基因工程的基本操作步骤示范课

基因工程的基本操作程序专项１基因工程基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因体现载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定1.基因工程的操作环节对的的操作次序是①使目的基因与运载体相结合②将目的基因导入受体细胞③检测目的基因的体现与否符合特定性状规定④提取目的基因A．③②④① B．②④①③C．④①②③ D．③④①②环节一：目的基因的获取目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，尚有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。目的基因的提取办法人工合成基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA：鸟枪法直接分离基因从基因文库中获取基因组文库cDNA文库1.鸟枪法（散弹射击法）

用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，从中找出含有目的基因.用限制酶切断成许多片段1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA(cDNA)双链DNA(即目的基因)反转录合成2.人工合成基因法2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出对应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的构造基因的核苷酸序列，再通过化学办法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列构造基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成上述三种目的基因提取的办法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一种基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，规定的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简朴基因哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。3从基因文库中获取目的基因：基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库:基因文库中包含了一种生物全部的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一种个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其它载体上，再将它们转移到适宜的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到能够涉及某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也合用于线粒体DNA和叶绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的办法，能够筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（或噬菌体）。通过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程的研究都很有用。环节二：基因体现载体的构建1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一种切口，露出黏性末端。2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相似的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一种重组DNA分子（重组质粒）目的基因与运载体的结合过程，事实上是不同来源的基因重组的过程。惯用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。环节三：目的基因导入受体细胞①直接导入法有电击、显微注射、直接吸取、基因枪等办法。（1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（2）显微注射法：运用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。（3）直接吸取法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸取。（4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。②间接导入法惯用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。（1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起体现。质粒普通还含有标记基因，这能够从细胞的表型特性来识别。（2）λ噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA能够作为目的基因的载体。（3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和λ噬菌体的部分次序，很适合用作真核生物基因的载体。1.将目的基因导入植物细胞2.将目的基因导入动物细胞3.将目的基因导入微生物细胞大肠杆菌细胞最惯用的转化办法是:首先用Ca2+解决细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处在一种能吸取周边环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.第二步是将重组体现载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下增进感受态细胞吸取DNA分子,完毕转化过程.第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。1）将细菌用CaCl2解决，以增大细菌细胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。环节四：目的基因的检测与鉴定四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因不能，受体细胞必须体现出特定的性状，才干阐明目的基因完毕了体现。受体细胞摄入DNA分子后就阐明目的基因完毕了体现吗？若不能体现，要对抗虫基因再进行修饰。前三步的解决十分繁锁，为确保目的基因得到有效运用，普通用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，解决的受体细胞中真正摄入了目的基因的极少，必须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中与否有目的基因的体现产物。裁减无体现产物的菌落，保存有体现产物的进一步培养、研究。多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体与否摄入目的基因，摄入的基因与否体现（与否体现出对应的性状）。裁减无变化的个体，保存有对应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，阐明未摄入目的基因或摄入目的基因未体现。如虫吃后中毒死亡，则阐明摄入了抗虫基因并得到体现。1）下列说法对的的是（）A、全部的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须含有的条件之一是：含有多个限制酶切点，方便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后裔体现出来C练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是A、能复制（）B、有多个限制酶切点C、含有标记基因D、它是环状DNAD练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