DB37T-花生品种纯度鉴定技术规程-SSR标记法

DB××/T××××—××××前言 II1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14原理 25仪器设备 26试剂 27溶液配制 28引物信息 29操作步骤 29.1样品准备 29.2单粒种子的DNA提取 29.3PCR扩增 39.4PCR产物检测 310判定方法与原则 410.1判定方法 410.2判定原则 4附录A（规范性附录）溶液配制 5附录B（资料性附录）推荐引物 7附录C（资料性附录）参照品种名单 9前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化委员会归口。本标准起草单位：山东省花生研究所。本标准主要起草人：单世华、闫彩霞、赵小波、李春娟、王娟、苑翠玲、孙全喜、宋秀霞。花生品种纯度鉴定技术规程-SSR标记法范围本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeat，SSR）标记法进行花生（ArachishypogaeaL.）品种鉴定的原理、仪器设备及试剂、操作步骤、判定方法与原则。本标准适用于试验样品为种子的花生品种的纯度鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。品种纯度Varietypurity品种在SSR标记带型上典型一致的程度，反映鉴定品种的特征特性。简单重复序列Simplesequencerepeat（SSR）由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其多态性主要来源于串联数目的不同。推荐引物Recommendedprimer根据最少引物区分最多品种的原则，筛选出多态性高，条带清晰、重复性好的一套SSR引物。参照品种Referencevariety具有推荐SSR位点上不同等位变异的花生品种，用于辅助确定送检样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。原理不同花生品种由于遗传组成不同，基因组中重复单位的数目存在差异，造成了品种间的多态性。可根据其两端的高度保守序列设计特异引物，通过PCR扩增及电泳检测，从而鉴定花生品种的纯度。仪器设备高压灭菌锅（105℃～136℃，最大工作压力0.22MPa）；凝胶自动扫描仪（400百万像素）；高速冷冻离心机（最大离心力不小于15000g）；PCR扩增仪（0℃～100℃）；紫外分光光度计（波长190nm～1100nm）；恒温水浴锅（室温～99℃）；水平摇床（0rpm～230rpm）；微波炉（耐温120℃）；电子天平（最小显示0.01g）；电泳槽（样品通量1.0mm厚）；磁力搅拌器（0r/min～2500r/min，室温～100℃）；酸度计（-2.00～20.000pH）；微量移液器（2µl、10µl、100µl、200µl、500µl和1000µl）。试剂乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na2）；三羟基甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠（NaCl）；硼酸（Borate）；丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；四甲基乙二胺（TEMED）；无水乙醇；过硫酸铵（APS）；硝酸银（AgNO3）；琼脂糖；6×loadingbuffer；GoldView染料；RNAase（10ug•µL-1）；酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）；异丙醇；四硼酸钠；甲醛；2×FrementsMix；SSR引物（10μmol•L-1）；20bpDNALadder；重蒸水或符合GB/T6682规定的一级水。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。溶液配制相关溶液配制方法见附录A。引物信息推荐引物的序列信息与等位变异见附录B。操作步骤样品准备鉴定样品的分样和保存，应符合GB/T3543.2的规定。随机取100粒花生种子，取其父母本材料各10份，另取参照品种（见附录C）各2粒。水培法种植，至第三片真叶长出后备用。单粒种子的DNA提取DNA提取取单株幼苗的根、茎、叶等器官50mg，放入1.5mL离心管中，液氮研磨。CTAB法提取基因组DNA，加入100µl1×TE（pH8.0）溶液溶解DNA。完全溶解后每管加入5µlRNAase，37℃温育1h，－20℃保存留用。DNA浓度和质量检测测定DNA溶液的OD260/OD280值，确保在1.7～2.0范围内。测定其OD260的吸光度，以1个OD260值相当于50mg•L-1DNA浓度来计算纯化DNA的浓度。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，GoldView染料进行染色。稀释至工作浓度为30ng•μL-1，置于4℃备用。PCR扩增反应体系总体系为10μL，包括1.5μLDNA，1.9μL水，5μL2×FrementsMix，0.8μLF/R引物，混匀。反应程序95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环；72℃延伸5min；4℃保存备用。PCR产物检测非变性聚丙烯酰胺凝胶制备玻璃板组装清洗玻璃板和52齿梳，晾干；用95%乙醇擦凹板和平板，两板间插入1.0mm厚的边条，对齐，夹紧，凹板朝上，水平放置，用水平仪调平。灌胶在小烧杯中加入7.5mL6%聚丙烯酰胺凝胶溶液、37mL水，然后加500μL10%APS及20μLTEMED，轻轻摇匀，防止产生气泡；迅速灌胶，将梳子齿朝外，轻轻插入胶中，至凹板玻璃面约0.8cm处，静置1h。电泳检测玻璃板组装将制好的胶板固定于垂直电泳槽上，凹板向内。上下槽中各加入1×TBE缓冲液，至下槽液面约为槽高的1/3，上槽液面高于凹板玻璃面约1cm。清洗胶孔拔去梳子，冲洗胶孔，赶走底层气泡和杂质。上样在10μLPCR产物中加入2μL6×loadingbuffer，用微量移液器上样，每孔加入2μLPCR扩增产物；同时，在两侧样品孔中加入20bpDNALadder分子量标记。电泳电压为200V，根据指示剂位置调整时间，至青蓝色的二甲苯青指示剂到达胶板的2/3处，停止电泳，电泳时间约2h。银染显色水洗电泳结束后，分开两块玻璃板取出凝胶，用水漂洗10s～20s，重复2次。银染转移至400mL0.1%AgNO3溶液中，在摇床上轻摇10min。水洗从染色液中取出，在水中快速漂洗2次，时长8s～10s。显影转移至400mL显色液中，在摇床上轻摇至带纹清晰，用水冲洗至溶液澄清。成像将凝胶置于凝胶成像工作台，选用透射UV光，调节focus至图像最清晰，保存。判定方法与原则判定方法每个SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表示，利用凝胶分析软件Quantityone读取条带。比较每份样品在每个位点的等位变异，统计带型。用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如式1： (SEQ标准自动公式\*ARABIC1)判定原则如差异位点数=0，则说明该品种纯度为100%，判定为“单一品种”；如差异位点数=1，判定为“姊妹系”或“基本稳定品种”；如差异位点数≥2，则判定为“混合样品”。

