛋白性、遗传性脑小血管病，由NOTCH3基因突变引起，多在中年发病。患者皮肤活组织检查中出现颗粒状嗜锇物质以及基因检测中发现NOTCH3基因突变即可确诊。然而，该病的发病机制尚未明确，治疗方案亦有限。主要原因在于，目前可用的临床前动物模型无法良好地复现该病的典型病理特征和临床表型。文中详细综述了近年来CADASIL动物模型的研究进展，总结了各模型的优缺点，以期为该病基础研究中动物模型的选择提供参考，并为未来的动物模型构建提供方向和指导。伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传脑动脉病（cerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleukoencephalopathy，CADASIL）是一种以NOTCH3基因突变为特征的常见单基因遗传性脑小血管病。其主要临床表现是先兆性偏头痛、短暂性脑缺血发作、缺血性卒中以及进行性认知功能障碍和精神症状［1,2,3］。CADASIL的病理特征表现为脑小动脉病变、大脑深部多发腔隙性梗死和广泛白质脱髓鞘，磁共振成像T2加权序列显示白质内高信号。血管病变主要包括动脉平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）变性、VSMC基底膜及周细胞内颗粒状嗜锇物质（granularosmiophilicmaterial，GOM）沉积以及VSMC膜上NOTCH3蛋白胞外段（NOTCH3extracellulardomain，NOTCH3ECD）聚集［4,5,6］。近些年来，为更好地模拟人类疾病表型，研究人员一直致力于开发和优化动物模型，为发病机制研究和治疗手段的开发提供有力工具。我们通过PubMed数据库使用“CADASIL”关键词检索发表时间为1995—2025年的相关文献；以及通过知网数据库检索“伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传脑动脉病”为关键词的近10年中文文献，进行文献复习和综述。本文旨在综述CADASIL动物模型的研究进展，分析不同模型的优势与局限性，探讨其在疾病基础研究中的应用价值，并为未来的动物模型构建提供方向和指导。一、基因敲除小鼠近年来多项研究结果表明，NOTCH3基因在调控血管发育中扮演重要角色。作为NOTCH信号通路的重要成员，该基因编码的跨膜受体蛋白在细胞分化调控中起重要作用［7］。研究发现，NOTCH3基因缺失（NOTCH3-/-）小鼠可以正常生存并具有繁殖能力，说明该基因对于胚胎发育与繁殖并非必需［8］，但NOTCH3-/-小鼠存在脑部大脑动脉环前方动脉不对称性、异常扩张及收缩等现象，表明NOTCH3在促进血管成熟中起着重要作用［9,10］。此外，与年龄相关的NOTCH3缺陷会引发血管功能的进行性下降，随后影响淋巴流动并最终导致神经退行性变［10］。NOTCH3在维持血管结构与功能方面亦具有重要作用。NOTCH3-/-小鼠的组织学分析结果显示，其远端肌动脉尤其是脑动脉存在显著的病理改变，包括脑动脉VSMC厚度较野生型小鼠显著降低，同时血管管径呈现扩张状态［9］。血流动力学检测结果显示，在血管腔内压力急性升高时，与野生型小鼠相比，NOTCH3-/-小鼠脑动脉的收缩反应性显著减弱，而对去甲肾上腺素、乙酰胆碱等血管活性药物诱导的舒缩反应差异无统计学意义［11］。此外，NOTCH3-/-小鼠的脑血流量自动调节能力下降。