饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

ICS65.120

ccsB46

团体标准

T/SXSL00x-2021

饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物

残留量的测定

液相色谱-串联质谱法

DeterminationofNitroimidazoleDrugsandTheirMetabolite

ResiduesinFeed

Liquidchromatography-tandemmassspectrometry

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

陕西省饲料协会发布

饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定

液相色谱-串联质谱法

1范围

本文件规定了饲料中地美硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、罗硝唑、奥硝唑、卡硝唑、

替硝唑、4-硝基咪唑、羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟甲基甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟

基异丙硝唑的液相色谱-质谱法测定方法。

本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中地美硝唑、异丙硝唑、

甲硝唑、塞克硝唑、罗硝唑、奥硝唑、卡硝唑、替硝唑、4-硝基咪唑、羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、

羟甲基甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑含量的测定。

本文件中地美硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、罗硝唑、奥硝唑、卡硝唑、替硝唑、4-

硝基咪唑、羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟甲基甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑

的检出限为1.0ug/kg，定量限为3.0ug/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引

用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T20195动物饲料试样的制备

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中的硝基咪唑类药物用乙酸乙酯提取，经MCX固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联

质谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。

5试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

5.1水：GB/T6682，一级。

5.2乙睛：色谱纯。

5.3甲醇：色谱纯。

5.4乙酸乙酯：色谱纯。

5.5正己烷：色谱纯。

5.6氨水。

5.7甲酸：色谱纯。

5.80.2%甲酸溶液：移取2mL甲酸于1000mL容量瓶中，用水稀释定容，混匀。

5.90.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸于1000mL容量瓶中，用水稀释定容，混匀。

5.105%氨化甲醇溶液：移取5mL氨水于100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，混匀。

5.11标准品：地美硝唑（CAS:551-92-8，纯度均≥98%）、异丙硝唑（CAS:14885-29-1，纯度

均≥98%）、甲硝唑（CAS:443-48-1，纯度均≥98%）、塞克硝唑（CAS:3366-95-8，纯度均≥98%）、

罗硝唑（CAS:7681-76-7，纯度均≥98%）、奥硝唑（CAS:16773-42-5，纯度均≥98%）、卡硝唑

（CAS:42116-76-7，纯度均≥98%）、替硝唑（CAS:19387-91-8，纯度均≥98%）、4-硝基咪唑

（CAS:3034-38-6，纯度均≥98%）、羟基甲硝唑（CAS:4812-40-2，纯度均≥98%）、2-甲硝咪

唑（CAS:696-23-1，纯度均≥98%）、羟甲基甲硝咪唑（CAS:936-05-0，纯度均≥98%）、氯甲

硝咪唑（CAS:4897-25-0，纯度均≥98%）、苯硝咪唑（CAS:94-52-0，纯度均≥98%）、羟基异

丙硝唑（CAS:35175-14-5，纯度均≥98%）。

5.12硝基咪唑类药物标准储备液(1mg/mL)：准确称取15种硝基咪唑类药物标准品(5.11)各10

mg(精确到0.0001g)分别于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释定容，混匀。贮存于棕色试

剂瓶中，于-18℃以下保存，有效期为6个月。

5.13硝基咪唑类药物混合标准溶液(10ug/mL)准确移取15种硝基咪唑类药物的标准储备液

（5.12）各0.1mL于10mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，混匀。贮存于棕色试剂瓶中，于-18℃

保存，有效期为3个月。

5.14硝基咪唑类药物混合标准系列溶液:准确移取适量硝基咪唑类药物混合标准溶液(5.13)

于10mL容量瓶中，用乙腈稀释定容配制成浓度为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、

40ng/mL的标准工作液。临用现配。

5.15MCX固相萃取小柱：规格为200mg/6mL，或者性能相当者。

5.16微孔滤膜：0.22μm，有机系。

6仪器设备

6.1液相色谱-质谱仪（配有电喷雾电离源）。

6.2分析天平：感量0.001g和0.1mg。

6.3涡旋混合器。

6.4振荡器。

6.5离心机：转速≥10000r/min。

6.6固相萃取装置。

6.7氮吹仪。

7样品

按照GB/T20195的规定制备样品，粉碎后过0.42mm孔径分析筛，混匀，装入大磨口瓶中备

用。选取与待测样品类型相同，均匀一致，且在待测物保留时间处仪器响应面积小于方法定量限

30%的饲料样品，作为空白样品。

8试验步骤

8.1提取

称取试样2g（精确至0.0001g）于50mL离心管中，准确加入10mL乙酸乙酯，涡旋1min，

超声提取10min，冷却至室温，于8000r/min离心5min，上清液转入另一支洁净的离心管中，残

渣用10mL乙酸乙酯复提取一次，合并提取液，于40℃氮吹干，加入3mL0.2%甲酸溶液（5.8）

溶解后，再加入3mL正己烷，涡旋1min，弃去上层正己烷，下层溶液待净化。

8.2净化

MCX固相小柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，将提取液全部过柱，使其流速不大于1mL/min，

