CN112074293B 生产肺炎链球菌荚膜多糖载体蛋白缀合物的方法 （默沙东有限责任公司）

2020.10.29PCT/US2019/0290482019.04.25WO2019/212846EN2019.11.07US2018099039A1,2018.04.12US2012045479A1,2012.02.23US2016252300A1,201生产肺炎链球菌荚膜多糖载体蛋白缀合物描述了一种生产肺炎球菌荚膜多糖蛋白缀或多种活化的肺炎球菌多糖和载体蛋白分别冻分别重构，以及然后通过Tee混合将所述重构的清型的多糖的多种缀合物用于生产用于疫苗的含有缀合物的组合的多价肺炎球菌免疫原性组21.一种制备组合物的方法，所述组合物包含与载体蛋白共价连接的肺炎链球菌多糖，（b）分别在有机溶剂中重构所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物并混合，其中所述重构包括八分钟或更短时间和所述混合包括1其中第二均质溶液中所述载体蛋白的浓度为其中在通过Tee混合与包含多糖的第一均质溶液组合之前，将包含载体蛋白的第二均其中每种缀合物溶液包含以重量对重量计以0.6至1.3的多糖与载体蛋白的比率缀合2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种多糖是从选自以下的肺炎链球菌水的升华干燥方法制备所述第一干燥的组合物和所述第二干燥4.根据权利要求3所述的方法，其中所述升华干燥方法包括以饼或冻干球小珠形式冷5.根据权利要求3所述的方法，其中所述升华干燥是在选自以下的容器中进行批量干39.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物11.根据权利要求1所述的方法，其中所述重构包括小于五分钟和所述混合包括120分12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重构包括小于两分钟或更短时间和所述混13.根据权利要求1所述的方法，其中所述缀合物溶液包含小于所述溶液中总多糖的16.一种制备多价肺炎球菌缀合物疫苗的方法，所述多价肺炎球菌缀合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖（c）通过Tee混合将每种所述23种均质载体蛋白溶液与23种活化多糖均质溶液的一种其中所述23种混合物均不包含来自相同的肺炎链球4其中所述重构包括八分钟或更短时间和所述混合包括1其中第二均质溶液中所述载体蛋白的浓度为其中在通过Tee混合与包含多糖的第一均质溶液组合之前，将包含载体蛋白的第二均其中每种缀合物溶液包含以重量对重量计以0.6至1.3的多糖与载体蛋白的比率缀合17.一种制备多价肺炎球菌缀合物疫苗的方法，所述多价肺炎球菌缀合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖（c）通过Tee混合将每种所述15种均质载体蛋白溶液与15种活化多糖均质溶液的一种其中所述15种混合物均不包含来自相同的肺炎链球的所述多价肺炎球菌缀合物疫其中所述重构包括八分钟或更短时间和所述混合包括1其中第二均质溶液中所述载体蛋白的浓度为其中在通过Tee混合与包含多糖的第一均质溶液组合之前，将包含载体蛋白的第二均其中每种缀合物溶液包含以重量对重量计以0.6至1.3的多糖与载体蛋白的比率缀合18.一种制备多价肺炎球菌缀合物疫苗的方法，所述多价肺炎球菌缀合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖5多糖组合物包含来自选自（c）通过Tee混合将每种所述13种均质载体蛋白溶液与13种活化多糖均质溶液的一种其中所述13种混合物均不包含来自相同的肺炎链球的所述多价肺炎球菌缀合物疫苗；其中所述重构包括八分钟或更短时间和所述混合包括1其中第二均质溶液中所述载体蛋白的浓度为其中在通过Tee混合与包含多糖的第一均质溶液组合之前，将包含载体蛋白的第二均其中每种缀合物溶液包含以重量对重量计以0.6至1.3的多糖与载体蛋白的比率缀合19.一种制备多价肺炎球菌缀合物疫苗的方法，所述多价肺炎球菌缀合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖（c）通过Tee混合将每种所述10种均质载体蛋白溶液与10种活化多糖均质溶液的一种其中所述10种混合物均不包含来自相同的肺炎链球6的所述多价肺炎球菌缀合物疫苗；其中所述重构包括八分钟或更短时间和所述混合包括1其中第二均质溶液中所述载体蛋白的浓度为其中在通过Tee混合与包含多糖的第一均质溶液组合之前，将包含载体蛋白的第二均其中每种缀合物溶液包含以重量对重量计以0.6至1.3的多糖与载体蛋白的比率缀合7多糖和载体蛋白在有机溶剂中分别重构，以及然后通过Tee混合将所述重构的多糖和载体的多糖的多种缀合物用于生产用于疫苗的含有缀合物的组合的多价肺炎球菌免疫原性组炎的死亡率高达8神经系统后遗症高达25％。