研究发现，与对照组相比，NOTCH3-/-小鼠大脑中动脉堵塞后更容易发生卒中，脑血流量下降幅度更大，脑梗死区域增加［12］，而VSMC中NOTCH3能有效减轻NOTCH3-/-小鼠因中风导致的损伤［12］。上述研究结果表明，NOTCH3通过调控VSMC的结构与功能，在维持脑血管完整性及脑血流稳态中发挥核心作用。因此，其功能缺失可能是缺血性脑卒中病理进程中的关键因素，为探索相关疾病的发病机制及开发靶向治疗策略提供了重要理论依据。虽然NOTCH3-/-小鼠模型能成功模拟CADASIL患者的部分病理改变，特别是在血管结构和功能方面。但是，该模型尚无法重现CADASIL的典型病理表型，如GOM沉积和脑白质病变。一方面，可能是因为人类和小鼠在NOTCH3信号传导和病理过程中存在物种差异性；另一方面，基因敲除小鼠是通过基因编辑技术让特定基因（如NOTCH3）完全或部分失去活性，进而导致相关基因无法正常发挥作用。而NOTCH3基因突变在CADASIL患者中的病理后果不能简单地用经典NOTCH信号通路的功能丧失或获得来解释。这表明VSMC中可能存在一种新的NOTCH3介导的信号通路，或者NOTCH3与其他信号通路的交叉调节可能对VSMC的存活起关键作用或者突变体NOTCH3可能在VSMC中获得新的或沉积蛋白的毒性作用［13］。所以，这类小鼠模型主要用于模拟目标基因缺失的情况，从而研究该基因在正常生理中的作用以及基因缺失后出现的疾病表现。二、基因敲入小鼠与基因敲除小鼠相比，基因敲入小鼠更适合用于CADASIL研究。基因敲入小鼠是把特定的致病基因突变位点引入细胞，在小鼠基因组特定位置精准插入外源基因或序列，构建出带有特定基因突变位点的小鼠模型。利用该模型，能进一步探究特定突变位点的生物学特性及其致病机制，对于CADASIL的发病机制研究至关重要。（一）Notch3R142C小鼠有研究发现，CADASIL相关的NOTCH3突变受体，在细胞内运输加工时出现异常，亦不能正常成熟，但与配体结合后，NOTCH3受体的细胞内信号转导功能却并未受到影响［14］。那么，NOTCH3突变导致VSMC变性、卒中和痴呆的具体机制究竟是怎样的呢？为了更好地模拟人类NOTCH3基因的p.Arg141Cys突变引发疾病的病理过程，研究团队将一段7kb的小鼠基因组DNA片段（编码NOTCH3受体N端区域）通过点突变引入R142C突变（CGA➝TGT），即把小鼠Notch3对应人类第141位精氨酸的第142位精氨酸残基替换为半胱氨酸残基，成功构建了携带p.Arg142Cys突变的CADASIL小鼠模型［15］。该研究团队发现，不论是纯合突变还是杂合突变，以上突变小鼠均能正常存活和繁育后代，这一结果与CADASIL患者的进行性血管病变和潜在的早期死亡率不一致。p.Arg142Cys突变小鼠的NOTCH3蛋白表达水平与野生型小鼠相似，表明R142C突变没有明显改变NOTCH3蛋白的表达水平。20月龄的p.Arg142Cys突变小鼠给予脑动脉、脑实质及神经影像学检查，并未发现CADASIL的典型病理改变（如GOM沉积、脑白质病变及腔隙性梗死等）。该小鼠模型中缺乏CADASIL表型的具体原因仍需要进一步探讨。以上研究结果表明，该突变在小鼠模型中不能完全复现人类CADASIL的病理表型，可能因为小鼠和人类在NOTCH3信号传导过程以及病理发生机制上，可能存在很大差异。（二）Notch3R170C小鼠与Notch3R140C小鼠不同的是，同样通过基因敲入技术构建的Notch3R170C小鼠模型为CADASIL的病理机制研究提供了重要工具［16］。该模型引入的基因突变是小鼠NOTCH3cDNA第567位核苷酸的CGT➝TGT点突变。