实验常用仪器学课件

实验常用仪器学

基础医学与医学技术学院

钱晖

20131仪器重要性/课程重要性实验操作离不开仪器；样品制备与仪器、实验结果密切相关；仪器的错误操作影响实验结果；正确的分析仪器结果有助于准确结论的获得；2仪器使用要点掌握操作流程规范操作，保存实验结果正确分析评价结果维护与保养3课程内容主要仪器的介绍（用途，操作流程，注意事项，维护保养等）考试类别:笔试/仪器操作4主要仪器离心机系列（低速，高速，超速离心机）PCR仪系列（普通，定量，梯度PCR仪等）化学凝胶成像系统流式细胞仪液相芯片分析系统（Luminex200)显微镜系列（荧光倒置显微镜，正置显微镜）分光光度计

……5流式细胞仪（422室）6

BDFACSCalibur型Flowcytomter,FCM

对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。7流式细胞仪的应用

1、免疫表型分析（细胞）2、DNA含量及细胞周期分析3、定量分析4、细胞功能分析5、细胞凋亡研究……8小动物活体成像（420室）9小动物活体成像10

超速离心机（1101）

（OptimaL-90K

BeckmanCoulter）转速≥30000r/min离心力：20000-100000g11荧光定量PCR仪Roter6000CFX9612荧光定量PCR仪

是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过参照基因或标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

13qPCR应用（定量）基因工程研究领域

1）基因表达研究

2）转基因安全检测

3）单核苷酸多态性(SNP)及突变分析医学研究领域

1）病原体检测

2）肿瘤研究

3）免疫组份分析14液体闪烁计数仪15液体闪烁计数仪

(liquidscintillationcounter)

使用液体闪烁体(闪烁液)接受射线并转换成荧光光子的放射性计量仪。主要测定发生β核衰变的放射性核素，尤其对低能β更为有效。

主要利用3H、14C、32P等放射性核素进行体内或体外标记，研究细胞生物体内核酸、蛋白质等生物大分子的合成与降解代谢及其转化途径。16荧光倒置显微镜

Nikon，Ti-S

可对培养瓶或培养皿内细胞进行显微观察。

17NIS-ELEMENTS

18常用仪器介绍

移液器；

离心机；

细胞培养相关仪器（超净工作台，生物安全柜，CO2培养箱，超低温冰箱，液氮罐，高压灭菌锅等）；

PCR仪，定量PCR仪；

化学凝胶成像系统；

分光光度计；

显微镜，荧光倒置显微镜；

流式细胞仪；

液相芯片分析系统19（一）移液器（微量取液）工作原理：

活塞通过弹簧的伸缩运动实现吸液和放液。含内置活塞，依靠推动空气进行吸液和放液。20移液器规范操作步骤第一步－设定移液体积

选取合适移液器（量程范围），调整按钮至所需体积的刻度。21第一步：设定移液体积从大量程调节至小量程，精度最佳从小量程调节至大量程，最好先调至略大一点，再返回大体积至小体积小体积至大体积旋转刻度调节旋钮严格的精确调节方法22移液器规范操作步骤第一步－设定移液体积第二步－装配移液器吸头垂直插入吸头，左右微微转动，上紧。23第二步：装配移液器吸头轻取吸头，左右转动24第三步－吸取液体垂直吸液；吸头尖端需浸入液面3mm以下；缓慢吸液；高精度吸液，可先用样液预润吸头内壁2－3次25正向吸液规范的移液操作方法

一档二档26规范的移液操作方法反向吸液

二档一档27常见的不正确操作方式特别提示：不能将已经装配了含有液体的吸头平放！28第四步－放液

完全打出，吸头尖靠内壁，排出最后的液滴；按钮待液体完全打出后再放松

血清和粘性液体的吸液和放液速度都要保持缓慢

移取易挥发液体可以先在液体里反复吹打3-5次,使液面和活塞之间的空气柱充满饱和的液体分子,再进行移取!29移液不准确的原因用大量程的移液器移取小体积的液体；装配吸头时气密性不好，吸头不匹配；吸取的液体具有强挥发性；液体的密度与水有明显差异；吸液速度和放液速度太快；30