参见Arditi等，1998,Pediatrics102:多糖免疫原与载体蛋白的化学缀合可将婴儿的免疫应答转化为一种依赖T细胞的免疫应[0006]因此，已经开发了包含与载体蛋白缀合的细菌荚膜15种多糖的多糖_蛋白缀合物疫苗，并且正在开发其他疫苗。已开发的缀合物疫苗的实例包括乙型流感嗜血杆菌(例如，PREVNAR@和PREVNAR13e)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neis数的能力以及以所需溶液规格生产载体蛋白和多糖血清型供8[0009]本发明提供了一种生产用于肺炎球菌疫苗的多价肺炎球菌多糖蛋白缀合物的方[0010]本发明提供了(A)一种制备组合物的方法，所述组合物包含与载体蛋白共价连接[0011](a)提供第一干燥的组合物和第二干燥的组合物，所述第一干燥的组合物包含来[0012](b)分别在有机溶剂中重构所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物并混[0013](c)通过Tee混合将所述第一均质溶液与所述第二均质溶液组和[0015](a)提供第一干燥的组合物和第二干燥的组合物，所述第一干燥的组合物包含来[0016](b)分别在有机溶剂中重构所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物并混[0017](c)通过Tee混合将所述第一均质溶液与所述第二均质溶液组和[0019](a)提供第一干燥的组合物和第二干燥的组合物，所述第一干燥的组合物包含来[0020](b)分别在有机溶剂中重构所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物并混[0021](c)通过Tee混合将所述第一均质溶液与所述第二均质溶液组9和[0023]在所述方法的特定实施方式中，通过选自冻干和辐射能真空(REV)脱水的升华干燥方法制备所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物。在一个进一步的实施方式第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物分别具有约3％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物分别具有约2％或更低的第二水溶液包含载体蛋白和缓冲剂，其中所述第一水溶液和所述第二水[0026]在特定实施方式中，所述第一水溶液包含浓度为约6至9mg/mL的所述多糖和所述[0028]在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(b)中的所述重[0032]在特定实施方式中，所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的载体蛋白赖氨酸损失[0042](b)在升华干燥方法中分别干燥所述第一水溶液和所述第二水溶液，以生产第一[0043](c)通过向有机溶剂中添加所述干燥的组合物分别重构所述第一干燥的组合物和[0044](d)通过Tee混合将所述第一均质溶液与所述第二均质溶液组和[0046]在所述方法的特定实施方式中，所述升华干燥方法选自冻干和辐射能真空(REV)第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物分别具有约3％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物分别具有约2％或更低的[0049]在特定实施方式中，所述第一水溶液包含浓度为约6至9mg/mL的所述多糖和所述[0051]在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(c)中的所述重[0055]在特定实施方式中，所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的载体蛋白赖氨酸损失[0063]本发明还提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包[0065](i)两种或更多种第一水溶液，每种第一水溶液包含特定肺炎链球菌血清型的活[0068](c)在升华干燥方法中分别干燥所述两种或更多种第一水溶液和所述两种或更多种第二水溶液以生产两种或更多种第一干燥的组合物和两种或更多种第二干燥的组合物，[0069](d)在有机溶剂中分别重构每种所述两种或更多种第一干燥的组合物和每种所述种第二均质溶液，所述第一均质溶液各自独立地包含(i)特定肺炎链球菌血清型的多糖或[0072](g)将两种或更多种所述多种缀合物溶液组合，以生产包含两种或更多种缀合物[0073]在所述方法的特定实施方式中，通过将第一均质溶液与第二均质溶液分别进行与第二均质溶液分别进行Tee混合制备至少一种缀合物溶液，以生产多种缀合物溶液；或[0074]在所述方法的特定实施方式中，所述升华干燥方法选自冻干和辐射能真空(REV)第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物分别具有约3％或更低的最终水分含量。