此突变导致表皮生长因子重复序列4中第170位氨基酸由精氨酸（Arg）替换为半胱氨酸（Cys），对应人类中常见的Arg169CysCADASIL突变。在该模型小鼠中，NOTCH3基因表达水平正常，其生长发育、活力及生育能力也都表现正常。但是，该模型小鼠能够模拟CADASIL的迟发性动脉病特征。4月龄时，在小鼠脑动脉可以检测到NOTCH3ECD沉积［17］，20月龄时，电子显微镜下可见血管VSMC基底层和膜折叠处存在典型的GOM［16］。此外，脑和外周部位（如尾部）的动脉出现病变，包括GOM沉积、内皮下间隙与VSMC间隙扩大、多层内皮基底膜形成、VSMC和内皮细胞空泡化等。而且，对20~22月龄的突变小鼠做病理学检测（如苏木精-伊红染色和纤维蛋白原染色），发现其存在微出血、血管周围炎症浸润、血栓形成、纤维状神经胶质增生和微梗死等病理改变［16］。更重要的是，Notch3R170C突变小鼠还表现出运动缺陷和神经系统症状，13月龄时表现出运动衰退迹象，如步态蹒跚、肢体麻痹等［16］。最近的研究还发现，该模型小鼠脑动脉NOTCH3靶基因表达升高，管腔直径减小，这可能与血管病变进展有关［17］。该模型的优点是首次验证和分析了CADASIL的动脉病、组织病理学以及临床特征，很有希望成为CADASIL发病机制研究的重要工具。以上两种基因敲入小鼠的表型差异性，可能与NOTCH3致病性突变位点不同相关［17,18,19,20］。此外，蛋白稳定性与毒性效应差异也是重要影响因素，如R170C突变更易诱导NOTCH3蛋白异常聚集并激活未折叠蛋白反应，对血管内皮细胞和VSMC造成更显著损伤，而R142C突变引起的蛋白构象改变相对温和，毒性效应较弱，可能通过影响NOTCH3受体切割及下游信号通路激活等不同途径引发病理变化。三、转基因小鼠除了基因敲除小鼠、基因敲入小鼠外，转基因小鼠也是疾病相关体内研究中常用的动物模型，其构建策略是将外源目的基因随机插入小鼠基因组中，利用VSMC特异性启动子（例如小鼠SM22α或NOTCH3自身启动子）来实现突变基因在靶细胞中特异性表达。但是，由于外源基因是随机插入的，可能引发位置效应干扰实验结果，并且会使靶基因过表达，导致转基因小鼠呈现出更明显的表型。CADASIL转基因小鼠模型具备疾病表型显著的优势，使其在探究CADASIL关键病理机制和研究疾病早期阶段中发挥着不可替代的作用。目前，报道的已有6种CADASIL转基因小鼠，分别携带R90C［21］、R169C［22］、R182C［23］、C428S［24］、C455R和R1031C［25］NOTCH3基因突变，其分别对应CADASIL患者的p.Arg90Cys、p.Arg169Cys、p.Arg182Cys、p.Cys428Ser、p.Cys455Arg和p.Arg1031Cys等致病突变。以上模型在转基因策略和表达水平、内源性NOTCH3调控及突变功能影响等方面存在差异。其中，R169C转基因采用大鼠P1衍生的人工染色体（P1artificialchromosome，PAC）构建，精准覆盖NOTCH3基因组。R182C转基因则利用细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome，BAC）完整携带人类NOTCH3全长基因，二者的转基因表达模式接近内源性水平。其余模型多通过VSMC特异性SM22a启动子驱动NOTCH3cDNA。以上模型均能再现NOTCH3ECD积累或GOM沉积。但仅R169C（88系）模型出现病理性白质病变，R90C和R169C模型观察到脑血管功能障碍。值得注意的是，这些模型均不能模拟腔隙性梗死及运动缺陷等神经系统症状，提示其在全面模拟CADASIL病理特征上仍存在局限性。