用3mL水淋洗，抽干1min，加入3mL5%的氨化甲醇溶液洗脱（5.10），收集洗脱液于40℃氮气

吹干，准确加入1mL乙腈溶解，涡旋混匀。过膜（5.16）后待测。

8.3基质匹配标准系列溶液

称取基质空白样品6份，按照8.1~8.2步骤操作处理至40℃氮气吹干，分别准确加入1mL

混合标准系列溶液（4.12），配制成浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、

40ng/mL的基质匹配标准系列溶液，混匀。过膜（5.16）后待测。

8.4测定

8.4.1液相色谱参考条件

色谱柱：C18柱，柱长50mm，内径2.1mm，填料粒径1.9µm。或性能相当者。

流动相：A相：0.1%甲酸溶液（4.10）；B相：乙腈（4.2），洗脱条件见表1。

流速：0.2mL/min。

柱温：40℃。

进样量：2μL。

表1梯度洗脱条件

时间（min）A相(%)B相(%)

0.09010

.01.09010

5.01090

7.01090

7.19010

109010

8.4.2质谱参考条件

电离方式：电喷雾离子源（ESI）；

检测方式：多反应监测（MRM）

毛细管电压：3.5kV；

离子源温度：150℃；

脱溶剂温度：350℃；

硝基咪唑类药物的多反应监测（MRM）离子对、锥孔电压及碰撞能量见表2。

表2硝基咪唑类药物的定性离子对、定量离子对及质谱条件

定性离子对定量离子对碰撞能量

被测物名称

m/zm/zV

114.1>68.117

4-硝基咪唑114.1>68.1

114.1>97.116

128.1>42.231

2-甲硝咪唑128.1>42.2

128.1>82.117

142.1>81.125

地美硝唑142.1>81.1

142.1>96.115

158.1>55.217

羟甲基甲硝咪唑158.1>55.2

158.1>140.116

162.1>116.117

氯甲硝咪唑162.1>116.1

162.1>145.115

164.1>91.135

苯硝咪唑164.1>91.1

164.1>118.120

异丙硝唑170.1>109.1170.1>109.124

170.1>124.117

172.1>82.124

甲硝唑172.1>82.1

172.1>128.114

186.1>128.113

塞克硝唑186.1>128.1

186.1>168.110

186.1>128.113

羟基异丙硝唑186.1>128.1

186.1>168.110

188.1>123.111

羟基甲硝唑188.1>123.1

188.1>126.116

201.1>110.116

罗硝唑201.1>110.1

201.1>140.110

220.1>82.127

奥硝唑220.1>82.1

220.1>128.115

245.1>75.129

卡硝唑245.1>75.1

245.1>118.110

248.1>121.115

替硝唑248.1>121.1

248.1>128.120

8.4.3基质匹配标准系列溶液和试样溶液的测定

在仪器最佳工作条件下，分别取基质匹配标准系列溶液（8.3）和试样溶液（8.2）上机行测

定。基质匹配标准系列溶液中硝基咪唑类药物的选择离子色谱图参见附录A。

8.4.4定性

每一个化合物选择1个母离子和2个子离子，在相同试验条件下，试样溶液中待测化合物与

基质匹配标准系列溶液中对应化合物的保留时间偏差在±2.5%之内，且待测化合物定性离子的相

对丰度与基质匹配标准系列溶液中浓度接近对应化合物定性离的相对丰度比较，若偏差不超过表

3规定的范围时，则可判定样品中存在对应的化合物。

表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

单位为%

相对离子丰度＞5020～5010～20≤10

允许的最大偏差±20±25±30±50

8.4.5定量

以基质匹配标准系列溶液中化合物的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘工作曲线，相关

系数应不小于0.99。试样溶液中待测物化合物的响应值均在基质匹配标准曲线的线性范围之内。

若超过线性范围，需用乙腈对试样溶液和基质匹配标准溶液做相应稀释后，重新测定。单点校准

时，试样溶液中待测化合物面积响应与基质匹配标准系列溶液中对应化合物面积响应差异应在

±30%之内。

9试验数据处理

试样中硝基咪唑类药物的含量w以质量分数计，单位为毫克每千克（mg/kg），多点校准按

公式（1）计算；单点校准按公式（2）计算。

VV2

wiin……（1）

V1m1000

式中：

p——由基质匹配曲线查得的试样溶液中硝基咪唑类药物的质量浓度，单位为纳克每毫升

（ng/mL）；

V——提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；

V1——净化时所用试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；

V2——氮气吹干后复溶液的体积，单位为毫升（mL）；

m——试样质量，单位为克（g）；

n——稀释倍数。

AsVV2

wiiin………（2）

AsV1m1000

式中：

A——试样溶液中硝基咪唑类药物的色谱峰面积；

As——基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物的峰面积；

ρs——基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V——试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；