（规范性附录）

溶液配制DNA提取试剂1mol•L-1NaOH4gNaOH，加水定容至100mL。1mol•L-1Tris-Cl（pH8.0）溶液称取121.1gTris，加水定容至1L，浓盐酸调至pH8.0，高压灭菌备用。0.5mol•L-1EDTA（pH8.0）溶液称取186.1gEDTA-Na2，800mL水，加热定容至1L，1mol•L-1NaOH调至pH8.0，高压灭菌备用。1×TE1mL1mol•L-1Tris-HCl（pH8.0），0.2mL0.5mol•L-1EDTA（pH8.0），加水定容至100mL。DNA提取液4gCTAB，16.364gNaCl，20mL1mol•L-1Tris-Cl（pH8.0），8mL0.5mol•L-1EDTA（pH8.0），加水定容至200mL，4℃条件下保存。使用前加入2%的巯基乙醇，实验前预热至65℃。聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂70%乙醇700mL无水乙醇，加水定容至1L。10×TBE缓冲液分别称取108g三羟基氨基甲烷，55g硼酸，加入800mL水加热溶解，再加入0.5mol•L-1EDTA（pH8.0）溶液37mL，加水定容至1L。1×TBE缓冲液100mL10×TBE，加水定容至1L。10%APS0.5gAPS溶于5mL水中。6%聚丙烯酰胺凝胶溶液（29:1）分别称取58g丙烯酰胺，2g甲叉双丙烯酰胺，100mL10×TBE，加水定容至1L，4℃条件下保存。染色液称取1g硝酸银，加水定容至1L。显色液6gNaOH，0.2g四硼酸钠，1.6mL甲醛，加水定容至400mL。

（资料性附录）

推荐引物推荐引物见表B.1。推荐引物序号引物连锁群引物序列（5′→3′）常见等位变异bp参照品种8GM1996B03F-catcccatcattttccctcttR-tacagtgaaggtgggatcctg77zh.h503477/92zh.h247785zh.h532787zh.h139589zh.h276492zh.h24059GM2638A04F-atgctctcagttcttgcctgaR-cagacataacagtcagtttcacc45zh.h168955zh.h270257zh.h238463zh.h474965zh.h532769zh.h225069/73zh.h184373zh.h094910GNB317未定位F-gaaaagcttgcaaaatcgagaR-tccttccatgttggtgaatg188zh.h2550194zh.h0540197zh.h2561200zh.h2405203zh.h2764212zh.h5034224zh.h2462227zh.h0537230zh.h474911GNB357未定位F-aggtttgctttgggatgatgR-ccgataaaaccaggcaagaa191zh.h5034191/203zh.h0436194zh.h1602197zh.h2406203zh.h0537215zh.h0861218zh.h1331表B.1推荐引物（续）序号引物连锁群引物序列（5′→3′）常见等位变异bp参照品种12GNB556A01F-tcagggtgggttaccaacatR-taatccacattgaaccgacg56zh.h052556/71zh.h532762zh.h093468zh.h241371zh.h241077zh.h086880zh.h223186zh.h133113PM308未定位F-ccttcttctttctcctcctcaR-caattcgtgatagtattttattggaca64zh.h503474zh.h474978zh.h097780zh.h276482zh.h246486zh.h240592zh.h068014pPGPseq2C11A03F-tgacctcaattttggggaagR-gccactattcatcgcggta385zh.h2456403zh.h2764418zh.h4749439zh.h2405450zh.h2406461zh.h043615pPGSseq19D6B05F-tttgttatgctcacaccccaR-aaaaatgaagcaatattttgttgttag180zh.h4779180/192zh.h5327192zh.h2406192/204zh.h2152200zh.h2508204zh.h0537210zh.h5034

（资料性附录）

参照品种名单参照品种名单见表C.1参照品种名单序号种质库统一编号品种名称序号种质库统一编号品种名称1zh.h0099赣榆小站秧38zh.h2292浒山半旱种2zh.h0102启东赤豆花生39zh.h2330全州凤凰花生3zh.h0125涡阳站秧40zh.h2384英德白沙鸡豆仔4zh.h0436蒲庙花生41zh.h2405试花1号5zh.h0477睦屋拔豆42zh.h2406试花3号6zh.h0525锦交1号43zh.h2410博山站秧子7zh.h0531滕县滕子花生44zh.h2413沂南小麻叶8zh.h0537巨野小花生45zh.h2425嘉祥长秧9zh.h0540栖霞爬蔓小花生46zh.h2426沂南大铺秧10zh.h0678托克逊小花生47zh.h2456郑72-511zh.h0680北京大粒墩48zh.h2461长垣一把抓12zh.h0764昆嵛大粒墩49zh.h2462濮阳83713zh.h0861反修1号50zh.h2464濮阳二糙14zh.h0868栖霞半糠皮51zh.h2466王屋花生15zh.h0930莱芜蔓52zh.h2477开封大拖秧16zh.h0934夏津小二秧53zh.h2499南江大花生17zh.h0949牟平大粒蔓54zh.h2508南溪二郎子18zh.h0977汶上蔓生55zh.h