（一）TgNOTCH3R90C研究人员将含第90位密码子CGT>TGT突变的7021bp全长人类NOTCH3c编码DNA（codingDNA，cDNA）与2191bp的SM22a基因片段相连接，同时，在SM22a调控序列与NOTCH3序列之间插入牛β-珠蛋白内含子，多聚腺苷酸化信号源自SV40多聚腺苷酸［poly（A）］DNA，并克隆至3′端［21］。通过测序确认最终构建体，将纯化的DNA片段通过显微注射到C57BL/6/DBA2小鼠的受精卵中，将获得的第一代转基因小鼠与野生型C57BL/6小鼠回交，繁育后代。也用类似方法来产生表达人NOTCH3的转基因小鼠（TgNOTCH3WT）［26］。TgNOTCH3R90C转基因小鼠模型通过在VSMC中特异性表达携带Arg90Cys突变的人类NOTCH3蛋白，为研究CADASIL的发病机制提供了新的视角。该模型揭示了NOTCH3突变引起的VSMC变性的早期变化以及后期的血管病变过程。研究者通过血管变化时程分析，在10月龄小鼠中观察到VSMC对细胞外基质的锚定破坏、细胞骨架改变以及VSMC退变的迹象［21］。电子显微镜分析结果显示，TgNOTCH3R90C转基因小鼠直到14~16月龄才出现NOTCH3ECD和GOM沉积，此外，脑膜动脉、脑动脉以及外周动脉（尾动脉、肾动脉、颈动脉和股动脉）中均存在GOM沉积物，表明VSMC的退行性变早于NOTCH3ECD和GOM沉积［21］。在10~12月龄的突变小鼠尾动脉中，观察到VSMC和内皮细胞的超微结构变化，表现为内皮下间隙和VSMC细胞间隙的扩大以及VSMC中含有更多且更厚的致密斑块［21］。此外，还观察到VSMC变性的起始迹象，包括质膜的模糊和虫蛀外观、液泡或线粒体异常积累以及内皮细胞核固缩［21］。VSMC退化可导致小鼠脑血管反应性损伤、线粒体损伤、自噬减弱等病理表型［26,27］。但是NOTCH3ECD的蛋白活性没有明显变化，突变的受体仍能够与配体结合并启动下游信号通路［26］。以上发现提示CADASIL的发病机制可能并不涉及信号通路的破坏，而是与突变蛋白的异常功能获得相关。在6只17~20月龄的转基因小鼠中，除了1只出现脑梗死和神经胶质疤痕外，其余并未表现出明显的脑实质损害［21］。进一步研究发现，10~11月龄转基因小鼠的尾动脉被动直径、对去氧肾上腺素的收缩和对内皮依赖性乙酰胆碱的舒张均不受影响［28］。与野生型小鼠相比，Notch3R90C转基因小鼠动脉血流诱导的扩张显著减少，压力诱导的肌张力显著增加［28］。结果证明在表达CADASIL突变体NOTCH3的动脉中，血管对机械因素、流量和压力的反应性是早期出现并且是选择性受损的［28,29］。TgNOTCH3R90C小鼠模型不仅重现了CADASIL血管病变特征，还模拟了人类疾病早期临床症状及脑实质损伤，为研究CADASIL疾病进程和探索治疗方案提供了关键工具。研究结果证实，干细胞因子和粒细胞集落刺激因子联合治疗，可显著减轻该模型中VSMC变性和内皮细胞损伤，改善认知功能［30］，同时减少脑毛细血管血栓的形成［31］，并可缓解血栓诱导的缺血性神经元丢失［32］，为CADASIL治疗方案研究提供了新方向。（二）TgNOTCH3R169CJoutel等［22］通过筛选大鼠PAC文库，获得了包含大鼠基因组NOTCH3基因组的172kbPAC克隆RPCI31.78K09。随后，利用Yang等［33］提出的基于温度敏感型穿梭载体的同源重组系统，在大肠杆菌中对该克隆进行操作，特异性引入导致CADASIL的R169C氨基酸突变。