吸取液体，垂直静置5秒，观察是否有液滴流出；自我检测漏气：31移液器的日常维护及保养移液器外部和零部件的清洁方法

肥皂水去污，60％异丙醇擦洗清洁，蒸馏水冲洗，凉干。移液器的下半部可自行拆卸，零部件可清洗。移液器长期不使用时，将刻度调整至最大值。32需要自我保养的部位活塞在清洁或拆卸后要用硅脂涂抹上一层；多道移液器的的O型环也需要经常涂抹硅脂，然后用软布轻拭，如果有损坏，要更换；移液器内部被液体污染，可自行部分拆卸清洗；33移液器的拆卸与装配单道移液器专用改锥多道移液器专用改锥34移液器的灭菌121°C，1bar，20分钟，灭菌完毕后，在室温下完全晾干后再装上。10mL的移液器中的滤芯只能灭菌一次，灭菌后略微有膨胀，但不影响功能。可以暴露于UV射线下。可灭菌的移液器方可操作。35如何去除移液器上的DNA污染？？清洗液的配制：10xbuffer30.6gNaCl39.2gGlycine500mLdistilledwater1NHCladdtototal1000ml1xbuffer95℃30minRinsewithdistilledwaterDryat60℃Lubricantandassemble36

严格的移液器校准环境单独操作空间；恒温、恒湿的操作环境；台面防震、防尘、无阳光直射；0.00001g天平；防蒸发装置；双蒸水，每4h更换，批次更换周期不大于2周。移液器校准37Eppendorf离心机的正确使用和保养(二）离心机38离心机原理离心机是利用离心力（rcf）对混合液（含有固形物）进行分离和沉淀的一种专用仪器。

当离心力和物质沉淀所需向心力的合力为零时，离心工作结束。39离心机介绍转速（rpm）：每分钟转头的转数角速度（

）：每秒钟转过的弧度数离心机最高转速：标在离心机上的最高转速；转头最高转速：标在转头上的最高转速；注意：同一转头在不同型号离心机上最高转速有可能是不同的。40离心力与相对离心力离心力（F）：取决于转头角速度和颗粒距离心轴的距离；相对离心力（RCF）：是离心力与重力的比值；G：重力加速度41相对离心力与转速的换算：

r建议用最小半径或平均半径，单位为mm。注意：计算相对离心力可用公式、查表、曲线、作图、离心机的软件。42德国Heraeus各种离心机43德国eppendorf

44德国eppendorf

45美国Thermo46选择水平离心还是固定角度离心？47转子的种类48固定角转离心特点优点：速度高，离心力大选择角转时请注意角转的角度离心沉淀附着在底部的程度不同49水平转子优点：容量大，沉淀聚集在底部，可以离心各种离心管和板。缺点：速度低50刹车！刹车！快速刹车可以减少离心时间！缺点:可能会带来沉淀或分层重悬！51安全注意事项52离心机的正确使用和保养离心机与离心机之间至少间隔30厘米,以防干扰离心机散热离心机远离水槽或其他潮湿的装置离心过程当中不要试图打开离心机盖--当然,也不可能打开!53离心机的正确使用和保养操作中经常会忽视的问题离心前确认转子的最大重量负载信息确认离心管的性能及规格爱护转子，不要划伤离心机用完后，保持机盖打开状态（尤其冷冻离心机）转子和转子盖必须旋紧才可以离心54配平

对称摆放离心管,并平衡重量角转-对称摆放水平转子重量一致，管子的规格相同。排列的方式要中心对称55离心机的清洁温热中性溶液擦洗注意轴缝的污物，内腔壁及转子孔及时清洁可以延长使用寿命!56离心机日常清洁与保养--每日必做

每次离心后注意清洁舱体和转子；打开离心机盖子过夜；立即用中性剂或软抹布擦拭溅出液体；高危样品离心:使用者有责任及时清洁和消毒处理！57Eppendorf离心机紧急开盖方法5859606162

