HE染色标准化操作流程-从组织处理到质量控制的完整指南

HE染色标准化操作流程——从组织处理到质量控制的完整指南在HE染色过程中，你有没有碰到这样的情况：水洗的过程中，切片脱落了？最后染出的片子“瓦蓝瓦蓝”的，根本没有一点点红？这也许不是你的手艺退步了，而是没有注意到室温、二甲苯使用次数、分化时间这些细节。HE（苏木精-伊红）染色是组织学和病理学的基础核心实验。操作流程看起来也就那么几步，但是每一个参数都有精准把控。本文将从样本组织处理到结果检测的10个关键步骤拆开讲清楚，方便我们对照操作，少踩几个坑。一、样本处理为后续染色做好铺垫

1.1取材和固定取材与固定是HE染色的第一步，也是很关键的一步。新鲜组织离体后，建议立即放入10%中性福尔马林中固定，固定液体积建议是组织块的5-10倍。组织块大小要适中，一般为1.0*1.0*0.5cm3左右。通常来说，小标本固定4-6h就足够，大标本则需要18-24h，甚至更长。但其实，固定不足或过度都会有问题。固定不足会导致细胞自溶、结构破坏、细胞核收缩。固定过度则会让组织酸化，影响染色效果。如果固定时间不小心过长，可用自来水冲洗，或者放在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，中和一下酸性，这样能保证细胞核正常着色。

1.2脱水与透明脱水与透明过程，需要严格遵循溶液梯度原则。组织经梯度酒精（70%-100%）脱水，逐步去掉组织中的水分。每个梯度停留时间可以根据组织大小调整，一般各停留30-60min即可。脱水不彻底的话，后续石蜡就很难均匀渗透，切片时容易造成碎裂。脱水完成后，把组织块浸泡在二甲苯中，一般浸泡2次，每次30min。要是冬季室温低于14℃，二甲苯的脱蜡能力就会下降，这时候可以把二甲苯缸适当加温到30℃，或者直接更换新鲜的二甲苯，这样可以保证脱水效果。

1.3浸蜡与包埋石蜡温度建议控制在56-58℃。组织块要在熔化的石蜡中充分浸透，可以间隔1-2h换一次石蜡，确保浸透均匀。把组织块转移到已倒入熔化石蜡的模具中，在烘箱中放30min，让组织块内的石蜡与包埋用的石蜡互溶。然后对组织块进行立样，确保包埋面满足实验需求，如皮肤组织建议垂直于表皮包埋，管腔器官建议横切包埋。之后将模具放在室温下，让石蜡完全冷却凝固。取出石蜡块并做好标记就可以了。请注意：包埋时蜡温过高，可能会导致组织收缩变硬，进而影响切片质量。二、切片制备需要一点实操技巧理想的切片应完整无缺、无皱褶、无刀痕，厚薄均匀一致，和载玻片贴合紧密，没有气泡。切片厚度一般建议控制在3-5μm。其中，肿瘤、活检标本建议3μm，这样便于观察细胞核细节。淋巴、神经、结缔组织可适当加厚，4-5μm就比较合适。切片如果过厚（>6μm），容易出现染色不均、细胞重叠的情况，影响后续的结果观察。烤片是防止脱片的关键环节，需要引起重视。切片贴附在载玻片上后，可在65℃烘箱中烘烤2h，也可以在60-65℃烤片机上烤1-2h。烤片温度过低或时间不足，脱蜡时切片可能会脱落，或者脱蜡不彻底。温度过高或时间过长，则可能引起细胞焦缩或组织焦化，影响染色结果。三、染色核心步骤精准把控细节很重要

3.1

脱蜡水化这一步建议严格执行，不要随意缩短或延长时间。切片依次浸入二甲苯（2-3次，每次10-15min）、无水乙醇（2次，每次5min）、95%酒精、70%酒精各5min，最后用蒸馏水浸洗。脱蜡不充分是染色失败的常见原因，容易导致着色不均，或者出现白色斑点。义翘神州经过多年实践，对这一步骤进行了优化。优化后的步骤是：两次二甲苯，每次15min，无水乙醇2min，95%酒精2min，80%酒精2min，70%酒精2min。大家可以尝试一下这个操作流程。

3.2

苏木精染色染色时间可以根据室温、染液浓度、pH值及组织类型灵活调整，通常在1-10min之间。如果是新鲜配制的苏木精，或氧化不足、过度氧化的苏木精，着色力会比较弱，这时候就可以适当延长染色时间。要是室温低于20℃，着色能力也会下降，需要延长染色时间，或者稍微加热染液。

3.3分化与返蓝

分化与返蓝是让核质分明的关键步骤，建议仔细操作。用0.5%-1%盐酸酒精分化数秒至10s，期间快速提拉2-5次，目的是去除细胞质中非特异性吸附的苏木精，让细胞核染色清晰，而细胞质基本无色。分化时可在显微镜下观察，过度分化容易导致核染色过浅。分化完成后，立即用流水冲洗，再用0.2%氨水或碳酸锂溶液返蓝15-30s，让细胞核从红色变成蓝色。当然，用自来水浸洗也能实现返蓝，只是需要的时间更长些，大概约10-30min。