经PCR及DNA测序等方法检测确认无误后，将经AscⅠ酶线性化的野生型和R169C突变型的170kbPAC构建体注射到FVB/N小鼠卵母细胞，最后得到转基因小鼠：包括1只表达大鼠野生型NOTCH3的TgNOTCH3WT（第129品系），以及2只表达R169C突变型NOTCH3的TgNOTCH3R169C（第88品系和第92品系）［22］。TgNOTCH3R169C转基因小鼠在1月龄时，NOTCH3的表达水平显著高于内源性表达，其中在TgNOTCH3R169C（第88品系）约为内源的4倍，而TgNOTCH3R169C（第92品系）中则增加了约2倍［22］。该模型能够良好地模拟CADASIL的主要病理过程：1~2月龄时，NOTCH3ECD开始在周细胞和VSMC周围聚集，导致周细胞数量减少、毛细血管覆盖率下降，进而引起血脑屏障开放和微血管功能障碍［34］。5月龄时，在小鼠软脑膜动脉中首次通过电镜检测到GOM沉积，10~12月龄时GOM已广泛分布于脑动脉和毛细血管；18~20月龄时，小鼠出现白质病变，表现为空泡形成、髓鞘丢失和纤维排列紊乱［22］。研究还发现，CADASIL早期白质病变首先影响髓鞘和内舌［35］，髓鞘内水肿是其早期显著特征［36］。该模型在11~12月龄小鼠灰质和18~20月龄小鼠白质中出现脑血流量下降，5月龄时小鼠脑血管自动调节功能受损，5~6月龄小鼠功能性充血减弱，同时表现出肌源性反应降低、脑动脉口径变窄和白质毛细血管密度显著减少［22］。行为学检测结果显示，12月龄TgNOTCH3R169C小鼠在水迷宫测试中存在空间学习能力障碍［37］。基于该模型，CADASIL在发病机制研究和治疗策略研究等方面已取得多项进展。首先，基于对CADASIL中动脉、静脉和毛细血管形态学病变的全面回顾，有研究推测小动脉和毛细血管周细胞损伤或缺陷似乎是该疾病发病机制的关键特征［38］。另有研究证明，周细胞是CADASIL小鼠中第一个受NOTCH3ECD聚集影响的细胞。周细胞病理导致血脑屏障开放和微血管功能障碍［27，38,39,40］。因此，保护周细胞可能代表了血管性痴呆的一种新型治疗策略［41］。减少组织金属蛋白酶抑制因子3或玻连蛋白的表达可以改善疾病表型［42］。干细胞因子联合粒细胞集落刺激因子能减少脑毛细血管血栓的形成［31］。以上发现为未来的治疗策略提供了基础依据。进一步地深入研究还发现，突变型NOTCH3ECD积累可能是导致VSMC丢失的主要原因［43］，提示降低NOTCH3水平可能是潜在治疗方向。此外，针对NOTCH3ECD的免疫疗法［44］、脑活素［45］等也被探索作为治疗新选择。尽管TgNOTCH3R169C小鼠模型为CADASIL研究提供了重要平台，但仍存在局限性，如无法复现腔隙性梗死及运动缺陷等神经系统异常，且基于该模型开发的治疗策略尚未在临床得到充分验证。（三）TgNOTCH3R182CRutten等［23］采用142.63kb的BAC克隆，其包含全长人NOTCH3基因，以及44kb上游序列和67kb下游序列，其中涵盖侧翼基因SYDE1、ILVBL、EPHX3及部分BRD4基因。随后，通过两步Red介导的重组技术［46］，在该BAC中引入c.544C>T（p.Arg182Cys）突变，并将构建体注射到C57BL/6JIco小鼠的受精卵中。为鉴定阳性转基因鼠，研究人员对小鼠耳组织分离的DNA进行PCR，并通过对PCR产物的Sanger测序分析，确认了突变的存在。最终获得5个转基因小鼠品系：1个携带野生型NOTCH3转基因（TgNOTCH3WT），4个携带突变型NOTCH3转基因（TgNOTCH3MUT）［23］。