超速离心机（1101）

（OptimaL-90K

BeckmanCoulter）63超速离心机操作步骤

１.接通电源，打开离心机盖。

２.按要求装配好离心管。

３.按要求安装离心转头。

４.关上离心机盖。

５.输入离心数据，编辑离心程序。

６.抽真空，并开始运行程序。

７.程序结束后，去真空。

８.打开离心机盖，取出转头。

９.取出离心管并进行分析。64离心管的选用玻璃离心管绝对不能在高、超速离心机上使用。PA管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。PP管：化学性能稳定，半透明，能耐高温消毒。PC管：透明度好，硬度大，能耐高温消毒。但不耐强酸强碱及某些有机溶剂。主要用于5万(转/分)以上离心。CN管：质地较软，透明，但不耐强酸强碱及某些有机溶剂，不能高压消毒。适合于蔗糖、甘油等密度梯度离心。应透明，利于收集。

65对称平衡的重要性当离心转速达1－5万（转/分）时，如对称管相差1克，转头半径5厘米，则离心力公式F=m×RCF

查表得：1万（转/分）RCF=6000代入公式F=1×6000=6(公斤)

5万（转/分）RCF=150000代入公式F=1×150000=150(公斤)

此时引起两边不平衡可达6－150(公斤)，这对离心机的损伤是很大的，至少将缩短离心机的使用寿命。66超速离心机使用注意事项如离心管盖子密封性差液体就不能加满（针对高速离心且使用角度头），以防外溢。

外溢后果：污染转头和离心腔，影响感应器正常工作。超速离心时，液体一定要加满离心管，应超离时需抽真空，只有加满才能避免离心管变形。使用角度头时别忘盖转头盖！如未盖，离心腔内会产生很大的涡流阻力和摩擦升温，这等于给离心机的电机和制冷机增加了额外负担，影响离心机的使用寿命。67保养注意事项清洁离心机腔体和转头，并擦干腔内冷凝水。使用完后要打开门，直至腔内恢复常温。应经常检查转头及实验用离心管是否有裂纹、老化等现象，如有应及时更换；

68（三）细胞培养相关仪器超净工作台生物安全柜高压灭菌锅CO2培养箱超低温冰箱液氮罐69（1）超净工作台70超净台

超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。71

超净工作台可除去大于0.3μm的尘埃、真菌和细菌孢子等等。

超净空气的流速为24～30m/min，这已足够防止附近空气可能袭扰而引起的污染，也不会妨碍酒精灯等对器械的灼烧消毒。72使用工作台时，应提前30分钟开机，处理操作区内表面积累的微生物，开启紫外灭菌灯；20分钟后关闭灭菌灯，启动风机；实验结束后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15分钟。操作区内不允许存放不必要的物品，保持工作区的洁净气流流型不受干扰；操作区内尽量避免作用明显扰乱气流流型的动作；操作区的使用温度不可以超过60℃。

超净台操作规程

73根据环境的洁净程度，可定期（一般2～3个月）将粗滤布（涤纶无纺布）拆下清洗或给予更换；定期（一般为一周）对环境周围进行灭菌工作，同时经常用纱布蘸酒精或丙酮等有机溶剂将紫外线杀菌灯表面擦干净，保持表面清洁，否则会影响杀菌效果；当加大风机电压已不能使风速达到0.32m/s时必须更换高效空气过滤器。切忌用酒精或丙酮等有机溶剂擦拭有机玻璃面。超净台维护规程及维护方法

74（2）生物安全柜安全柜可分为一级、二级和三级（手套柜）三大类

75生物安全柜操作规程在出现溅洒、破碎、方法不当的情况下，安全柜无法保护操作人员。

安全柜只有在工作正常时才能使用。柜内放置的仪器和材料必须保持在最低数量。静压箱后部的空气循环不得受阻。将材料放入安全柜的工作区之前，应对其表面进行去污处理。柜内不得使用酒精灯，因其产生的热会干扰气流并可能损坏过滤器。可以使用红外灭菌灯。

柜内所有的工作要在工作面的中部或后部进行。

操作手不应将手臂来回伸进出柜子，以免干扰气流。前送风格栅不得被便签、滴管、或其他材料堵住，否则会干扰气流从而可能使材料受到污染，使人员处在暴露状态。

在每次工作完成后及一天结束时，使用合适的消毒剂清洁安全柜的表面。

柜子的风扇在工作开始前和工作完成后要再各运行5分钟。76生物安全柜的维护

每日维护

1)用70%的酒精（其他杀菌剂视用户使用的材料而定）彻底对安全柜内部工作区域表面、侧壁、后壁、窗户进行表面净化。不要用含有氯的杀菌剂，因为它可能对安全柜的不锈钢结构造成损坏。也要对紫外灯和电源输出口表面进行清洁。注意：当清洁安全柜内部区域时，操作人员除了手放以外，身体的其他任何部位不能进入安全柜