在特定实施方式中，所述第一干燥的组合物和所述第二干燥的组合物分别具有约2％或更低的[0077]在特定实施方式中，所述第一水溶液包含浓度为约6至9mg/mL的所述多糖和所述[0079]在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(d)中的所述重[0083]在特定实施方式中，所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的载体蛋白赖氨酸损失物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖[0092](a)提供23种干燥的载体蛋白组合物和23种干燥的活化多糖组合物，每种干燥的[0093](b)分别用有机溶剂重构所述23种干燥的载体蛋白组合物和所述23种干燥的活化[0094](c)通过Tee混合将每种所述23种均质载体蛋白溶液与23种活化多糖均质溶液的[0096](e)将所述23种缀合物溶液组合，以提供针对肺炎链球菌血清型[0097]本发明还包括一种制备针对肺炎链球菌血清型多糖[0098](a)提供15种干燥的载体蛋白组合物和15种干燥的活化多糖组合物，每种干燥的[0099](b)分别用有机溶剂重构所述15种干燥的载体蛋白组合物和所述15种干燥的活化[0100](c)通过Tee混合将每种所述15种均质载体蛋白溶液与15种活化多糖均质溶液的[0102](e)将所述15种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清的所述多价肺炎球菌缀合物合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖[0104](a)提供13种干燥的载体蛋白组合物和13种干燥的活化多糖组合物，每种干燥的活化多糖组合物包含来自选自[0105](b)分别用有机溶剂重构所述13种干燥的载体蛋白组合物和所述13种干燥的活化[0106](c)通过Tee混合将每种所述13种均质载体蛋白溶液与13种活化多糖均质溶液的[0108](e)将所述13种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清的所述多价肺炎球菌缀合物疫苗。合物疫苗含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清型多糖[0110](a)提供10种干燥的载体蛋白组合物和10种干燥的活化多糖组合物，每种干燥的活化多糖组合物包含来自选自[0111](b)分别用有机溶剂重构所述10种干燥的载体蛋白组合物和所述10种干燥的活化[0112](c)通过Tee混合将每种所述10种均质载体蛋白溶液与10种均质的活化多糖溶液[0114](e)将所述10种缀合物溶液组合，以提供含有与载体蛋白缀合的肺炎链球菌血清[0115]在特定实施方式中，每种所述干燥的载体蛋白组合物具有6％或更低的最终水分含量和每种所述干燥的多糖组合物具有约6％或更低式冷冻包含所述载体蛋白的每种水溶液和包含所述多的肺炎链球菌血清型的活化的肺炎链球菌多糖，每种载体蛋白溶液包含载体蛋白和缓冲其中所述升华干燥选自冻干和辐射能真空(R[0119]在特定实施方式中，所述多糖水溶液分别包含浓度为约6至9mg/mL的所述多糖和所述载体蛋白水溶液分别包含浓度为约6至12mg/mL的所述载体蛋白。在特定实施方式中，所述多糖水溶液分别包含浓度为约6或9mg/mL的所述多糖和所述载体蛋白水溶液分别包含[0121]在所述方法的特定实施方式中，在八分钟或更短时间内进行步骤(b)中的所述重[0125]在特定实施方式中，所述缀合物具有大于5(摩尔/摩尔)的载体蛋白赖氨酸损失[0129]图1显示了在将Pr溶液添加到Ps溶液的过程中，组分的结合以及对组分浓度多糖[0130]图2显示了在将Ps溶液添加到Pr溶液的过程中，组分的结合以及对组分浓度多糖[0131]图3显示了在将冻干的Ps添加到Pr溶液的过程中，组分的结合以及对组分浓度多[0132]图4显示了在将Pr溶液和Ps溶液同时添加至单独的缀合容器的过程中，组分的结[0133]图5显示了在无水DMSO中快速(两分钟)相比于慢速(八分钟)重构的CRM197的FTIR[0136]图8A和8B显示了以10m水)的DMSO中快速重构(两分钟)的CRM197[0138]图10显示了在无水DMSO中快速(两分钟)相比于慢速(八分钟)重构极干燥的冻干合物且不具有来自不同血清型的其他肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的方法或工艺，其中使用各种升华方法对肺炎球菌多糖和载体蛋白进行离散(或单独)冻冻干导致产生具有较少游离多糖(低于18％)的缀合物组合物，而如美国专利申请公开号通过将一种溶液添加到另一种溶液中或将干燥的物料溶解到溶液中而将两种溶液合并在DMSO)添加至干燥的载体蛋白中的时间长度以及在缀合之前重构载体蛋白随后贮存的时间长度影响载体蛋白的二级结构以及因此影响具有所需分子量和载体蛋白与同其缀合的多射(DLS)确定的，在快速添加条件下在有机溶剂(如无水以外的所有血清型均经过0.45微米过滤。