研究结果显示，与小鼠内源性NOTCH3的表达量相比，4个携带突变型NOTCH3p.Arg182Cys的转基因小鼠品系（TgNOTCH3MUT）中人类NOTCH3的表达量分别提高至内源性水平的100%、150%、200%和350%［23］。免疫组织化学分析结果显示，所有TgNOTCH3MUT品系小鼠的脑血管中均出现了NOTCH3蛋白的积聚，且不同品系小鼠中NOTCH3染色阳性的发病年龄存在显著差异。具体表现为，NOTCH3RNA的表达水平越高，NOTCH3蛋白的积累出现得越早，例如TgNOTCH3MUT350、TgNOTCH3MUT200、TgNOTCH3MUT150和TgNOTCH3MUT100小鼠脑血管中NOTCH3ECD开始积累的年龄分别是6周、3月龄、5月龄和12月龄［23］。随着年龄的增长，NOTCH3阳性免疫染色逐渐变得更加强烈和颗粒化，沉积物的数量和尺寸均有所增加［23］。此外，20月龄TgNOTCH3MUT350小鼠的心脏、肝脏、肾脏、皮肤和尾巴等脑外小动脉中也出现特征性颗粒状NOTCH3染色，但主动脉中未显示［23］。此外，在脑外小动脉中观察到的NOTCH3积累不如在大脑中明显。此外，在5~6月龄TgNOTCH3MUT350小鼠脑血管中首次发现特征性的GOM沉积［23］。然而，TgNOTCH3MUT350和TgNOTCH3MUT100小鼠的脑血流动力学和认知功能未见明显异常［47］。研究结果证实，NOTCH3蛋白质聚集体是CADASIL动脉病理学的主要驱动因素［48,49］，这种积累与年龄及NOTCH3表达水平显著相关。此外，研究人员开发了一种能够客观量化血管中NOTCH3蛋白的积累负荷的评分，即“NOTCH3评分”［23］。研究团队发现主动免疫疗法能减少CADASIL小鼠模型脑毛细血管中的NOTCH3ECD沉积［50］。由于该模型在反应NOTCH3蛋白积累方面表现良好，因此，非常适用于对旨在延缓或逆转NOTCH3蛋白积累的治疗策略进行量化和评估。不过，该模型无法复现人类CADASIL的全部病理特征，例如白质病变。因此在使用该模型开展基础研究时，需充分考虑其适用范围和局限性。（四）TgNOTCH3C428SNOTCH3ECD的表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor，EGFr）10-11区域在配体结合与信号传导中发挥关键作用［51］。研究结果证实，NOTCH3ECD的EGFr10-11区域作为该蛋白主要结构域，在介导DSL（Delta/Serrate/LAG-2）配体识别及下游信号级联激活过程中起重要作用［51］。体外研究结果表明，该区域发生的基因突变可能直接干扰受体-配体的结合效率，导致NOTCH3信号通路功能障碍［51］。为了进一步探究EGFr结构域突变的致病机制，研究人员采用类似构建TgNOTCH3R90C转基因小鼠的方法［21］，构建了表达具有C428S突变的人NOTCH3的转基因小鼠TgNOTCH3C428S。通过检测野生型和突变型转基因小鼠的脑动脉中人NOTCH3基因的表达水平，研究者发现野生型、转基因小鼠包含两个品系：46系以杂合子状态携带野生型转基因，46⁺系则以纯合子状态携带野生型转基因；突变型转基因小鼠为两个独立品系：2⁺系以杂合子状态携带突变型转基因，10系以纯合子状态携带突变型转基因［24］。TgNOTCH3C428S突变位点位于NOTCH3配体结合结构域EGFr10［24］。两个转基因品系与NOTCH3基因敲除小鼠进行交配产生的mNOTCH3-/-；TgNOTCH3C428S小鼠脑动脉表现出与NOTCH3敲除小鼠相似的缺陷，包括动脉扩张、弹性膜扁平及平滑肌细胞异常变薄；而mNOTCH3-/-；TgNOTCH3WT小鼠的脑动脉和平滑肌细胞在形态及超微结构上均呈野生型特征［24］。