2)检查警报并检测基本气流

77每周维护

1)用70%的酒精（其他杀菌剂视使用的材料而定）彻底对排水槽进行清洗

2)检查俘获纸孔处的残留物质每月维护

1)用湿布对安全柜外部表面进行擦拭，尤其是安全柜的前面和上部，把堆积的灰尘打扫干净。

2)检查所有的维护配件的合理使用情况。

3)上述每日工作中的条目生物安全柜的维护

78每季维护

1)检查安全柜的任何物理异常或故障。检查荧光显像管确保它们工作正常

2)当不锈钢上表面有难以去除的斑点时，可以使用MEK(methyl-ethyl-ketone)。使用WEK后，快速用清水和液体清洁剂冲洗不锈钢板，并且用聚亚安酯布或者海绵进行擦拭。定期清洁不锈钢表面会使之保持表面的光滑美观。每年维护

1)具备资格的认证技术人员对安全柜进行性能认证。

2)更换紫外灯

3)上述的每季维护生物安全柜的维护

79注意个人防护（防护服，手套，根据需要带防护眼罩或者面罩等）。开机5分钟内不可操作，安全柜要自净的过程；操作时尽量缓缓移动手臂，安全柜的摆放位置尽量远离走道，避免气流波动；操作样品时分洁净区、操作区、污染区分开摆放物品；柜内尽量避免震动仪器（例如离心机、旋涡振荡器等）的使用，因为震动会使得积留在滤膜上的颗粒物质抖落，导致操作室内部洁净度降低，同时如果在前操作面平衡失败还会引起安全柜对操作者的污染。物品不要挡住负压通道，以免造成气流混乱；明火可造成生物安全柜的气流紊乱，干扰气流模式；如果有污物流入积液槽要及时进行清理；每天实验结束后，对生物安全柜的内壁和台面进行擦拭，等待5分钟后，关闭前窗，关灯，关风机，紫外灯照射30分钟后关闭系统电源。合理定期维护。生物安全柜使用注意事项80（3）高压灭菌锅利用电热丝加热水产生蒸汽，并能维持一定压力的装置。81高压灭菌锅高压灭菌锅使用前要去离子水加到水位线；将需灭菌的培养基、蒸馏水或其它器皿放入灭菌锅内，关闭锅盖，检查排气阀、安全阀状态；打开电源，检查参数设置是否正确，然后按下“work”键，灭菌锅开始工作；自动派冷气，到105℃时，底部排气阀门自动关闭，然后压力开始上升；压力升至0.15MPa（121℃）时，灭菌锅再次自动放气，然后开始记时，一般培养基灭菌20min，蒸馏水灭菌30min；达到规定的灭菌时间后，关闭电源，打开放气阀缓慢放气；当压力指针降至0.00MPa时，放气阀无蒸汽排除时，方可开启锅盖。82高压灭菌锅注意事项

汽未放尽前，不得开启高压锅；如果灭菌后的培养基在锅内不及时拿出，需在蒸汽放尽后将锅盖打开，切忌将培养基封闭在锅内过夜。压力表指针在0.05MPa以上时，不能过快放汽，以防止压力急速下降，液体滚沸，从培养容器中溢出。操作过程，请注意安全，小心烫伤。要杜绝一切不安全的因素。83

（4）CO2培养箱84CO2培养箱CO2培养箱一般设定的条件为37℃，5％CO2

。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净，定期消毒；③箱内蒸馏水槽中加灭菌蒸馏水以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。85CO2培养箱的维护与清洗污染和生锈的原因：

&外部空气不洁净（高温，高湿，人流量大等）

&箱门长时间开启；

&使用脏器具，脏橡胶手套，脏手直接触碰；&洒出的液体未被立即清洗干净；

&未充分擦拭；&添补加湿水而不是将其替换；

&冷凝；86CO2培养箱的基本维护

&关闭电源；&移除内部组件（搁架，加湿盘，背部导管，风扇等）