除血清型19A以外的所有血清型被均质化以降低[0163]然后，在含蔗糖的水中稀释渗滤液2，以使得最终浓度为约4至12mg/mL多糖和[0164]使用5kDa切向流超滤膜，用2mM磷酸盐缓或更短时间的一段时间内将无水有机溶剂添加至干燥的载体蛋白中将干燥的载体蛋白重[0166]发明人还发现使用CRM197作为模型，基于傅立叶变换红外光谱(FTIR)和动态光散行。在特定实施方式中，将500mM磷酸钠缓冲剂(pH7.2)添加到包含载体蛋白的均质溶液[0167]通过Tee混合将载体蛋白的均质溶液和多糖或两种或更多种多糖的均质溶液合任何温度下进行，例如室温或4℃或18℃和23℃之间。在无水有机溶剂中重构或重新溶解于缀合过程中约0.5％溶液总水含量的目标量。使缀合溶液在血清型特异性温度下反应持加至缀合溶液中。硼氢化钠溶液的摩尔浓度基于添加硼氢化钠后缀合溶液中约1慢添加至含150mM氯化钠的溶液(含0.025％(w/v)聚山梨醇酯20的150mM氯化钠)中而在稀超滤膜，在2_8℃下使用高达约10个渗滤体积的150mM氯化钠或含25mM磷酸钾的150mM氯化率(UV_MALS_RI)确定来自超滤步骤3的渗滤液3中的多糖浓度。对于包含来自某些血清型[0172]在超滤步骤4中，可以将来自超滤步骤3的渗浓度，并使用300kDa切向流超滤膜，在2_8℃下使用20个渗滤体积的含10mML组氨酸的[0173]可以通过0.22微米过滤器对来自超滤步骤4的渗滤液4进行过滤以产生第二滤可以通过HPSECUV_MALS_RI确定第二滤液的多糖浓度。如果第二滤液的多糖浓度大于滤液的多糖浓度大于1.0g/L，则可以使用另外的在150mM氯化钠中的10mML组氨酸，准步骤(包括离心、沉淀和超滤)纯化各种多糖长的白喉棒状杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)菌株C7(β197)的培养物中分离得到CRM197使用PFENEXEXPRESSIONTECHNOLOGY(PfenexInc.,SanDiego,CA)制备荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)中的专利申请公开号WO93/17712和WO94/03208)、百日咳蛋白(参见国际专利申请公开号WO申请公开号WO91/01146)、包含多个来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(参见国际专利公开号WO00/61761)和鞭毛蛋白(参见GeneticallyEngineeredToxins,Ed:Frankel,MaecelDekkerInc,1992中描述的其他突Phe530和/或Lys534的突变以及在美国专利号5,917,017或美国专利号6,455,673中描述[0183]可以使用升华方法将含有特定肺炎链球菌血清型的多糖的组合物和含有载体蛋白的组合物分别干燥，以提供包含具有最终水分含量6％或更低的干燥的载体蛋白的组合物和包含具有最终水分含量约6％或更低的特定肺炎链球菌血清型的干燥的多糖的组合例如，EncyclopediaofAgriculture,Food,andBiologicalEngineering.Marcel如，US5656597；WO2013066769；WO2014093206；WO2015057540；WO2015057541或WO2015057548。[0185]在本发明的一个实施方式中，通过辐射能真空(REV)脱水(微波真空干燥)将水溶[0192]市售氰基硼氢化钠试剂批次中游离氰化物水平的变化可SIAB、或SIA、或SBAP)反应后获得的硫醚键偶联至载体。在国际专利申请公开号WO93/白反应以形成氨基甲酸酯键。该化学反应包括还原碳水化合物的端基末端以形成伯羟基，[0199]培养肺炎球菌的方法是本领域熟知的。参见，例如，Chase,1967,Methodsof[0200]代表存在的每种肺炎链球菌血清型的细胞库是从MerckCultureCollection(Rahway,NJ)的冷冻小瓶(vial)中获得的。将解冻的种子培养物转移至含有适合于肺炎链其目标浓度约为4g/L。然后，将溶液进行0.45微米过滤以降低生物负荷。通过HPSECUV_MALS_RI确定过滤的Ps溶液的Ps次)，以实现血清型特异性分子量。