V1——净化时所用试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；

V2——氮气吹干后复溶液的体积，单位为毫升（mL）；

m——试样质量，单位为克（g）；

n——稀释倍数。

测定结果用平行测定的算数平均值表示，保留3位有效数字。

10精密度

在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的10%。

前言

本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第一部分：标准化文件的的结构和起草规则》

的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本标准由陕西饲料协会提出并归口。

本标准起草单位：

本标准主要起草人：

本标准为首次发布。

饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定

液相色谱-串联质谱法

1范围

本文件规定了饲料中地美硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、罗硝唑、奥硝唑、卡硝唑、

替硝唑、4-硝基咪唑、羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟甲基甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟

基异丙硝唑的液相色谱-质谱法测定方法。

本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中地美硝唑、异丙硝唑、

甲硝唑、塞克硝唑、罗硝唑、奥硝唑、卡硝唑、替硝唑、4-硝基咪唑、羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、

羟甲基甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑含量的测定。

本文件中地美硝唑、异丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、罗硝唑、奥硝唑、卡硝唑、替硝唑、4-

硝基咪唑、羟基甲硝唑、2-甲硝咪唑、羟甲基甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、羟基异丙硝唑

的检出限为1.0ug/kg，定量限为3.0ug/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引

用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T20195动物饲料试样的制备

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中的硝基咪唑类药物用乙酸乙酯提取，经MCX固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联

质谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。

5试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

5.1水：GB/T6682，一级。

5.2乙睛：色谱纯。

5.3甲醇：色谱纯。

5.4乙酸乙酯：色谱纯。

5.5正己烷：色谱纯。

5.6氨水。

5.7甲酸：色谱纯。

5.80.2%甲酸溶液：移取2mL甲酸于1000mL容量瓶中，用水稀释定容，混匀。

5.90.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸于1000mL容量瓶中，用水稀释定容，混匀。

5.105%氨化甲醇溶液：移取5mL氨水于100mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，混匀。

5.11标准品：地美硝唑（CAS:551-92-8，纯度均≥98%）、异丙硝唑（CAS:14885-29-1，纯度

均≥98%）、甲硝唑（CAS:443-48-1，纯度均≥98%）、塞克硝唑（CAS:3366-95-8，纯度均≥98%）、

罗硝唑（CAS:7681-76-7，纯度均≥98%）、奥硝唑（CAS:16773-42-5，纯度均≥98%）、卡硝唑

（CAS:42116-76-7，纯度均≥98%）、替硝唑（CAS:19387-91-8，纯度均≥98%）、4-硝基咪唑

（CAS:3034-38-6，纯度均≥98%）、羟基甲硝唑（CAS:4812-40-2，纯度均≥98%）、2-甲硝咪

唑（CAS:696-23-1，纯度均≥98%）、羟甲基甲硝咪唑（CAS:936-05-0，纯度均≥98%）、氯甲

硝咪唑（CAS:4897-25-0，纯度均≥98%）、苯硝咪唑（CAS:94-52-0，纯度均≥98%）、羟基异

丙硝唑（CAS:35175-14-5，纯度均≥98%）。

5.12硝基咪唑类药物标准储备液(1mg/mL)：准确称取15种硝基咪唑类药物标准品(5.11)各10

mg(精确到0.0001g)分别于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释定容，混匀。贮存于棕色试

剂瓶中，于-18℃以下保存，有效期为6个月。

5.13硝基咪唑类药物混合标准溶液(10ug/mL)准确移取15种硝基咪唑类药物的标准储备液

（5.12）各0.1