这些结果表明，C428S突变型人NOTCH3转基因无法挽救NOTCH3-/-小鼠的动脉缺陷。此外，研究发现该突变不仅自身无功能，还能抑制野生型NOTCH3的活性［24］。在NOTCH3+/+背景下，C428S突变会显著削弱NOTCH3与配体的结合能力，导致血管平滑肌细胞中NOTCH3信号传导异常，同时在电子显微镜下也观察到TgNOTCH3C428S小鼠脑动脉中存在GOM沉积［24］。该研究团队构建该转基因鼠的目的并非作为疾病模型，而在于验证不同EGFr结构域突变的致病机制，因此并未进行除GOM和血管病理外的其他方面的疾病相关表型分析及验证。这些研究结果提示，此转基因小鼠为理解NOTCH3信号在血管稳态中的作用及CADASIL的致病机制提供了重要工具。（五）TgNOTCH3R1031C和TgNOTCH3C455R研究人员构建了携带NOTCH3亚等位基因突变（C455R、R1031C）的小鼠模型：通过采用“多位点定向诱变”的技术，使用特异性引物在人源NOTCH3cDNA中分别引入C455R或R1031C突变，并分别克隆到靶向小鼠ROSA26基因座的载体中，最终的基因构建体里包含的NOTCH3的5′端带有loxP位点侧翼的终止盒（用于通过Cre重组酶调控表达），经测序验证后，将构建体通过电穿孔导入胚胎干细胞，再经过Southern印迹杂交筛选出阳性克隆后，将阳性胚胎干细胞注射到小鼠胚胎中获得嵌合体小鼠，再让其与其他品系小鼠交配，实现基因的种系传递，最终得到可以通过SM22a-Cre介导在血管平滑肌细胞中表达携带野生型［NOTCH3WT（76系）］［12］或突变型转基因小鼠（TgNOTCH3C455R和TgNOTCH3R1031C）［25］。为研究NOTCH3基因突变对VSMC功能障碍提供了重要模型［25］，这两个模型均表现出NOTCH3ECD异常聚集和GOM沉积，但因为突变位点差异呈现出不同的病理进程与分子表型［52］。突变位点位于EGFr26的TgNOTCH3R1031C小鼠，在12月龄时开始出现GOM沉积。而在NOTCH3配体结合结构域（EGFr11）发生突变的TgNOTCH3C455R小鼠，6月龄时血管内可见GOM沉积；200d龄时，视网膜动脉可见VSMC丢失现象。经血液学分析，该模型小鼠的胶原18α1链和高温需求丝氨酸蛋白酶A1的水平显著升高，同时伴随NOTCH3ECD含量的下降［53］。考虑到NOTCH3敲除小鼠对缺血性脑损伤非常敏感，这种表型可以通过在平滑肌细胞中表达野生型NOTCH3来挽救。进一步对不同亚等位基因突变在平滑肌细胞中表达时拯救NOTCH3敲除小鼠缺血易感性表型的能力进行评估，发现NOTCH3WT（76系）和TgNOTCH3R1031C转基因小鼠可减小梗死体积，有效挽救了卒中易感性表型［25］。但是TgNOTCH3C455R转基因小鼠则无法挽救该表型。此外，通过检测结合受体活性发现：C455R突变、R1031C突变削弱了NOTCH3与配体的结合能力［25］。这些发现不仅为理解缺血性脑小血管病的遗传机制提供了关键证据，还为靶向NOTCH信号通路的治疗策略奠定了基础。总的来说，不同转基因小鼠模型之间存在表型异质性的可能原因如下：（1）对转基因小鼠目的基因表达量难以定量的讨论。转基因小鼠存在目的基因的过表达，因此可能会存在由蛋白过量表达引起的“假疾病相关表型”。尽管有对照小鼠数据来尽量去除这一干扰，但受限于其繁育筛选手段本身不精确的局限性，很难保证对照小鼠与突变小鼠目的蛋白表达量绝对一致，因此这种蛋白过量表达对表型的干扰