3.4

伊红染色把切片浸入伊红染液中染色1-3min，之后快速水洗两次就可以。这里要注意，伊红染色时间不是固定的，可以根据组织类型、大小、切片厚度进行调整。一般上皮或黏膜组织需要染色30s-2min，结缔或肌肉组织则需要1-3min。染色的质量标准大概是这样的：胞质呈粉红色、胶原呈淡粉色、红细胞呈鲜红色，整体对比柔和，不会刺眼。

3.5

脱水、封片用梯度乙醇进行脱水，浓度从70%逐步提高到无水乙醇。低浓度乙醇的浸泡时间要短一些，防止伊红过度褪色。高浓度乙醇的浸泡时间要充足，确保脱水彻底。可以参考这样的操作流程：70%乙醇10-20s，80%乙醇10-20s，95%乙醇1-2min，无水乙醇2-3min。时间仅供参考，可根据实验室的具体情况进行调整。脱水后用二甲苯透明，浸泡2次，每次2-3min。理想的结果是，切片完全透明、无白雾、不浑浊。如果切片不透明，封片后容易发雾，影响观察。最后滴加中性树胶进行封片，覆盖盖玻片时要注意避免产生气泡。片子放在室温下，干燥后就可以长期保存了。一张合格的HE染色切片，需要满足以下要求：维度要求组织结构完整、无龟裂、无刀痕褶皱、无污染黑点细胞核均匀蓝/蓝紫色，核膜、核仁清晰细胞质粉红至淡红，红细胞鲜红，胶原纤维淡染，层次分明背景干净透亮、无蓝色沉淀、无伊红深染、无白雾一致性同批次、同组织染色深浅偏差≤1级

源自参考文献：AmethodforutilizingautomatedmachinelearningforhistopathologicalclassificationoftestisbasedonJohnsenscores四、常见问题与处理如果染色不均呈雾化状态，大多是因为冬季室温低，二甲苯脱蜡不彻底导致的。解决方法是将二甲苯加温至30℃，或者更换新的二甲苯。切片出现白色斑点，通常是烤片不足或脱蜡时间不够造成的，这是可以考虑重新烤片，或者延长脱蜡时间。但是，如果切片放入二甲苯后呈白色雾状，建议退回无水乙醇重新脱水，否则封片后容易褪色。细胞核染色过浅，可能是苏木素氧化失效，或者分化过度导致的，建议更换染液或者适当减少分化时间。伊红染色过淡的话，可以检查一下染液的pH值，用冰醋酸调节至4.6-5.0左右，大概率会有所改善。另外，在染色过程中不要让切片干燥，否则容易导致切片收缩、变形，影响组织的形态。最后封片时要避免产生气泡。要是有气泡，可轻轻加压驱除，或者退回二甲苯中取下盖玻片，重新进行封固。HE染色操作控制要点，可以参考以下内容：要素控制关键苏木精每染色200张切片后需更换，或2-4周更换一次伊红每染色100张更换，或1-2周更换一次分化液现用现配或每周更换二甲苯每周至少更换1次环境与安全温度：18-25℃，在通风橱操作，二甲苯、乙醇需防护附录：HE染色主要试剂配制（供参考）苏木精染液配制1）Harris苏木精配方：苏木精1g、硫酸铝钾15g、无水乙醇10ml、蒸馏水200ml、氧化汞0.5g、冰醋酸5ml（每100ml染液）。步骤：先用200ml蒸馏水加热溶解硫酸铝钾。再用10ml无水乙醇溶解苏木精，然后倒入之前配好的硫酸铝钾溶液中，煮沸1-2min。稍微冷却后，缓慢加入氧化汞（可以先把氧化汞溶于10ml水中），继续加热，直到染液变成紫红色，冷却后过滤。使用前每100ml染液中加入5ml冰醋酸。特点：着色力强，染色时间短，适合常规石蜡切片使用。2）Mayer苏木精配方：苏木精2g、无水乙醇40ml、硫酸铝钾100g、蒸馏水600ml、碘酸钠400mg。步骤：先将苏木精溶于40ml无水乙醇。用600ml蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，然后将苏木精乙醇溶液倒进去，煮沸2min。最后用蒸馏水补足至600ml，加入碘酸钠，混匀后过滤。特点：属于进行性染色，理论上不需要分化，但适当深染后再分化，效果会更好。3）Gill苏木精配方：苏木精2g、无水乙醇250ml、硫酸铝钾17g、蒸馏水750ml、碘酸钠0.2g、冰醋酸20ml。步骤：先把苏木精溶于250ml无水乙醇。再用750ml蒸馏水溶解硫酸铝钾。然后将两种溶液混合，加入碘酸钠，待溶液变为紫红色后加入冰醋酸，加蒸馏水定容至1000ml，混匀后过滤。特点：半氧化进行性苏木精，不容易产生沉淀，染色效果比较稳定。伊红染液配制1）水溶性伊红配方：伊红0.5-1g、蒸馏水100ml、冰醋酸1滴。步骤：将伊红溶于蒸馏水，用玻棒搅起泡沫后过滤，每100ml加冰醋酸1滴。2）醇溶性伊红配方：伊红0.5-1g、90-95%酒精100ml、冰醋酸、1滴特点：染色后不经水洗，直接用8