将尺寸减小的多糖进行0.2微米过滤，然后使用1[0210]通过基于每摩尔PnPs重复单元(RU)的高碘酸盐摩尔数向溶液中添加100mM偏高碘替10kDaNMWCO膜，通过保留酸水解产生的较低分子量Ps来提高Ps回收率。然后浓缩该溶[0215]使用5kDaNMWCO切向流超滤膜，用10倍渗滤体积通过如此前所述(参见国际专利申请公开号WO2012/173876)在荧光假单胞菌中表达获得在WFI中新鲜配制的30％w/v蔗糖溶液将UF2_FRPs溶液稀释至Ps浓度为6.0mg/v)蔗糖溶液将CRM197溶液稀释至蛋白浓度为6.0mg/mL。使用WFI和在W(w/v)蔗糖溶液将UF2_FRPs溶液稀释至Ps浓[0224]本实施例显示了如通过傅立叶变换红外光谱(FTIR)所测量的，CRM197在无水DMSO重构直至到达时间点。使用带有50mmCaF2窗口的透射模式，在受控温度(25℃)下，用[0226]使用快速添加(两分钟)在无水DMSO中重构冻干的CRM197显示出在1660cm_1处预计[0229]在4分钟内在DMSO(无水DMSO可以[0230]如存在分子间β_片层酰胺I峰所示(图6)，在中间时间(4分钟)在无水DMSO中重构控温度(25℃)下以1.996cP的粘度在制备的浓度下收集动态光散射(DLS)测DMSO为95％、97％、99％(v/v)的DMSO/水或无水DMSO。无水DMSO可以是Sigma_AldrichD2438_50mL。通过每30秒添加适当体积的DMSO进行重构直至到达时间点。使用带有50mmAldrich的无水DMSO，D2438_50mL)，在两分钟或八分钟期内将冻干的CMR197重构至终浓度10mg/mL。通过每30秒添加适当体积的DMS的CRM197。降低冻干的CRM197中的水分含量不会降低分子间β_片层对重构时间的敏感性(图[0245]有几种方法可以将缀合组分(Ps和Pr)组合在一起。图1_4详细介绍了几种组合策添加至Pr溶液(图2)中时，添加至含有其他组分的溶液中的组分和其他组分的浓度均随时和液体界面处的Ps浓度和Ps:Pr比率开始较高(在Ps的溶解度极限)，然后随着多糖的溶解时转移的其他模式相比，使用泵将小室中的两个组分组合在一起(Tee混合)可提供高水平期间约0.5％溶液总水含量的目标值。使溶液在血清型特异性温度下反应持续血清型特异[0252]制备硼氢化钠在WFI中的溶液，并将2.0meq的[0254]然后，通过将溶液缓慢加入150mM氯化钠(针对在一些实施方式中的缀合物，为150mM氯化钠加0.025％w/v聚山梨醇酯20)中，将缀合溶液稀释至20％或更低(v/v)无水添加到溶液中，使得最终浓度为25mM磷酸钾。可以通过总Ps和CRM197的消耗，缀合物Ps与10个渗滤体积的150mM氯化钠或含25mM磷酸钾的150mM氯化钠进行渗滤。这产生了超滤3工用20倍渗滤体积的含10mML_组氨酸的150mM氯化钠(pH7.0)进行渗滤。血清型7F使用并使用300kDaNMWCOBiomaxPES切向流超滤膜，在2_8℃下使用在150mM氯化钠中的10mM和23FUF3_FR溶液浓缩至约2.0g/L，并使用300kDaNMWCOUltraCel再生纤维素切向流超HPSECUV_MALS_RI确定滤液的PS浓度。如果滤液的Ps浓度大于1.0g/L，则使用另外的在[0262]当CRM197在无水DMSO中缓慢重构(八分钟)并且随后缀合至6B多糖时，缀合后存在用带有50mmCaF2窗口的透射模式，在受控温度用Omic软件(ThermoFisher)对数[0264]使用已在DMSO中缓慢重构的CRM197制备的CRM197_6B缀合物(图11)显示了分片层形成的证据，表明即使重构后仍存在CRM197聚集体。使用已快速重构的CRM197制备的[0266]该实施例显示了用于在无水DMSO中使用还原胺化将来自血清型197[0267]通过在两分钟内将无水DMSO快速添加到干燥的CRM197中，在无水DMSO中重构如此前所述制备的干燥的CRM197，并且分别将Ps单独在无水DMSO中重构，以制备Pr和Ps均质溶[0272]将血清型19F孵育约5天，使用300kDaNMWCO切向流超滤膜在约4℃下在含10mM组[0273]使用300kDaNMWCO切向流超滤膜在约4℃下在含10mM组氨酸的150mM氯化钠(pH[0274]使用另外的含10mML组氨酸的150mM氯化钠(p[0276]该实施例显示了具有不同表面活性剂和稳定剂的15价肺炎球菌缀合物疫苗的制以含有或不含丙二醇(PG)和聚乙二醇400(PEG400)。在各种处方中研究了两种浓度的缀合[0280]APA是羟基磷酸铝的水性混悬液。APA是通过将氯化铝和磷酸钠以1:1的体积比混[0282]在该实施例中，通过REV离散地冻干如上文所讨论的制备的6B多糖(Ps)和CRM197[0286]使用HPSEC/UV/MALS/RI测定进行缀合物的分子量和浓度分析。将缀合物样品进的变化(以mL/g计)。样品的平均分SantaBarbara,CA)使用整个样品峰上测得的浓度和光散